专利名称：秦川牛FoxO1基因单核苷酸多态性分子标记的检测方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及以秦川牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记、特别涉及一种秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态性及其检测方法。
背景技术：
在肉牛育种中，人们期望通过对生长性状密切相关，并且与数量性状紧密连锁的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。分子育种，即分子标记辅助选择育种(Molecular Mark-Assist Selection,MAS),该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良，它是利用现代分子生物学和传统遗传育种相结合的方法，进行新品种选育。基因多态性是指不同物种或者同一物种内的不同个体间基因组序列的差异，这些差异是由于染色体中DNA等位基因中核苷酸改变引起，主要是包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心的学者Lander(1996)提出的一类遗传标记系统，就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90%以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于I %的此种变异被称为突变，而只有频率大于I %时才被称为单核苷酸多态性。它的变异形式有:颠换、转换、插入和缺失等，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起。具有转换型的碱基变异的SNPs约占2/3。根据基因组中单核苷酸多态性产生的位置，可分为以下3类:基因编码区单核苷酸多态性(Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周边单核昔酸多态性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因间单核苷酸多态性(Intergenic SNPs, iSNPs)。研究表明，位于编码区内的cSNP比较少，由于它在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此，编码区内的cSNP的研究更受关注。基因编码区内的cSNP又可分为2种:一种是编码区内的同义cSNP (Synonymous cSNP),即SNP所致编码序列的改变并不会影响其所翻译的蛋白质中氨基酸序列的改变；另一种是编码区内的非同义cSNP (Non-SynonymouscSNP)，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变，从而导致蛋白质中氨基酸序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被 简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs:即DNA序列测定方法、聚合酶链反应-单链构象多态(Polymerase ChainReaction-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP)与 DNA 测序结合法、等位特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。本研究检测基因SNPs所使用的限制性片段长度多态性-聚合酶链反应(Restriction Fragment Length Polymorphism-PoIymerase Chain Reaction, RFLP-PCR)方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后设计上下游引物用限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。转录因子是控制基因表达的一类蛋白质分子，通过调节靶基因的表达对机体的发育和代谢等起重要调控作用。叉头转录因子(FoxOI)是FoxO亚家族中发现最早的成员。FoxOl基因在脂肪细胞分化信号通路与转录级联反应中具有重要作用，其与脂肪细胞代谢及成肌细胞分化有很大关系，能促进脂肪细胞的分化、负调控骨骼肌的生成和I型肌纤维基因的表达，且对肝细胞、胰岛β细胞及脂肪细胞中胰岛素作用的发挥起重要作用。为此，FoxOl基因遗传变异或SNP位点在动物生产实践中对肌肉脂肪性状、生长发育性状具有重要的作用。关于动物FoxOl基因遗传变异的研究国内外多见于人、鼠等动物，而少见秦川牛FoxOl基因遗传变异或SNP研究的报道。由于目前中`国秦川牛FoxOl基因遗传变异领域的研究匮乏，使该基因位点的功能研究及该基因遗传变异与经济性状(如:产肉、生长发育等性状)关联的研究成为空白。
发明内容
本发明解决的问题在于提供秦川牛FoxOl基因单核苷酸多态性检测方法及其应用，利用PCR-RFLP方法针对其基因位点上的错义突变可能导致编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，提前淘汰产生错义突变的个体，加快具有优质经济性状黄牛种
群的建立。本发明通过以下技术方案来实现:一种秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态性，其基因单核苷酸多态性包括:秦川牛FoxOl基因第178132位为G或A的单核苷酸多态性。上述秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态性的检测方法为:
以包含FoxOl基因的待测秦)11牛全基因组DNA为模板，以弓丨物对P为引物，PCR扩增秦川牛FoxOl基因；用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛FoxOl基因第178132位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为:上游 引物:5，-GACTCTCCTCCGCACAACGAC-3，2Int；下游引物:5’-GTCCAAGTCACTGGGGAGCTTC-3，22nt。所述的PCR扩增反应程序为:94°C 预变性 5min ;94°C变性 30s，68°C退火 30s，每个循环-1°C，72°C 延伸 30s，18个循环；941:变性308，501:退火30s，72。。延伸30s, 20个循环；72°C延伸IOmin0所述的琼脂糖凝胶电泳为质量浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳。所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果FoxOl基因第178132位碱基多态性为:GG型表现:316bp 和 89bp ；GA 型表现:405bp、316bp 和 89bp ；AA 型表现:405bp。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:本发明利用RFLP-PCR方法对黄牛FoxOl基因第178132位点上的错义突变可能产生编码蛋白构象发生变化的单核苷酸多态性进行检测，当位点由G突变为A时，在转录过程相应位置的蛋白质编码氨基酸发生改变(肽链578位的丙氨酸变苏氨酸，Ala 578Thr)，使具有重要生理功能的叉头转录因子FoxOl基因所编码蛋白的空间二、三级构型发生变化，以至影响蛋白的生物学功能。本发明公开了与秦川牛生长性状相关的功能基因FoxOl的核苷酸多态性，该核苷酸多态性能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。针对上述FoxOl基因的SNP多态性，本发明还公开了其检测方法，通过设计特定的PCR引物扩增片段，能够用RFLP-PCR方法简单、快速、成本低、精确的检测其单核苷酸的多态性。本发明对FoxOl基因的SNP进行了基因分型和基因频率分析，以及与秦川牛生长性状之间进行了关联分析；结果显示FoxOl基因的核苷酸多态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。本发明提供的检测方法为FoxOl基因的SNP与生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于中国秦川牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的秦川牛种群。
图1为秦川牛血样基因组DNA电泳检测图；图2为秦川牛FoxOl基因PCR扩增的405bp片段的电泳图；图3为秦川牛FoxOl基因第3外显子405bp PCR产物的HhaI酶切电泳检测FoxOl基因多态性的电泳结果图；泳道2，4:AA基因型个体(405bp);泳道1:GA基因型个体(405bp，316bp，89bp);泳道3，5:GG 基因型个体(316bp，89bp) ；M =Marker (600bp, 500bp,400bp, 300bp, 200bp, IOObp)另外，由于89bp较小，故在琼脂糖电泳分析中不可见,但405bp和316bp片段能鉴别GA型和GG型；
图4为秦川牛FoxOl基因178132位SNP的不同基因型测序峰图。
具体实施例方式本发明以FoxOl基因保守序列设计引物扩增FoxOl基因第3外显子405bp片段，以秦川牛基因组为模板，进行PCR扩增，扩增产物经测序后寻找该扩增片段的单核苷酸多态；针对发现的单核苷酸多态进行性状关联性分析，并提供其检测方法，使得FoxOl基因的核苷酸多态性成为一种能够快速、方便检测的分子遗传标记，为加快建立具有优质经济性状的秦川牛种群提供依据。a、秦川牛FoxOl基因多态性的检测1、秦川牛血样的采集及处理取秦川牛血样10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80°C保存备用。本发明采用秦川牛品种，具体如表I所示。表I秦川牛样品来源表
权利要求
1.一种秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态性，其特征在于，其基因单核苷酸多态性包括: 秦川牛FoxOl基因第178132位为G或A的单核苷酸多态性。
2.一种秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 以包含FoxOl基因的待测秦)11牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增秦川牛FoxOl基因；用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛FoxOl基因第178132位的单核苷酸多态性；所述的引物对P为: 上游引物:5 ’ -GACTCTCCTCCGCACAACGAC-3， 2 Int ; 下游引物:5’ -GTCCAAGTCACTGGGGAGCTTC-3’ 22nt。
3.如权利要求2所述的秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增反应程序为: 94°C预变性5min ;94°C变性30s，68。。退火30s，每个循环_1°C，72°C延伸30s, 18个循环；94°C变性 30s, 50°C退火 30s, 72°C延伸 30s, 20 个循环；72°C延伸 IOmin0
4.如权利要求2所述的秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于，所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为3%。
5.如权利要求2所述的秦川牛FoxOl基因的单核苷酸多态 性的检测方法，其特征在于，所述的根据琼脂糖凝胶电泳结果FoxOl基因第178132位碱基多态性为:GG型表现:316bp和 89bp ；GA 型表现:405bp、316bp 和 89bp ；AA 型表现:405bp。
全文摘要
本发明公开了一种黄牛FoxO1基因的单核苷酸多态性及其检测方法，其基因单核苷酸多态性包括以包含FoxO1基因的待测秦川牛全基因组DNA为模板，以引物对P为引物，PCR扩增秦川牛FoxO1基因；用限制性内切酶HhaI消化PCR扩增产物之后，再对酶切后的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据电泳结果鉴定秦川牛FoxO1基因第178132位的碱基多态性。由于FoxO1基因对动物肌肉脂肪性状、生长发育性状具有重要作用。所以，该方法是一种在DNA水平上筛查和检测与秦川牛生长性状密切相关的分子遗传标记，以用于秦川牛的辅助选择和分子育种，加快秦川牛良种繁育速度。
文档编号C12Q1/68GK103233001SQ20121021046
公开日2013年8月7日 申请日期2012年6月25日 优先权日2012年6月25日
发明者陈宏 , 孙雨佳, 郭文娇, 潘虹, 薛璟, 蓝贤勇, 雷初朝 申请人:西北农林科技大学