用于改善植物的组合物和方法

专利名称：用于改善植物的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于制备具有改善的生物量和/或种子产量和/或应激耐受性的植物 的组合物和方法。
背景技术：
随着世界人口的增长，农业研究的主要目标是改善农作物和饲料植物品种的生物
量产量和种子产量。直到现在这样的改善依赖于为了所需特性选择性地培育植物。但是对于许多植 物，后代中产生的杂种遗传互补体不产生与其亲代相同的所需性状，因此限制了选择性培 育方法的效果。现在分子生物学的进步使得遗传操作植物和动物的种质成为可能。植物的遗传工 程化包括分离和操作遗传材料，随后将这样的材料引入植物中。该技术已经开发了能够表 达药物和其它化学品的植物、具有增加害虫抗性、增加应激耐受性的植物和表达其它有益 性状的植物。本领域中已知某些生长因子可以应用于增加的植物大小，这样的生长因子的应用 是昂贵和耗时的。因此，存在相对于植物种植的对应物而言具有增加生物量的植物的需求。植物农作物植物谷粒产量的改善可以通过研发相对于同等野生型植物产生更多 种子或谷粒的植物而实现。因此，存在相对于植物正常种植对应物而言具有增加种子产量的植物的需求。环境无生命应激，包括干旱应激、寒冷应激、冰冻应激、热应激和盐分应激是限制 植物生长和繁殖力的主要因素。由这样的应激造成的主要农作物包括玉米、小麦和稻米的 生物量的农作物损失和减少代表了重要的经济问题，还导致几个不发达国家的食品短缺。研发应激耐受植物具有减少或解决至少一些这些问题的潜力。使用传统植物培育 策略以产生显示对这些类型应激耐受的植物新系是缓慢的。缺少足够的种质来源和远缘植 物物种之间的不相容性代表了常规培育中的重要问题。另外，引起对这样应激耐受的细胞 过程是复杂的且包括多个细胞适应机制和许多代谢途径。这限制了传统培育和遗传工程方 法研发应激耐受植物的成功。鉴别涉及控制引起应激耐受的复杂过程的基因和蛋白质将是 有益的。涉及控制应激耐受的基因表达调节子如转录因子在植物遗传工程中特别有用，因 为单个基因可以控制基因的整个级联，引起耐受表型。另外，有时在上面提到的不同类型应 激耐受反应的许多方面中有共同性。例如，增加对寒冷或盐分耐受的基因还可以改善干旱 应激耐受性。这已经在转录因子At CBF/DREB 1 (Kasuga等人，1999 Nature Biotech 17: 287-91)和液泡焦磷酸酶AVPl (feixiola等人，2001 PNAS 98:11444-19)的情况中得到证 实。虽然已经鉴别了一些潜在有用的基因，给予对应激耐受的植物基因的鉴别和克隆 仍然是片段化的和不完整的。虽然假定应激诱导的蛋白质在应激耐受中有作用，仍然缺乏证据，且许多这样的应激反应性基因的功能是未知的。鉴别应激敏感性植物物种中具有给予应激耐受能力的基因将是有益的。应激耐受 农作物的研发将提供许多优势如增加生物量和产生可以在先前不适的环境条件中种植的 植物。因此，存在用于产生相对于种植对应物而言具有改善应激耐受的植物的组合物和方 法的需求。本发明的目标是提供为了研发具有至少一种下列性状的植物品种的改善的组合 物和/或方法i)改变的生物量，ii)改变的种子产量，和iii)改变的对至少一种下列应激的耐受性干旱、寒冷、冰冻、热和盐分，或至少 给公众提供有用的选择。

发明内容
编码多肽的多核苷酸在一个方面，本发明提供了编码具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其变体的分离的 多核苷酸，其中变体是能够调节植物中至少一种下列性状的多肽i)生物量，ii)种子产量，和iii)对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性。优选多肽能够调节生物量和种子产量。优选多肽能够调节生物量和对至少一种所述环境应激的耐受性。优选多肽能够调节生物量、种子产量和对至少一种所述环境应激的耐受性。在另一个方面，本发明提供了编码具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其变体的分离 的多核苷酸，其中变体是能够调节植物中生物量的多肽。在另一个方面，本发明提供了编码具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其变体的分离 的多核苷酸，其中变体是能够调节植物中种植产量的多肽。在另一个方面，本发明提供了编码具有序列SEQ ID NO 1的多肽或其变体的分离 的多核苷酸，其中变体是能够调节植物中对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环 境应激的耐受性的多肽。优选多肽能够调节至少两种，优选至少三种，更优选至少四种和最优选所有五种 所述的环境应激。在上面三个方面每个的一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码具有与序列 SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。在另一个具体实施方案中，多肽含有A20型锌指结构域和ANl型锌指结构域。优选A20型结构域在多肽的N末端一半中。优选ANl型结构域在多肽的C末端一半中。优选A20型结构域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意
氨基酸。优选Am 型结构域具有通式C-X2-C-X (9-12)-C-X (1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中X可以是任意氨基酸。优选A20结构域具有与序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。优选A20型结构域含有序列SEQ ID NO :17。优选多肽含有序列SEQ ID NO :17。优选A20型结构域由序列SEQ ID NO 16组成。优选ANl型结构域具有与序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。优选ANl型结构域含有序列SEQ ID NO :19。优选多肽含有序列SEQ ID N0:19。优选Am型结构域由序列SEQ ID NO 18组成。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码具有序列SEQ ID NO 1的多肽。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸含有具有与SEQ ID NO 7的编码序列 至少70%同一性的序列。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸含有SEQ ID NO 7的编码序列。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸含有能够在严谨条件下与SEQ ID NO 7的编码序列杂交的序列。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸含有SEQ ID NO 7的编码序列。多核苷酸在另一个方面本发明提供了含有序列SEQ ID NO 7或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体编码能够调节植物中至少一种以下性状的多肽i)生物量，ii)种子产量，和iii)对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性。优选肽能够调节生物量和种子产量。优选肽能够调节生物量和对至少一种所述环境应激的耐受性。优选肽能够调节生物量、种子产量和对至少一种所述环境应激的耐受性。在另一个方面，本发明提供了含有序列SEQ ID NO :7或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体编码能够调节植物中生物量的多肽。在另一个方面本发明提供了含有序列SEQ ID NO 7或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体编码能够调节植物中种子产量的多肽。在另一个方面本发明提供了含有序列SEQ ID NO 7或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体编码能够调节植物中对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分环境应激的耐受 性的多肽。优选多肽能够调节至少两种，通常至少三种，更优选至少四种和最优选所有五种 所述的环境应激。在上面三个方面每个的一个具体实施方案中，分离的多核苷酸含有具有与SEQ ID NO 7的编码序列至少70%同一性的序列。在另一个具体实施方案中，多肽含有A20型锌指结构域和ANl型锌指结构域。优选A20型结构域在多肽的N末端一半中。优选ANl型结构域在多肽的C末端一半中。
优选A20型结构域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意
氨基酸。优选Am 型结构域具有通式C-X2-C-X(9-12)-C-X(l-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中X可以是任意氨基酸。优选A20型结构域具有与序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。优选A20型结构体含有序列SEQ ID N0:17。优选多肽含有序列SEQ ID NO :17。优选A20型结构域由序列SEQ ID NO 16组成。优选ANl型结构域具有与序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。优选ANl型结构域含有序列SEQ ID NO :19。优选多肽含有序列SEQ ID NO :19。优选Am型结构域由序列SEQ ID NO 18组成。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸含有能够在严谨条件下与SEQ ID NO 7的编码序列杂交的序列。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸含有SEQ ID NO 7的编码序列。多月太在另一个方面本发明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体是能够调节植物中至少一种以下性状的多肽i)生物量，ii)种子产量，和iii)对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性。优选肽能够调节生物量和种子产量。优选肽能够调节生物量和对至少一种所述环境应激的耐受性。优选肽能够调节生物量、种子产量和对至少一种所述环境应激的耐受性。在另一个方面本发明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体是能够调节植物中生物量的多肽。在另一个方面本发明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体是能够调节植物中种子产量的多肽。在另一个方面本发明提供了具有序列SEQ ID NO 1或其变体的分离的多核苷酸， 其中变体是能够调节植物中对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分环境应激耐受性的 多肽。优选多肽能够调节至少两种、通常至少三种、更优选至少四种和最优选所有五种 所述的环境应激。在上面三个方面每个的一个具体实施方案中，分离的多肽具有与序列SEQ ID NO 1至少70%的同一性。在另一个具体方案中，多肽含有A20型锌指结构域和ANl型锌指结构域。优选A20型结构域在多肽的N末端一半中。优选ANl型结构域在多肽的C末端一半中。优选A20型结构域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。优选Am 型结构域具有通式 C-X2-C-X (9-12) -C-X (1-2) -C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C， 其中X可以是任意氨基酸。优选A20型结构域具有与序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。优选A20型结构域含有序列SEQ ID N0:17。优选多肽含有序列SEQ ID NO :17。优选A20型结构域由序列SEQ ID NO 16组成。优选ANl型结构域具有与序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。优选ANl型结构域含有序列SEQ ID N0:19。优选多肽含有序列SEQ ID N0:19。优选ANl型结构域由序列SEQ ID NO 18组成。在另一个具体实施方案中，分离的多肽含有序列SEQ ID NO :1。在另一个方面本发明提供了含有本发明的多核苷酸的至少50个核苷酸长度片段 的分离的多核苷酸。在一个具体实施方案中环境应激是干旱。在另一个具体实施方案中环境应激是寒冷。在另一个具体实施方案中环境应激是冰冻。在另一个具体实施方案中环境应激是热。在另一个具体实施方案中环境应激是盐分。在另一个方面本发明提供了含有本发明的多核苷酸的遗传构建体。在一个具体实施方案中遗传构建体是表达构建体。在另一个方面本发明提供了含有本发明的多核苷酸、遗传构建体或表达构建体的 载体。在另一个方面本发明提供了含有本发明的多核苷酸、遗传构建体或表达构建体的 宿主细胞。在另一个方面本发明提供了经遗传修饰而表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。在另一个方面本发明提供了含有本发明的遗传构建体或表达构建体的植物细胞。在另一个方面本发明提供了经遗传修饰而表达本发明的多核苷酸的植物细胞。在另一个方面本发明提供了含有本发明的植物细胞的植物。使用多核苷酸的方法在另一个方面本发明提供了制备具有至少一种下列性状的植物的方法i)改变的生物量，ii)改变的种子产量，和iii)改变的对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性，所述方法包括用下列成分转化植物细胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其变体，其中变体编码能够改变 生物量和/或对植物中至少一种所述环境应激的耐受性的多肽。b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。
在另一个方面本发明提供了制备具有改变的生物量的植物的方法，所述方法包括用下列成分转化植物细胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其变体，其中变体编码能够改变 植物中生物量的多肽。b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。在另一个方面本发明提供了制备具有改变的种子产量的植物的方法，所述方法包括用下列成分转化植物细胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其变体，其中变体编码能够改变 植物中种子产量的多肽；b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。在另一个方面本发明提供了制备具有改变耐受性的植物的方法，所述植物具有对 至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性，所述方法包括用以下成分 转化植物细胞或植物a)含有SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸或其变体，其中变体编码能够增加 对植物中至少一种所述环境应激的耐受性的多肽；b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。改变可以是增加或减少。优选改变是增加。优选多肽能够调节至少两种，通常至少三种，更优选至少四种和最优选所有五种 所述的环境应激。在三个方面中每个的一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码具有与序列SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。在另一个具体实施方案中，多肽含有A20型锌指结构域和ANl型锌指结构域。优选A20型结构域在多肽的N末端一半中。优选ANl型结构域在多肽的C末端一半中。优选A20型结构域具有通式X3-C-XQ-4)-C-Xll-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。优选Am 型结构域具有通式 C-X2-C-X (9-12) -C-X (1-2) -C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C， 其中X可以是任意氨基酸。优选A20型结构域具有与序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。优选A20型结构域含有序列SEQ ID NO :17。优选多肽含有序列SEQ ID N0:17。优选A20型结构域由序列SEQ ID NO 16组成。优选ANl型结构域具有与序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。优选ANl型结构域含有序列SEQ ID NO :19。优选多肽含有序列SEQ ID NO :19。
优选ANl型结构域由序列SEQ ID NO 18组成。在另一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码具有序列SEQ ID NO 1的多肽。优选植物用含有所述多核苷酸的遗传构建体或载体转化。在一个具体实施方案中，环境应激是干旱。在另一个具体实施方案中，环境应激是寒冷。在另一个具体实施方案中，环境应激是冰冻。在另一个具体实施方案中，环境应激是热。在另一个具体实施方案中，环境应激是盐分。在另一个具体实施方案中，变体含有SEQ ID NO 8至12中任一个的序列。在另一个具体实施方案中，a)中多核苷酸含有序列SEQ ID NO :1。方法-使用编码多肽的多核苷酸在另一个方面本发明提供了制备具有至少一种下列性状的植物的方法i)改变的生物量，ii)改变的种子产量，和iii)改变的对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分环境应激的耐受性，所述方法包括用下列成分转化植物a)编码具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体 能够改变生物量和/或对植物中至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐 受性。b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。在另一个方面本发明提供了制备具有改变的生物量的植物的方法，所述方法包括用下列成分转化植物a)编码具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体 能够改变植物中的生物量；b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。在另一个方面本发明提供了制备具有改变的种子产量的植物的方法，所述方法包括用下列成分转化植物a)编码具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体 能够改变植物中的种子产量；b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。在另一个方面本发明提供了制备具有至少一种改变的耐受性的植物的方法，所述 耐受性是对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性，所述方法包括用下列成分转化植物a)编码具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列的多肽或多肽变体的多核苷酸，其中变体 能够改变植物中对至少一种所述环境应激的耐受性；b)含有至少15个核苷酸长度的a)中多核苷酸的片段的多核苷酸；或
c)含有a)或b)中多核苷酸的互补物的多核苷酸。在上面三个方面中每个的一个具体实施方案中，分离的多核苷酸编码具有与序列 SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。在另一个具体实施方案中，多肽含有A20型锌指结构域和ANl型锌指结构域。优选A20型结构域在多肽的N末端一半中。优选ANl型结构域在多肽的C末端一半中。优选A20型结构域具有通式X3-C-X (2-4) -C-Xl 1-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。优选Am 型结构域具有通式 C-X2-C-X (9-12) -C-X (1-2) -C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C， 其中X可以是任意氨基酸。优选A20型结构域具有与序列SEQ ID NO 16至少70%的同一性。优选A20型结构域含有序列SEQ ID NO :17。优选多肽含有序列SEQ ID NO :17。优选A20型结构域由序列SEQ ID NO 16组成。优选ANl型结构域具有与序列SEQ ID NO 18至少70%的同一性。优选ANl型结构域含有序列SEQ ID NO :19。优选多肽含有序列SEQ ID NO :19。优选Am型结构域由序列SEQ ID NO 18组成。优选多肽能够调节至少两种，通常至少三种，更优选至少四种和最优选所有五种 所述的环境应激。在另一个具体实施方案中，多肽含有序列SEQ ID NO :1。优选植物用含有所述多核苷酸的遗传构建体或载体转化。在一个具体实施方案中，环境应激是干旱。在一个具体实施方案中，环境应激是寒冷。在一个具体实施方案中，环境应激是冰冻。在一个具体实施方案中，环境应激是热。在一个具体实施方案中，环境应激是盐分。在更优选的具体实施方案中，a)中多核苷酸编码具有SEQ ID NO=I的氨基酸序列 的多肽。方法-选择在另一个方面本发明提供了用于选择具有至少一种下列性状的植物的方法相对于合适的对照植物，i)改变的生物量，ii)改变的种子产量，和iii)改变的对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性，所述方法包括测试植物改变的本发明多核苷酸或多肽的表达。在另一个方面本发明提供了用于选择相对于合适的对照植物具有改变的生物量 的植物的方法，所述方法包括测试植物改变的本发明多核苷酸或多肽的表达。在另一个方面本发明提供了用于选择相对于合适的对照植物具有改变的种子产量的植物，所述方法包括测试植物改变的本发明多核苷酸或多肽的表达。在另一个方面本发明提供了用于选择相对于合适的对照植物具有增加的对至少 一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分环境应激的耐受性的植物的方法，所述方法包括测试 植物改变的本发明多核苷酸或多肽的表达。植物在另一个方面本发明提供了通过本发明的方法制备的植物细胞或植物。在另一个方面本发明提供了通过本发明的方法选择的植物群组或群体。本发明的多核苷酸的来源本发明的多核苷酸和多核苷酸变体可以源自任何物种和/或可以合成或重组制备。在一个具体实施方案中，多核苷酸或变体源自植物物种。在另一个具体实施方案中多核苷酸或变体源自裸子植物物种。在另一个具体实施方案中多核苷酸或变体源自被子植物物种。在另一个具体实施方案中多核苷酸或变体源自双子叶植物物种。在另一个具体实施方案中多核苷酸或变体源自单子叶植物物种。本发明的植物细胞和植物的来源本发明的植物细胞和植物可以源自任何物种。在一个具体实施方案中植物细胞或植物源自裸子植物物种。在另一个具体实施方案中植物细胞或植物源自被子植物物种。在另一个具体实施方案中植物细胞或植物源自双子叶植物物种。在另一个具体实施方案中植物细胞或植物源自单子叶植物物种。优选的双子叶植物属包括桃属(Amygdalus)、檟如树属(Anacardium)、银莲花属 (Anemone)、花生属(Arachis)、芸苔属(Brassica)、木豆属(Cajanus)、大麻属(Cannabis)、 红花属(Carthamus)、山核桃属(Carya)、吉贝属(Ceiba)、鹰嘴豆属(Cicer)、春美草属 (Claytonia)、芫荽属(Coriandrum)、小冠花属(Coronilla)、紫堇属(Corydalis)、猪屎 豆属(Crotalaria)、樱草属(Cyclamen)、石竹花属(Dentaria)、荷包牡丹属(Dicentra)、 扁豆属(Dolichos)、英葵属(Eranthis)、大豆属(Glycine)、棉花属(Gossypium)、向 日葵属(Helianthus)、香豌豆属(Lathyrus)、兵豆属(Lens)、胡枝子属(Lespedeza)、 亚麻属(Linum)、莲属(Lotus)、羽扇豆属(Lupinus)、澳洲坚果属(Macadamia)、苜蓿 属(Medicago)、草木犀属(Melilotus)、黎豆属(Mucuna)、木犀榄属(Olea)、驴食草属 (Onobrychis)、料豆属(Ornithopus)、酢浆草属(Oxalis)、罂粟属(Papaver)、菜豆属 (Phaseolus)、刺葵属(Phoenix)、黄连木属(Pistacia)、豌豆属(Pisum)、樱桃属(Prunus)、 葛属(Pueraria)、茶薦子属(Ribes)、蓖麻属(Ricinus)、胡麻属(Sesamum)、唐松草属 (Thalictrum)、可可属(Theobroma)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、蚕豆 属(Vicia)和豇豆属(Vigna)。优选的双子叶植物物种包括扁桃(Amygdalus communis)、腰果(Anacardium occidentale)、美洲银莲花(Anemone americana)、西方银莲花(Anemone occidentalis)、 花生(Arachis hypogaea)、花生(Arachis hypogea)、油菜(Brassica napus Rape)、 H (Brassicanigra)、白胃(Brassica campestris)、 7^ (Cajanuscajan)、木曰(Cajanus indicus)、；^ 0 (Cannabis sativa)、^1 (Carthamus tinctorius)、_ 15 ill 核桃(Carya illinoinensis)、吉贝(Ceiba pentandra)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、 (Claytonia exigua) Λ M ill # ^ A (Claytonia megarhiza) λ ^ ^ (Cor i an drum sativum)、绣球小冠花(Coronilla varia)、紫堇(Corydalis flavula)、常绿紫堇 (Corydalis sempervirens)、菽麻(Crotalaria juncea)、小花仙客来(Cyclamen coum)、 裂叶石芥花(Dentaria laciniata)、縫毛荷包牡丹(Dicentra eximia)、美丽荷包牡 丹(Dicentra formosa)、扁豆(Dolichos lablab) Λ ^iM (Eranlhis hyemalis)、亚洲棉 (Gossypium arboreum)、中棉(Gossypium nanking)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草 棉(Gossypium herbaceum)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、野大豆 (Glycine ussuriensis)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、向日葵(Helianthus annus)、窄 叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)、黄羽扇豆(Lupinus luteus)、珍珠羽扇豆(Lupinus mutabilis)、铁扫帚(Lespedeza sericea)、鸡目艮草(Lespedeza striata)、大百脉根 (Lotus uliginosus)、山黧豆(Lathyrus sativus)、兵豆(Lens culinaris)、长萼約目艮草 (Lespedeza stipulacea)、亚麻(Linum usitatissimum)、百脉根(Lotus corniculatus)、 白习习扇豆(Lupinus albus)、木本苜猜(Medicago arborea)、黄花苜猜(Medicago falcate)、金花菜(Medicago hispida)、黄香草木犀(Medicago officinalis)、紫花苜蓿 (Medicago sativa (alfalfa))、硬果苜蓿(Medicago tribuloides)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、褐斑苜蓿(Medicago arabica)、白花草木樨(Melilotus albus)、剌毛黎豆 (Mucuna pruriens)、油(Oleaeuropaea)、红豆胃(Onobrychis viciifolia)、|居^■胃 (Ornithopus sativus)酉乍醫草(Oxalis tuberosa)、參录豆(Phaseolus aureus)、红卩十 李(Prunus cerasifera)、欧效、1、|酸樓^IK (Prunus cerasus)、荷包豆(Phaseolus coccineus)、 欧洲李(Prunusdomestica) ^iSS (Phaseolus lunatus)、马哈利樱桃(Prunu. maheleb)、 參录豆(Phaseolusmungo)、(Prunus. persica)、樓 ^IK (Prunus. pseudocerasus)、菜豆 (Phaseolusvulgaris)、§|^ (Papaver somniferum)、宽卩十胃豆(Phaseolus acutifolius)、 海專(Phoenix dactylifera)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆(Pisum sativum)、舌甘扁 (Prunus amygdalus)、杏(Prunus armeniaca)、里予葛(Pueraria thunbergiana) λ M^fJl 子(Ribes nigrum)、红荼薦子(Ribes rubrum)、鹅莓(Ribes grossularia)、蓖麻(Ricinus communis)、芝麻(Sesamum indicum)、异株唐松草(Thalictrum dioicum)、黄唐松草 (Thalictrum flavum)、忧伤银莲(Thalictrum thalictroides)、可可(Theobroma cacao)、 狭叶三叶草(Trifolium augustifolium)、分散三叶草(Trifolium diffusum)、杂种车轴 草(Trifolium hybridum)、降车轴草(Trifolium incarnatum)、球花车轴草(Trifolium ingrescens)、红车轴草(Trifolium pratense)、白车轴草(Trifolium repens)、波斯 三叶草(Trifolium resupinatum)、地三叶草(Trifolium subterraneum)、士矣及车轴草 (Trifolium alexandrinum)、古月戸巴(Trigonella foenumgraecum)、窄叶野豌豆(Vicia angustifolia)、深紫花野豌豆(Vicia atropurpurea)、距花豌豆(Vicia calcarata)、 广布里予豌豆(Vicia dasycarpa)、苦里予豌豆(Vicia ervilia)、红莓苔子(Vaccinium oxycoccos)、褐毛野豌豆(Vicia pannonica)、长豆工豆(Vigna sesquipedalis)、豆工豆(Vigna sinensis)、长柔毛里予豌豆(Vicia villosa)、蚕豆(Vicia faba)、里予碗豆(Vicia sative) 禾口赤豆(Vigna angular is)。
优选的单子叶植物属包括冰草属(Agropyron)、葱属(Allium)、看麦娘 属(Alopecurus)、须芒草属(Andropogon)、燕麦草属(Arrhenatherum)、天门冬属 (Asparagus)、燕麦属(Avena)、簕竹属(Bambusa)、罗马风信子属(Bellavalia)、风铃百合 属(Brimeura)卜若地属(Brodiaea)、水仙属(Bulbocodium)、孑L颖草属(Bothrichloa)、格 兰马草属(Bouteloua)、雀麦属(Bromus)、沙茅属(Calamovilfa)、卡马夏属(Camassia)、蒺 藜草属(Cenchrus)、雪光花属(Chionodoxa)、虎尾草属(Chloris)、秋水仙属(Colchicum)、 番红花属(Crocus)、香茅属(Cymbopogon)、狗牙根属(Cynodon)、杓兰属(Cypripedium)、鸭 茅属(Dactylis)、毒鼠子属(Dichmthium)、马唐属(Digitaria)、油棕属(Elaeis)、糝属 (Eleusine)、_眉草属(Eragrostis)、独尾草属(Eremurus)、赤莲属(Erythronium)、养麦 属(Fagopyrum)、羊茅属(Festuca)、贝母属(Fritillaria)、雪花莲属(Galmthus)、向日葵 属(Helianthus)、大麦属(Hordeum)、风信子属(Hyacinthus)、蓝铃花属(Hyacinthoides)、 紫星花属(Ipheion)、鸢尾属(Iris)、雪片莲属(Leucojum)、蛇鞭菊属(Liatris)、黑麦草 属(Lolium)、石蒜属(Lycoris)、芒属(Miscanthis)、芒属(Miscanthus χ giganteus)、葡 萄风信子属(Muscari)、虎眼万年青属(Ornithogalum)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、雀 稗属O^aspalum)、狼尾草属(Pennisetum)、藹草属(Wialaris)、梯牧草属(Phleum)、早熟 禾属(Poa)、蓝条海葱属O^uschkinia)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属Gecale)、狗尾草属 (Setaria)、印第安草属(Sorghastrum)、高粱属(Sorghum)、偃麦草属(Thinopyrum)、小麦 属(Triticum)、香荚兰属(Vanilla)、小黑麦属(X Triticosecale Triticale)和玉蜀黍属 (Zea) ο优选的单子叶植物物种包括冰草(Agropyron cristatum)、沙生冰草 (Agropyron desertorum)、长穗偃麦草(Agropyron elongatum)、中间偃麦草(Agropyron intermedium)、蓝莲冰草(Agropyron smithii)、丛生小麦草(Agropyron spicatum)、细 莲冰草(Agropyron trachycaulum)、毛冰草(Agropyron trichophorum)、古月葱(Allium ascalonicum)、洋葱(Allium cepa)、萬头(Allium chinense)、韭葱(Allium porrum)、北 葱(Allium schoenoprasum)、大葱(Allium f istulosum)、大蒜(Allium sativum)、大看 麦娘(Alopecurus pratensis)、须芒草(Andropogon gerardi)、大须芒草(Andropogon Gerardii)、小须芒草(Andropogon scoparious)、燕麦草(Arrhenatherum elatius)、 石习桕(Asparagus officinalis)、裸燕麦(Avena nuda)、燕麦(Avena sativa)、大 佛肚竹(Bambusa vulgaris)、(Bellevalia trifoliate)、白花风铃百合(Brimeura amethystina)、卜胃 iik (Brodiaea californica) λ ^ ^ ^ Mfe (Brodiaea coronaria)、 优雅卜若地(Brodiaea elegans)、多色水仙(Bulbocodium versicolor)、藤茎须芒草 (Bothrichloa barbinodis)Λ 白羊草(Bothrichloa ischaemum)、针草(Bothrichloa saccharoides)、垂穗草(Bouteloua curipendula)、漂格兰马草(Bouteloua eriopoda)、 格兰马草(Bouteloua gracilis)、直立雀麦(Bromus erectus)、无芒雀麦(Bromus inermis)、草地雀麦(Bromus riparius)、沙拂子茅(Calamovilfa longifilia)、大西洋 卡马夏(Camassia scilloides)、纤毛漠藜草(Cenchrus ciliaris)、粉光花(Chionodoxa forbesii)^ # rill ^ M ^ (Chloris gayana)(Colchicum autumnal e) Λ (Crocus sativus)、香茅(Cymbopogon nardus)、狗牙丰艮(Cynodon dactylon)、粉红t勺兰 (Cypripedium acaule)、甲鸟茅(Dactylis glomerata)、双花草(Dichanthium annulatum)、毛梗双花草(Dichanthium aristatum)、昆士兰蓝草(Dichanthium sericeum)、俯仰马唐 (Digitaria decumbens)、南非马唐(Digitaria smutsii)、油掠(Elaeis guineensis)、美 洲油棕榈(Elaeis oleifera)、禾參子(Eleusine coracan)、窄颖新麦草(Elymus angustus)、 俄罗斯新麦草(Elymus junceus)、弯叶画眉草(Eragrostis curvula)、埃塞俄比亚画 眉草(Eragrostis tef)、巨独尾草(Eremurus robustus)、秀 HI3 猪牙花(Erythronium elegans)、圣赫勒那猪牙花(Erythronium helenae)、养麦(Fagopyrum esculentum)、 苦养麦(Fagopyrum tataricum)、苹状羊茅(Festuca arundinacea)、羊茅(Festuca ovina)、草甸羊茅(Festuca pratensis)、紫羊茅(Festuca rubra)、川贝母(Fritillaria cirrhosa)、雪花莲(Galanthus nivalis)、向日葵(Helianthus annuus sunflower)、二列 大麦(Hordeum distichum)、大麦(Hordeum vulgare)、风信子(Hyacinthus orientalis)、 西班牙蓝铃花(Hyacinthoides hispanica)、蓝铃花(Hyacinthoides non-scripta)、白 花韭(Ipheion sessile)、高原鸾尾(Iris collettii)、丹佛鸾尾(Iris danfordiae)、 N^M (Iris reticulate) λ S W >t ^ (Leucojum aestivum) λ tt ^ I ^r (Liatris cylindracea)、幽雅蛇鞭菊(Liatris elegans)、廣香百合(LiIium longiflorum)、多 花漂麦草(Lolium multiflorum)、多年生漂麦草(Lolium perenne)、石蒜(Lycoris radiata)、中国银色草(Miscanthis sinensis)、奇岗(Miscanthus χ giganteus)、葡萄 风信子(Muscari armeniacum)、大果串铃花(Muscari macrocarpum)、洋水仙(Narcissus pseudonarcissus)、虎目艮万年青(Ornithogalum montanum)、水禾 § (Oryza sativa)、 禾术米(Panicum italicium)、大黍(Panicum maximum)、稷(Panicum miliaceum)Λ 紫 黍草(Panicum purpurascens)、柳枝稷(Panicum virgatum)、毛花雀禾卑(Paspalum dilatatum)Λ 百喜草(Paspalum notatum)、狼尾草(Pennisetum clandestinum)、珍 珠狼尾草(Pennisetum glaucum)、象草(Pennisetum purpureum)、御谷(Pennisetum spicatum)、|H (Phalaris arundinacea)(PhIeum bertolinii)(PhIeum
pratense)、羊肉早熟禾(Poa fendleriana)、草地早熟禾(Poa pratensis)、林地早熟禾 (Poa nemoralis)、蓝条海葱(Puschkinia scilloides)、甘蔴(Saccharum officinarum)、 大莲野生庶(Saccharum robustum)、竹庶(Saccharum sinense)、害！]手密(Saccharum spontaneum)、 ^MItiS (Scilla autumnalis) λ ^MItiS (Scilla peruviana) Λ 麦(Secale cereale)、小米(Setaria italica)、非洲狗尾草(Setaria sphacelata)、￡口 第安草(Sorghastrum nutans)、高梁(Sorghum bicolor)、舌甘高梁(Sorghum dochna)、 ifxMMi (Sorghum halepense)、苏丹草(Sorghum sudanense)、长Hf匿麦草(Thinopyrum ponticum)、白花延龄草(Trillium grandiflorum)、小麦(Triticum aestivum)、二粒小麦 (Triticum dicoccum)、硬粒小麦(Triticum durum)、一粒小麦(Triticum monococcum)、 巴塔林郁金香(Tulipa batalinii)、郁金香(Tulipa clusima)、毛蕊郁金香(Tulipa dasystemon)、郁金香(Tulipa gesneriana)、格里郁金香(Tulipa greigii)、水百合郁 (Tulipa kaufmanniana) λ^ ^^ (Tulipa sylvestris)、±胃胃有(Tulipa turkestanica)、香荚兰(Vanilla fragrans)、小漂麦(X Triticosecale)禾口玉米(Zea mays). 其它优选的植物来自下列属但不限于下列属的饲料植物物种黑麦草 属(Lolium)、羊茅属O^estuca)、鸭茅属(Dactylis)、雀麦属(Bromus)、偃麦草属(Thinopyrum)、三叶草属(Trifolium)、苜蓿属(Medicago)、梯牧草属(Pheleum)、薦草属 (Phalaris)、绒毛草属(Holcus)、莲属(Lotus)、车前属(Plantago)和菊苣属(Cichorium)。特别优选的属是黑麦草属或三叶草属。特别优选的是多年生黑麦草和白车轴草物 种。最优选的是多年生黑麦草物种。术语“植物”预期包括整个植物、植物的任何部分、植物的繁殖体和后代。术语“繁殖体”意思是可以用于再生或繁殖(有性或无性)的植物任何部分，包括 种子和插条。本发明的植物可以生长和自交或与不同的植物品系杂交，可以鉴别具有所需表型 特征的所得杂种。可以生长两代或两代以上从而保证所述表型特征稳定地保持和遗传。从 这样的标准培养方法获得的植物也形成本发明的一个方面。优选植物、植物部分、植物繁殖体或植物后代含有转化进入亲代植物的多核苷酸。 优选植物、植物部分、植物繁殖体或植物后代表达转化进入亲代植物的多核苷酸。


图1显示用于植物转化的载体C0RF136的图，其含有与组成性双CaMV35S启动子 (D35S P)可操作地连接的0RF136。图2显示用于植物转化的载体D0RF136的图，其含有与黑麦草脱水素样启动子可 操作地连接的0RF136。图3显示了展示在图1中的CORF载体的序列。0RF136编码序列以黑体显示。双 CaMV35S启动子以斜体显示。UTR(非翻译区)序列用下划线显示。图4显示了展示在图2中的D0RF136载体的序列。0RF136编码序列以黑体显示。 脱水素样启动子以斜体显示。UTR(非翻译区)序列用下划线显示。图5显示了 0RF136多肽和其变体的比对。完全保守残基用星号突出显示。还显示 的是 0RF136 中 A20 型锌指基序 ITLCANRCGFPGNPATQNLCQNCFL(SEQ ID NO :16)的位置。还 显示的是0RF136 中 Ml 型锌指基序CSSCWKRVGLTGFRCRCGELFCGAHRYSDRHGC(SEQ ID NO :18) 的位置。还突出显示的是在所有序列中完全保守的A20型基序内的基序(CGFPGNPAT-SEQ ID NO 17)。还突出显示的是在所有序列中完全保守的ANl型基序内的基序(RVGLTGFRCRC-SEQ ID NO 19)。图6显示了图5中比对的蛋白质序列的系统发生图。图7显示了应用干旱应激前转基因和非转基因植物的情况。图8显示了在10天干旱应激和4天恢复的末尾未应激植物(顶部左背景)和应 激植物(前景)的情况。图9显示描述了干旱后的恢复过程中转基因植物中相对于非转基因对照的改变 生物量的图。植物系7ael至7ael7也分别被描述为D0RF136-1至D0RF136-17 ；⑶S系也被 描述为表达D35S: GUS (细菌UidA基因)的系，其作为“无基因”的转基因对照。图10显示描述了完全加水条件的过程中转基因植物中相对于非转基因对照的改 变生物量的图。植物系7ael至7ael7也被分别描述为D0RF136-1至D0RF136-17。图11显示了用于基因整合数目确定的Southern印迹分析。图12显示由于含有锌指TF 0RF136( = ORF138)的Ml和A20表达改变引起的T1转化植物中种子产量增加的图解表示。
具体实施例方式定义本说明书和权利要求书中使用的术语“含有(comprising)”意思是“由至少一 部分组成”，就是说当解释包括“含有”的本说明书和权利要求书中的陈述时，在每个陈述 中以该术语开始的特征都需要出现，但是其它的特征也可以出现。相关的术语如“含有 (comprise) ”和“含有(comprised) ”以相似的方式解释。术语“环境应激”包括至少一种下列应激干旱、寒冷、冰冻、热和盐分。术语“对干旱应激的耐受性或耐受”预期描述在欠佳水合条件下或在欠佳水合条 件后相对于相同条件下的合适的对照植物，在生长和发育的任何方面表现更有利的植物。术语“对寒冷应激的耐受性或耐受”预期描述在欠佳减少的减少的温度条件下或 在欠佳减少的减少的温度条件后相对于相同条件下的合适的对照植物，在生长和发育的任 何方面表现更有利的植物。术语“对冰冻应激的耐受性或耐受”预期描述在小于或等于0°C的温度条件下或在 小于或等于0°c的温度条件后相对于相同条件下的合适的对照植物，在生长和发育的任何 方面表现更有利的植物。术语“对热应激的耐受性或耐受”预期描述在欠佳的提高温度条件下或在欠佳的 提高温度条件后相对于相同条件下的合适的对照植物，在生长和发育的任何方面表现更有 利的植物。术语“对盐分的耐受性或耐受”预期描述在欠佳的提高盐分条件下或在欠佳的提 高盐分条件后相对于相同条件下的合适的对照植物，在生长和发育的任何方面表现更有利 的植物。提及本发明的选择方法时，对环境应激具有增加耐受性的植物是选自以下的植物 群体的植物在应激条件下相对于相同条件下的群体的一般成员，在生长和发育的任何方 面表现更有利。更有利的表现是指上面包括去除环境应激后，在环境应激一段时间后改善恢复的 改善表现。术语“生物量”指示特殊年龄或发育阶段中植物营养器官的大小和/或质量和/或 数目。因此具有增加生物量的植物相对于相同年龄或同等发育阶段的合适的对照植物具有 增加大小和/或质量和/或数目的营养器官。相反，具有减少生物量的植物相对于合适的 对照具有减少大小和/或质量和/或数目的营养器官。改变的生物量还包括在植物的一些 或所有的生命循环时期内，相对于合适的对照，生长速率和/或营养器官形成速率的改变。 因此改变的生物量可以引起这样的植物达到某种发育阶段所需时间的提前或延后。术语“种子产量”是指植物产生的种子或谷粒的大小和/或质量和/或数目。因 此具有增加的种子产量的植物相对于相同年龄或同等发育阶段的合适对照植物，具有增加 大小和/或质量和/或数目的种子或谷粒。相反，具有减少种子产量的植物相对于相同年 龄或同等发育阶段的合适对照植物，具有增加大小和/或质量和/或数目的种子或谷粒。提及种子产量的术语“改变的”预期包括种子产量的减少或增加。
提及种子产量的术语“调节”预期包括减少或增加种子产量。合适的对照植物包括相同物种或品种的非转化植物或用对照构建体转化的相同 物种或品种的植物。多核苷酸和片段本文使用的术语“多核苷酸”意思是任何长度但优选至少15个核苷酸的单链或 双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且包括(作为非限制性例子)基因的编码和非 编码序列、正义和反义序列互补物、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、 siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA 和DNA序列、核酸探针、引物和片段。本文提供的多核苷酸序列的“片段”是能够与目的靶向特异性杂交的连续核苷酸， 例如至少15个核苷酸长度的序列。本发明的片段含有本发明多核苷酸的连续核苷酸的15 个核苷酸，优选至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸，更优 选至少50个核苷酸，更优选至少60个核苷酸，更优选至少70个核苷酸，更优选至少80个 核苷酸，更优选至少90个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，更优选至少150个核苷酸，更 优选至少200个核苷酸，更优选至少250个核苷酸，更优选至少300个核苷酸，更优选至少 350个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，更优选至少450个核苷酸。多核苷酸序列的片段 可以用于反义、基因沉默、三螺旋或核酶技术，或作为包括在微阵列中的引物、探针，或用于 本发明基于多核苷酸的选择方法中。术语“引物”是指短的多核苷酸，通常具有游离的3’ OH基团，与模板杂交并用于与 靶向互补的多核苷酸的起始聚合。术语“探针”是指在基于杂交的分析中用于检测多核苷酸序列，与探针互补的短多 核苷酸。探针可以由本文定义的多核苷酸的“片段”组成。多肽和片段本文使用的术语“多肽”包括任何长度但优选至少5个氨基酸的氨基酸链，包括全 长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明的多肽可以从天然产物中纯化，或可 以部分或全部使用重组或合成技术产生。该术语可以指多肽、多肽的聚集体如二聚体或其 它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。多肽的“片段”是实现生物活性所需的功能和/或提供多肽的三维结构的顺序多 肽。该术语可以指多肽、多肽聚集体如二聚体或其它多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽变体 或能够实现上面酶活性的其衍生物。应用于本文公开的多核苷酸或多肽序列的术语“分离的”用于指从其天然细胞环 境中移出的序列。分离的分子可以通过任何方法或方法的组合包括生物化学、重组和合成 技术获得。术语“重组体”是指从序列的天然环境中包围其的序列中移出的多核苷酸序列和 /或与其天然环境中不存在的序列重组的多核苷酸序列。“重组”多肽序列通过从“重组”多核苷酸序列的翻译产生。关于源自特殊属或物种的本发明的多核苷酸或多肽的术语“源自”意思是多核苷 酸或多肽具有所述属或物种中天然找到的多核苷酸或多肽的相同序列。因此源自特殊属或 物种的多核苷酸或多肽可以通过合成或重组制备。
变体如本文使用的，术语“变体”是指与明确鉴别的序列不同的多核苷酸或多肽序列， 其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被删除、置换或添加。变体可以是天然存在的等位基 因变体或非天然存在的变体。变体可以来自相同或来自其它的物种且可以包括同源物、旁 系同源物和直系同源物。在某些具体实施方案中，本发明的多核苷酸和多肽的变体具有与 那些本发明的多核苷酸或多肽相同或相似的生物活性。提及多核苷酸和多肽的术语“变体” 包括所有形式的本文定义的多核苷酸和多肽。多核苷酸变体变体多核苷酸序列优选显示与特定的多核苷酸序列至少50%，更优选至少51%， 更优选至少52%，更优选至少53%，更优选至少M %，更优选至少55%，更优选至少56%， 更优选至少57 %，更优选至少58 %，更优选至少59 %，更优选至少60 %，更优选至少61 %， 更优选至少62 %，更优选至少63 %，更优选至少64 %，更优选至少65 %，更优选至少66 %， 更优选至少67 %，更优选至少68 %，更优选至少69 %，更优选至少70 %，更优选至少71 %， 更优选至少72 %，更优选至少73 %，更优选至少74 %，更优选至少75 %，更优选至少76 %， 更优选至少77 %，更优选至少78 %，更优选至少79 %，更优选至少80 %，更优选至少81 %， 更优选至少82 %，更优选至少83 %，更优选至少84 %，更优选至少85 %，更优选至少86 %， 更优选至少87 %，更优选至少88 %，更优选至少89 %，更优选至少90 %，更优选至少91 %， 更优选至少92 %，更优选至少93 %，更优选至少94 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %， 更优选至少97%，更优选至少98%，和最优选至少99%的同一性。在特定多核苷酸序列的 至少20个核苷酸位置，优选至少50个核苷酸位置，更优选至少100个核苷酸位置的比较窗 口上和最优选在全长上找到同一性。多核苷酸序列的同一性可以以下列方式确定。使用BLASTN (来自blkeq中BLAST 程序组，版本2. 2. 5 [Nov 2002]) ((Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999)，" Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences" , FEMS Microbiol Lett. 174 :247-250)，可以从 NCBI (ftp://ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)公开获 得)将所述多核苷酸序列与候选多核苷酸序列比较。除了低复杂性部分的过滤应该关掉以 外，使用blkeq的缺省参数。可以使用下列imix命令行参数检查多核苷酸序列的同一性bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p blastn参数FF :关掉低复杂性部分的过滤。参数ρ 选择序列对的合适算法。blkeq程 序用行“同一性=”中相同核苷酸的数目和百分比报告序列的同一性。多核苷酸序列同一性还可以使用整体序列比对程序(例如Needleman，S. B.和 ffunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)在候选和所述多核苷酸序列之间的重叠全 长上计算。Needleman-Wunsch整体比对算法的完全实现在EMBOSS程序包中的needle程 序(Rice, P.Longden, I.禾口 Bleasby, A. EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Trends in Genetics June 2000，vol 16，No 6. pp. 276—277)中可以找 到，所述程序可以从http://www. hRmp. mrc. ac. uk/Software/EMBOSS/获得。欧洲生物信息 学研究所服务器还提供工具从而进行在http:/WWW. ebi. ac. uk/emboss/align/上在线的 两个序列间的EMBOSS-needle整体比对。
或者可以使用GAP程序，其不对末端空隙进行罚分而计算两个序列的最佳整体比 对。GAP 在下列文章中有描述Huang，X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10,227-235。本发明的多核苷酸变体还包括那些与一个或多个具体确定的序列显示相似性的 序列，其有可能保留那些序列的功能等同性且不能被合理地预期为随机出现。这些序列关 于多肽的相似性可以使用来自NCBI的BLAST程序组(版本2. 2. 5 [Nov2002]) (ftp //ftp. ncbi.nih. Rov/blast/)中可以公开获得的blkeq程序而确定。多核苷酸序列的相似性可以使用下列imix命令行参数检查bl2seq-i nucleotideseql-j nucleotideseq2_F F_p tblastx参数FF:关掉低复杂性部分的过滤。参数P:选择序列对的合适算法。该程序在 序列间找到相似性的区域并对每个这样的区域报告“E值”，所述“E值”是人们在含有随机 序列的固定参考大小的数据库中预期随机见到这样匹配的预期次数。该数据库的大小被设 定为blkeq程序中的缺省值。对于较小的远小于1的E值，E值大约是这样随机匹配的概 率。当与任一个具体确定的序列相比，变体多核苷酸序列优选显示1x10,以下，优选 IxlO-20以下，更优选lxl(T3°以下，更优选lxl(T4°以下，更优选1χ1(Γ5°以下，更优选1x10, 以下，更优选lxl0_7°以下，更优选1χ10_8°以下，更优选1χ10_9°以下，更优选1x10,°以下， 更优选IxKTiki以下和最优选1χ10_12°以下的E值。或者，本发明的变体多核苷酸在严谨条件下与特定的多核苷酸序列或其互补物杂 、-父。术语“在严谨条件下杂交”和其语法等同物是指多核苷酸分子与靶多核苷酸分子 (如固定在DNA或RNA印迹如Southern印迹或Northern印迹上的靶多核苷酸分子)在限 定的温度和盐浓度的条件下杂交的能力。在严谨杂交条件下杂交的能力可以通过在较不严 谨条件下最初杂交然后将严谨度增加至所需严谨度而确定。关于大于约100个碱基长度的多核苷酸分子，通常的严谨杂交条件为不高于天然 双链的解链温度(Tm)以下25至30°C (例如10°C )(通常见Sambrook等人，Eds，1987， Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Ausubel 等人，1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing,)。大于 约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可以通过公式Tm = 81. 5+0. 41% (G+C-log(Na+)计 算(Sambrook 等人，Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press ；Bolton and McCarthy，1962，PNAS84 :1390)。大于约 100 个碱基长 度的多核苷酸的通常严谨条件为杂交条件如在6XSSC，0. 2% SDS的溶液中预洗；在65°C， 6X SSC，0. 2% SDS杂交过夜；然后是65°C1X SSC，0. 1 % SDS中两次洗涤，每次30分钟和在 65°C，0. 2X SSC,0. 1% SDS中两次洗涤，每次30分钟。关于具有长度在100个碱基以下的多核苷酸分子，示例性的严谨杂交条件为Tm以 下5至10°C。平均，长度在IOObp以下的多核苷酸分子的Tm减少约(500/寡核苷酸长度)°C关于称为肽核酸(PNA)的DNA模拟物(Nielsen等人，kience. 1991 Dec6 ； 254(5037) =1497-500), Tm值高于那些DNA-DNA或DNA-RNA杂交体的Tm值，且可以使用 Giesen 等人，Nucleic Acids Res. 1998 Nov 1 ；26 (21) :5004-6 中所述的公式计算。具有长度在100个碱基以下的DNA-PNA杂交体的示例性严谨杂交条件为Tm以下5至10°C。本发明的变体多核苷酸还包括与本发明的序列不同的多核苷酸，但是由于遗传密 码的简并性，编码了与本发明多核苷酸编码的多肽具有相似活性的多肽。不改变多肽氨基 酸序列的序列改变是“沉默变异”。除了 ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)，相同氨基酸的 其它密码子可以通过本领域公认的技术例如在特殊宿主生物中优化密码子表达而改变。不显著改变其生物学活性而引起编码的多肽序列中一个或几个氨基酸的保守性 置换的多核苷酸序列的改变也包括在本发明中。技术人员知道制备表型沉默的氨基酸置换 的方法(见例如 Bowie 等人，1990，Science 247，1306)。由于编码的多肽序列中沉默变异和保守性置换引起的变体多核苷酸可以使用来 自 NCBI 的 BLAST 程序组(版本 2. 2. 5 [Nov 2002]) (ftp //ftp, ncbi. nih. gov/blast/)中 可以公开获得的blkeq程序通过先前所述的tblastx算法而确定。调节生物量和/或对环境应激植物耐受性的本发明变体多核苷酸的功能可以通 过本领域技术人员已知的方法评估且在实施例部分有描述。功能可以通过以下评估，例如 通过本领域中已知的方法和/或本文所述的方法改变植物中多核苷酸的表达，并在环境应 激条件下或在环境应激条件后分析转化的植物相对于对照植物的表现；以及在非应激条件 中评估改变的生物量。几个物种的另外的植物转化规程是本领域技术人员已知的。本文提 供了这样的规程的列表。多肽变体提及多肽的术语“变体”是指多肽包括天然存在的、重组和合成产生的多肽。变体 多肽序列优选显示与本发明的序列至少50%，更优选至少51%，更优选至少52%，更优选 至少53 %，更优选至少M %，更优选至少55 %，更优选至少56 %，更优选至少57 %，更优选 至少58 %，更优选至少59 %，更优选至少60 %，更优选至少61 %，更优选至少62 %，更优选 至少63 %，更优选至少64 %，更优选至少65 %，更优选至少66 %，更优选至少67 %，更优选 至少68 %，更优选至少69 %，更优选至少70 %，更优选至少71 %，更优选至少72 %，更优选 至少73 %，更优选至少74 %，更优选至少75 %，更优选至少76 %，更优选至少77 %，更优选 至少78 %，更优选至少79 %，更优选至少80 %，更优选至少81 %，更优选至少82 %，更优选 至少83 %，更优选至少84 %，更优选至少85 %，更优选至少86 %，更优选至少87 %，更优选 至少88 %，更优选至少89 %，更优选至少90 %，更优选至少91 %，更优选至少92 %，更优选 至少93 %，更优选至少94 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选 至少98 %，和最优选至少99 %的同一性。在本发明多肽的至少20个氨基酸位置，优选至少 50个氨基酸位置，更优选至少100个氨基酸位置的比较窗口上和最优选在全长上找到同一 性。多肽序列的同一性可以以下列方式确定。使用bIkeq中的BLASTP(来自BLAST 程序组，版本2. 2. 5[Nov 2002])将所述多肽序列与候选多肽序列比较，所述BLASTP可以从 NCBI (ftp //ftp, ncbi. nih. Rov/blast/)中公开获得。除了低复杂性区域的过滤应该关掉 以外，使用bl2seq的缺省参数。多肽序列的同一性还可以使用整体序列比对程序在候选和所述多核苷酸序列间 的重叠全长上计算。上述的 EMB0SS-needle(可以从 http:/www. ebi. ac. uk/emboss/align/ 获得)禾口 GAP(Huang, X. (1994)On Global Sequence Alignment. Computer Applicationsin the Biosciences 10，227-235.)也是计算多肽序列同一性的合适的整体序列比对程序。上述BLASTP的用途优选用于确定根据本发明的多肽变体。本发明的多肽变体还包括那些与一个或多个具体确定的序列显示相似性的序列， 其有可能保留那些序列的功能等同性且不能被合理地预期为随机出现。这些序列关于多肽 的相似性可以使用来自NCBI的BLAST程序组(版本2. 2. 5 [Nov 2002]) (ftp://ftp.ncbi. nih. Rov/blast/)中可以公开获得的blkeq程序而确定。多肽序列的相似性可以使用下列 unix命令行参数检查bl2seq-i peptideseql-j peptideseq2_F F_p blastp当与任一个具体确定的序列比较时，变体多肽序列优选显示1x10,以下，更优选 IxlO-20以下，更优选lxl(T3°以下，更优选lxl(T4°以下，更优选1χ1(Γ5°以下，更优选1x10, 以下，更优选lxl0_7°以下，更优选1χ10_8°以下，更优选1χ10_9°以下，更优选1x10,°以下， 更优选1X10_"°以下，更优选1χ10_12°以下，和最优选1χ10_123以下的E值。参数FF 关掉低复杂性部分的过滤。参数ρ 选择序列对的合适算法。该程序在序 列间找到相似性的区域并对每个这样的区域报告“E值”，所述“E值”是人们在含有随机序 列的固定参考大小的数据库中预期随机见到这样匹配的预期次数。对于较小的远小于1的 E值，这大约是这样随机匹配的概率。不显著改变生物学活性的所述多肽序列的一个或数个氨基酸的保守性置换也包 括在本发明中。技术人员知道制备表型沉默氨基酸置换的方法(见例如Bowie等人，1990， Science 247，1306)。构建体、载体和其成分术语“遗传构建体”是指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其中可以插入另一个多核 苷酸分子(插入性多核苷酸分子)如但不限于cDNA分子。遗传构建体可以含有允许转录 插入性多核苷酸分子和可选地将转录本翻译成多肽的必须元件。插入性多核苷酸分子可以 源自宿主细胞，或可以源自不同的细胞或生物和/或可以是重组的多核苷酸。一旦遗传构 建体在宿主细胞中，其可以整合进入宿主的染色体DNA中。遗传构建体可以与载体相连。术语“载体”是指多核苷酸分子，通常是双链DNA，其用于将遗传构建体转运至宿主 细胞中。载体能够在至少一种另外的宿主系统中如大肠杆菌(E.coli.)中复制。术语“表达构建体”是指包括允许转录插入性多核苷酸分子和可选地将转录本翻 译成多肽的必需元件的遗传构建体。表达构建体通常以5’至3’的方向含有a)在宿主细胞中有功能的启动子，所述构建体在宿主细胞中转化，b)待表达的多核苷酸，和c)在宿主细胞中有功能的终止子，所述构建体在宿主细胞中转化。术语“编码区”或“开放阅读框”(ORF)是指在合适的调控序列控制下能够产生转 录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的正义链。编码序列通过5’翻译起始密 码子和3’翻译终止密码子的存在得到鉴别。当“编码序列”插入遗传构建体中时，当其可 操作地与启动子和终止子序列连接时，其能够得到表达。“可操作地连接”意思是将待表达的序列放置在包括启动子、组织特异性调控元 件、瞬时调控元件、增强子、阻遏子和终止子的调控元件的控制下。
术语“非编码区”是指在翻译起始位点上游和翻译终止位点下游的非翻译序列。这 些序列也分别称为5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录起始和终止所需的和调控翻译效率 所需的元件。终止子是终止转录且在可以在翻译序列下游的基因3’非翻译末端找到的序列。终 止子是mRNA稳定性的重要决定因素，且在一些情况下发现具有空间调控功能。术语“启动子”是指调控基因转录的编码区上游的非转录顺式调控元件。启动子 含有规定转录起始位点的顺式启动子元件和保守盒如TATA盒以及转录因子结合的基序。“转基因”是取自一个生物并通过转化引入不同生物的多核苷酸。转基因可以源自 与所述转基因引入的生物物种相同的物种或不同的物种。“反向重复序列”是其中重复的第二半在互补链中的重复序列，例如(5，) GATCTA.......TAGATC (3，)(3，) CTAGAT.......ATCTAG (5，)通读转录将产生进行互补碱基配对的转录本，从而形成发夹结构，只要在重复区 之间有34bp的间隔子。“转基因植物”是指含有遗传操作或转化产生的新遗传物质的植物。所述新遗传物 质可以源自与获得的转基因植物相同物种的植物或源自不同的物种。本发明的多核苷酸或多肽的术语“改变...的表达”和“改变的表达”预期包括以 下的情况其中对应于本发明多核苷酸的基因组DNA被修饰，因此引起本发明的多核苷酸 或多肽的表达改变。对基因组DNA的修饰可以通过遗传转化或引入突变的技术领域中已知 的其它方法。“改变的表达”可以与产生的信使RNA和/或多肽量的增加或减少相关，且由 于产生的多核苷酸和多肽序列的改变，还可以引起多肽活性的改变。申请人:已经从黑麦草属中鉴别了多核苷酸(SEQ ID NO :7)，其编码调节植物中生 物量和/或对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分环境应激的耐受性的多肽(SEQ ID NO :1)。申请人还鉴别了 SEQ ID NO 7的多核苷酸变体(SEQ ID NO :8_12)，其编码SEQ ID NO :1的多肽变体(SEQ ID NO :2-6)，所述变体调节植物中的生物量和对至少一种选自干 旱、寒冷、冰冻、热或盐分环境应激的耐受性。申请人:已经鉴别了 SEQ ID NO 1多肽中A20型和ANl型锌指基序和每个多肽变体 的存在。申请人还鉴别了所有多肽序列和变体中在每个锌指基序中完全保守的序列基序。本发明提供了相对于合适的对照植物，改变了生物量和对至少一种选自干旱、寒 冷、冰冻、热或盐分环境应激的耐受性的植物。本发明提供了具有增加的生物量和应激耐受 性的植物以及具有减少的生物量和应激耐受性的植物。本发明还提供了用于制备或选择这 样的植物的方法。用于分离或制备多核苷酸的方法本发明的多核苷酸分子可以通过使用各种本领域普通技术人员已知的技术分离。 以举例的方式，这样的多核苷酸可以通过使用Mullis等人，Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction，BirWiauser (通过引用并入本文)中所述的聚合酶链式反应(PCR)分离。 本发明的多肽可以使用本文定义的源自本发明的多核苷酸序列的引物扩增。本发明的或在本发明方法中有用的分离多核苷酸的另外方法包括使用作为杂交 探针在本文中列出的多核苷酸的全部或部分。将标记的多核苷酸探针杂交至固定在固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上的多核苷酸的技术可以用于筛选基因组或cDNA文库。示 例性杂交和洗涤条件为在5. OX SSC,0. 5%十二烷基硫酸钠，IX Denhardt氏溶液中65°C 杂交20小时；在1. OX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤(55°C洗涤三次，每次20分 钟)，和可选地在0. 5X SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸钠中60°C洗涤一次(20分钟)。可以 在60°C 0. IX SSC, 1% (w/v)十二烷基硫酸钠的条件下进行可选的进一步洗涤(20分钟)。本发明的多核苷酸片段可以通过本领域熟知的技术如限制性内切酶消化和寡核 苷酸合成制备。部分多核苷酸序列可以用于本领域中熟知的方法从而鉴定相应的全长多核苷酸 序列。这样的方法包括基于 PCR 的方法、5，RACE (Frohman ΜΑ, 1993,Methods Enzymol. 218 340-56)和基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。另外，以举例的方式，反向PCR 允许从基于已知区域的引物开始，获得本文公开的多核苷酸序列旁侧的未知序列(Triglia 等人，1998，Nucleic Acids Res 16，8186，通过引用并入本文)。所述方法使用几个限制性 酶产生基因已知区域中的合适片段。然后所述片段通过分子内连接被环化并用作PCR模 板。从已知区域设计不同的引物。为了物理上组装全长克隆，可以使用标准分子生物学方法 (Sambrook等人,Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987)。当从特定物种中制备转基因植物时，用序列或源自该物种的序列转化这样的植物 是有益的。益处可以是减轻公众对产生转基因生物中跨物种转化的关注。另外，当基因的 下调是所需的结果时，必须使用与植物中的序列相同(或至少高度相似)的序列，对于所述 植物来说表达的降低是所需的。为了这些和其它原因，希望的是能够鉴别和分离几个不同 植物物种中特定基因的直系同源物。变体(包括直系同源物)可以通过所述方法鉴别。鉴别变体的方法物理方法变体多核苷酸可以使用基于PCR的方法鉴别(Mullis等人，Eds. 1994 The Polymerase Chain Reaction，Birkhauser)。通常，用于扩增变体多核苷酸分子PCR的引物 的多核苷酸序列可以基于编码相应氨基酸序列保守区的序列。或者可以使用本领域技术人员熟知的文库筛选方法(Sambrook等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press，1987)。当鉴别探针 序列的变体时，相对于寻找当完全序列匹配时，杂交和/或洗涤的严谨度通常会降低。多肽变体还可以通过物理性方法鉴别，例如通过使用针对本发明多肽的抗体筛 3/^ (Sambrook ^ Α Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987)或通过这样的抗体的帮助鉴别来自天然来源的多肽。基于计算机的方法还可以通过本领域技术人员熟知的基于计算机的方法，使用公共结构域序列比 对算法和序列相似性搜索工具搜索序列数据库(公共结构域数据库包括Genbank、EMBL、 SwiSS-Pr0t、Pm和其它数据库)鉴别多核苷酸和多肽变体。在线资源的例子见例如 Nucleic Acids Res. 29 :1_10和11-16，2001。相似性搜索取回并比对用于与待分析序列 (即查询序列)比较的靶序列。序列比较算法使用得分阵列从而给每个比对分配总分。对鉴别序列数据库中的变体有用的示例性程序家族是BLAST程序组(版本2. 2. 5 [Nov 2002])，包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和 tBLASTX，可以从(ftp://ftp, ncbi.nih. Rov/blast/)或从国家生物技术信息中心(NCBI)，国家医药图书馆，Building 38A，Room 8N805, Bethesda, MD 20894USA公开获得。NCBI服务器还提供使用程序筛选公 开可获得的序列数据库成员的工具。BLASTN将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库比较。 BLASTP将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库比较。BLASTX将以所有阅读框翻译的核苷 酸查询序列与蛋白质序列数据库比较。tBLASTN将蛋白质查询序列与以所有阅读框动态翻 译的核苷酸序列数据库比较。tBLASTX将6个框翻译的核苷酸查询序列与6个框翻译的核 苷酸序列数据库比较。可以用缺省参数使用BLAST程序或可以根据需要改变参数从而细化 蹄选。BLAST 家族算法包括 BLASTN、BLASTP 和 BLASTX 的使用在 Altschul 等人，Nucleic Acids Res. 25 :3389-3402,1997 的发表物中有描述。用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似的算法产生的用查询序列进 行的对一个或多个数据库序列的“命中”，比对并鉴别序列的相似部分。以相似性的程度和 序列重叠的长度的顺序安排命中。对数据库序列的命中通常代表在只有查询序列的一部分 序列长度上的重叠。BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN 和 tBLASTX 算法还产生比对的“预期”值。所述 预期值(E)表明当搜索含有随机连续序列的相同大小的数据库时，人们可以随机“预期”见 到的命中数。预期值用作确定对数据库的命中是否表明真正相似性的显著性阈值。例如， 指定给多核苷酸命中的0. 1的E值被解释为在所筛选的数据库大小的数据库中人们可以仅 通过随机在具有相似得分的序列比对部分上预期见到0. 1的匹配。对于在比对和匹配部分 上具有 0. 01 或 0. 01 以下 E 值的序列，使用 BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN 或 tBLASTX 算 法在该数据库中通过随机找到匹配的概率为或以下。相关序列群组的多重序列比对可以用使用渐进的配对比对的 CLUSTALff (Thompson, J. D.，Higgins, D. G.和 Gibson, Τ. J. (1994)CLUSTALff improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22 :4673-4680, http://www-igbmc. u~strasbg. fr/BioInfo/Clustalff/ Top, html)或T-C0FFEE(Cedric Notredame,Desmond G. Higgins,Jaap Heringa,T-Coffee A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment, J. Mol. Biol. (2000) 302 :205-217))或 PILEUP 进行(Feng 和 Doolittle，1987，J. Mol. Evo 1. 25，351)。可以获得用于找到基序或特征序列的式样识别软件的应用软件。例如MEME (探出 基序的多重Em)找到一套序列中的基序和特征序列，MAST(基序比对和搜索工具)使用这 些基序鉴定查询序列中的相似或相同的基序。MAST结果作为带有适当的统计学数据和找到 基序的视觉概观的一系列比对提供。MEME和MAST是圣地亚哥的加利福尼亚大学研发的。PR0SITE (Bairoch 禾口 Bucher，1994，Nucleic Acids Res. 22，3583 ；Hofmann 等人， 1999, Nucleic Acids Res. 27,215)是鉴别从基因组或cDNA序列翻译的未知功能蛋白质的 功能的方法。PR0SITE数据库(www, expasy. orR/prosite)含有生物学上重要的式样和图谱 且被设计为可以与合适的计算工具一起使用从而给已知的蛋白质家族分配新的序列或确 定哪个已知结构域存在于所述序列中(Falquet等人，2002，Nucleic Acids Res. 30,235) Prosearch是可以用给定的序列式样或特征搜索SWISS-PR0T和EMBL数据库的工具。分离多肽的方法本发明的多肽包括变体多肽可以使用本领域熟知的肽合成方法如使用固相技术 的直接肽合成(例如 Mewart 等人，1969，in Solid-Phase Peptide Synthesis, WHFreeman Co, San Francisco California，或自动化合成例如使用 Applied Biosystems431A 肽合成 仪(Foster City,California)而制备。多肽的突变形式也可以在这样的合成过程中制备。本发明的多肽和变体多肽还可以使用各种本领域熟知的技术从天然来源纯 化(例如 Deutscher, 1990, Ed, Methods in Enzymology, Vol. 182, Guide to Protein Purification)。或者本发明的多肽和变体多肽可以在合适的宿主细胞中重组表达并从下面讨论 的细胞中分离。制备构建体和载体的方法本发明的遗传构建体含有一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明 多肽的多核苷酸，且可以用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物。本发明的遗 传构建体预期包括本文定义的表达构建体。制备和使用遗传构建体和载体的方法在本领域是熟知的且在Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Ed. Cold Spring Harbor Press,1987 ； Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing, 1987 中有 综合描述。制备含有构建体和载体的宿主细胞的方法本发明提供了含有本发明的遗传构建体或载体的宿主细胞。宿主细胞可以源自例 如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物。含有本发明的遗传构建体如表达构建体的宿主细胞可以用于本领域熟知的方法 (例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press, 1987 ；Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing，1987)，所述方法是为了重组制备本发明的多肽。这样的方法可以包括在适于 或有助于表达本发明多肽的条件下在合适的介质中培养宿主细胞。然后表达的重组多肽 (可以可选地分泌至培养物中)可以通过本领域熟知的方法从介质、宿主细胞或培养基中 得至Ij分离(例如Deutscher，Ed，1990，Methods in Enzymology,Vol 182,Guide to Protein Purification)。本发明的宿主细胞还可以用于制备通过表达本发明多肽产生的酶产物的方法。这 样的方法可以包括在适于表达本发明重组多肽的介质中，可选地在存在用于本发明表达的 多肽的另外酶底物时，培养本发明的宿主细胞。然后制备的酶产物可以通过各种标准技术 方法从宿主细胞或介质中得到分离。制备植物细胞和含有构建体和载体的植物的方法本发明还提供了含有本发明的遗传构建体的植物细胞和经修饰而改变本发明多 核苷酸或多肽表达的植物细胞。含有这样细胞的植物也形成本发明的一个方面。改变了生物量和/或对环境应激耐受性的植物的制备可以通过本发明的方法实 现。这样的方法可以包括用被设计为改变多核苷酸或多肽表达的构建体转化植物细胞和植物，所述多核苷酸或多肽能够调节这样的植物细胞和植物中的生物量和/或对环境应激的 耐受性。这样的方法还包括用被设计为改变一个或多个多肽或多肽表达的构建体的组合转 化植物细胞和植物，所述多肽能够调节这样的植物细胞和植物中的生物量和/或对环境应 激的耐受性。用多核苷酸转化植物细胞、植物和其部分的方法在Draper等人，1988，Plant Genetic Transformation and Gene Expression, A Laboratory Manual. Blackwell Sci.Pub.Oxford, p. 365 ；Potrykus 禾口 Spangenburg，1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.；禾口 Gelvin 等人，1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht中有描述。对转基因植物的综述，包括转化技术，在feilun和Breiman， 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, London 中提 1"共。遗传操作植物的方法可以获得许多遗传操作植物的对策(例如Birch，1997，Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol，48J97)。例如可以将对策被设计为增加在植物细胞、器官和/或其中多 核苷酸/多肽为正常表达的特定发育阶段中多核苷酸/多肽的表达，或在细胞、组织、器官 和/或其中其不是正常表达的特定发育阶段中异位表达多核苷酸/多肽。表达的多核苷酸 /多肽可以源自待转化的植物物种或可以源自不同的植物物种。转化对策可以被设计为降低植物细胞、组织、器官或其中多核苷酸/多肽为正常 表达的特定发育阶段中的多核苷酸/多肽的表达。这样的对策称为基因沉默对策。表达转基因植物中基因的遗传构建体通常包括驱动一个或多个克隆的多核苷酸 表达的启动子、终止子和检测转化的植物中遗传构建体存在的选择性标记序列。适用于本发明的构建体中的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器 官中是有功能的且包括细胞、组织和器官特异性启动子、细胞周期特异性启动子、瞬时启动 子、诱导型启动子、在大多数植物组织中有活性的组成型启动子和重组型启动子。启动子的 选择将取决于克隆的所需多核苷酸的时间和空间的表达。启动子可以是那些与目的转基因 正常相连的启动子，或源自其它植物、病毒和植物病原性细菌和真菌的基因的启动子。本领 域技术人员将无需过多的实验而能够选择适用于使用含有本发明的多核苷酸序列的遗传 构建体修饰和调节植物性状的启动子。组成型植物启动子的例子包括CaMV 35S启动子、胭 脂碱合成酶启动子和章鱼碱合成酶启动子和来自玉米的W^il启动子。在特定组织中有活 性的对内部发育信号或外部无生命或有生命的应激应答的植物启动子在科学文献中有描 述。示例性启动子在例如WO 02/00894中有描述，通过引用并入本文。在植物转化遗传构建体中常用的示例性终止子包括例如花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S终止子、根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶或章鱼碱 合成酶终止子、玉米(Zea mays)玉米蛋白基因终止子、水稻(Oryza sativa) ADP-葡萄糖焦 磷酸酶终止子和马铃薯(Solanum tuberosum)PI-II终止子。植物转化中常用的选择性标记包括给予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶 II基因(NPT II)、给予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因、用于Ignite(AgrEvo)和 Basta(Hoechst)抗性的草胺磷乙酰转移酶(bar基因)和用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸转 移酶基因(hpt)。还考虑到使用含有可以用于植物和植物组织中启动子表达分析的报告基因(表达对于宿主来说是外来的活性，通常是酶活性和/或可见信号(例如荧光素酶、GUS、GFP)的 编码序列)的遗传构建体。报告基因的文献在Herrera-Estrella等人，1993，Nature 303， 209，禾口 Schrott，1995，In :Gene Transfer to Plants (Potrykus, Τ. , Spangenbert. Eds) Springer Verlag. Berline, pp. 325-336 中有综述。基因沉默对策可以集中于基因本身或影响编码的多肽表达的调控元件。“调控元 件”以最广泛的可能意义用于本文并包括与目的基因相互作用的其它基因。被设计为降低或沉默本发明多核苷酸/多肽表达的遗传构建体可以包括本发明 多核苷酸的反义拷贝。在这样的构建体中，将多核苷酸置于相对于启动子和终止子的反义 方向中。“反义”多核苷酸通过反转多核苷酸或多核苷酸的区段获得以便产生的转录本与 基因的mRNA转录本互补，例如5，GATCTA 3，(编码链) 3，CTAGAT 5，(反义链)3，CUAGAU 5，mRNA5，GAUCUCG 3，反义 RNA为基因沉默设计的遗传构建体还可以包括反向重复序列。“反向重复序列”是重复 的序列，其中重复的第二半在在互补链中，例如5，GATCTA.........TAGATC-3，3，CTAGAT.........ATCTAG-5，形成的转录本可以进行互补性碱基配对从而形成发夹结构。通常需要重复区之间 至少3^bp的间隔子以便允许发夹形成。另一个沉默方法包括使用与miRNA等同的靶向转录本的小反义RNA(Llave等人， 2002，Science 297,2053).明确地考虑到使用对应于本发明的多核苷酸的这样的小反义 RNA。本文使用的术语遗传构建体还包括小反义RNA和对引起基因沉默有用的其它这 样的多核苷酸。用本文定义的表达构建体转化还可以通过称为正义抑制的过程引起基因沉默 (例如Napoli 等人，1990，Plant Cell 2,279 ；de Carvalho Niebel 等人，1995，Plant Cell, 7,347)。在一些情况下，正义抑制可以包括整个或部分编码序列的过表达，但还可以包括基 因的非编码区如内含子或5’或3’非翻译区(UTR)的表达。嵌合的部分正义构建体可以 用于协调沉默多个基因(Abbott 等人，2002，Plant Physiol. 128(3) :844-53 Jones 等人， 1998,Planta 204 :499-505)。还考虑到使用这样的正义抑制对策沉默本发明多核苷酸的表 达。为基因沉默设计的遗传构建体中的多核苷酸插入物可以对应于编码序列和/或 非编码序列，如启动子和/或内含子和/或5’或3’ UTR序列，或相应的基因。其它的基因沉默对策包括显性负性方法和使用核酶构建体(McIntyre，1996， Transgenic Res,5,257)。转录前沉默可以通过基因本身或其调控元件的突变引起。这样的突变可以包括点 突变、移码、插入、删除和置换。下列是公开可以用于遗传转化下列植物物种的遗传转化规程的代表性发表物 稻(Alam 等人，1999，Plant Cell Rep. 18,572)；玉米(美国专利系列号5，177，010 和5, 981, 840)；小麦(Ortiz 等人，1996，Plant Cell Rep. 15, 1996, 877)；番茄(美国专利 系列号 5，159，135)；马铃薯(Kumar 等人，1996Plant J. 9，:821)；木薯(Li 等人，1996 Nat. Biotechnology 14，736)；莴苣(Michelmore 等人，1987，Plant Cell Rep. 6,439)； 烟草(Horsch等人，1985，Science 227，1229)；棉花(美国专利系列号5，846，797和 5，004，863)；草(美围专利号 5，187，073 和 6. 020，539)；欧薄荷(Niu 等人，1998，Plant Cell Rep. 17，165)；柑橘植物(Pena 等人，1995，Plant Sci. 104,183)；葛缕子(Krens 等 人，1997，Plant Cell Rep, 17, 39)；香蕉(美国专利系列号5，792，935)；大豆(美国专利 号 5，416，011 ；5，569，834 ；5，824，877 ；5，563，04455 和 5，968，830)；菠萝(美国专利系列号 5, 952, 543)；白杨(美国专利号4，795，855)；一般的单子叶植物(美国专利号5，591，616 和6，037，522)；芸苔(美国专利号5，188，958 ；5, 463，174和5，750，871)；谷类(美国专利 号 6，074，877)；和黑麦草(Bajaj 等人，2006，Plant Cell Reports, 25 :651-659) 考虑到 其它的物种并且合适的方法和规程可以在本领域技术人员使用的科学文献中获得。可以使用本领域中已知的几个另外的方法改变本发明的核苷酸和/或多肽的表 达。这样的方法包括但不限于Tilling(Till等人，2003，Methods Mol Biol，2%，205)，所 谓的“Deletagene”技术(Li等人，2001，Plant Journal 27(3),235)和使用人工转录因子 如合成锌指转录因子。(例如Jouvenot等人，2003，Gene Therapy 10，513)。靶向特定多 肽的另外抗体或其片段还可以在植物中表达从而调节该多肽的活性(Jobling等人，2003， Nat. Biotechnol. ,21(1),35).还可以应用转座子标签方法。与本发明的多肽相互作用的 另外的肽可以通过技术如相显示(Dyax Corporation)得到鉴别。这样的相互作用的肽可 以表达在植物中或应用于植物从而影响本发明多肽的活性。特别考虑到将每个上面的方法 用于改变本发明的核苷酸和/或多肽的表达。选择植物的方法还提供了选择具有改变的生物量和/或对环境应激耐受性的植物的方法。这样的 方法包括测试用于改变本发明多核苷酸或多肽表达的植物。当改变的生物量和/或对环境 应激的耐受性可以不必是明显时，这样的方法可以应用于年幼或早期发育的阶段从而加快 针对改善生物量和/或对环境应激耐受性的培育程序。多核苷酸如信使RNA的表达通常用于相应多肽表达的指示剂。测定多核苷酸 表达的示例性方法包括但不限于Northern分析、RT-PCR和点印迹分析(Sambrook等人， Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2nd Fd. Cold Spring Harbor Press,1987)。 因此本发明的多核苷酸或多核苷酸的部分可以在鉴别具有对环境应激改变的耐受性的植 物的方法中用作本文定义的探针或引物。本发明的多肽可以用作杂交实验中的探针或用作 被设计为鉴别这样植物的基于PCR实验中的引物。或者可以针对本发明的多肽产生抗体。产生和使用抗体的方法在本领域中是标准 的(见例如Antibodies,A Laboratory ManualiHarlow A Lane，Eds，Cold Spring Harbour Laboratory, 1998)。这样的抗体可以用于检测调节植物中对环境应激耐受性的多肽改变表 达的方法中。这样的方法可以包括 ELISA(Kemeny，1991，A Practical Guide to ELISAiNY Pergamon Press)禾口 Western 分析(Towbin & Gordon，1994，J Immunol Methods，72，313)。分析多核苷酸或多肽表达和选择具有改变表达的植物的这些方法可以用于被设 计为产生具有改变的生物量和/或对环境应激耐受性的品种的常规培育程序中。
植物本发明的植物可以生长且自交或与不同植物品系杂交，具有所需表型特征的获得 的杂交体可以得到鉴别。可以生长两代或两代以上以保证所述表型特征得到稳定的保持和 遗传。从这样的标准培育方法获得的植物还形成本发明的一个方面。还广泛地说本发明由单独或共同地在本申请的说明书中提及或表明的部分、元素 和特征和任意两个或两个以上所述部分、元素或特征或其所有组合组成，在特定整体在本 文(具有本发明相关领域中的已知等同物)被提及的地方，这样的已知等同物被认为并入 本文，就如同单独列出一样。实施例参考下列非限制性实施例现在将说明本发明。实施例1 调节生物量产生和对环境应激耐受性的多核苷酸的鉴别介绍多年生黑麦草(Lolium perenne L.)是来自禾本科家族和!^estucaceae族的冷温 带牧草。为了产生黑麦草中基因相对表达式样的图谱，从获自秋季、夏季、春季和冬季中环 境温度生长、寒冷生长、水化的、脱水的和再水化的或脱水的预放牧和后放牧植物中获得的 样品中提取RNA并用于构建SAGE(基因表达的系列分析)(Velculescu等人1995，Science 270 :484-487)文库。材料和方法在本研究中贯穿使用多年生黑麦草(Lolium perenne L.)的培育变体(cv.) Bronsyn0田地生长的样品在每个季节的高峰过程中从新西兰汉米尔顿Dexcel的活跃小牧 场收集。草样品从预放牧的(放牧后15天)和后放牧的(放牧后1天)的黑麦草草地中 收集。草丛样品从3-6个随机选择的地点收获并用液氮速冻后储存在干冰中。在春季，还 收获未成熟的穗和花原基(floral initials) 0为了应激处理，对实验室生长的黑麦草使 用了下列条件在85% RH, 200C /18°C和16h/^h白天/黑夜方案下生长在生长室中15个 月的实验室生长的成熟多年生黑麦草；85% RH, 200C /18°C和16h/^h白天/黑夜方案下生 长55天的加水对照；70% RH, 220C /16°C和16h/ i白天/黑夜方案下生长6天，在秧苗的 整个生命中对其保持加水；脱水样品在85% RH, 200C /18°C和16h/^h白天/黑夜方案下只 加水55天；70% RH, 280C /20°C和16h/8h白天/黑夜方案下为3天；50% RH, 28°C /20°C和 16h/8h白天/黑夜方案下为3天；再水化的样品来自加水M小时并在70% RH, 220C /16°C 和16h/ i白天/黑夜方案下生长的脱水植物；寒冷应激的植物在85% RH, 200C /18°C和 16h/8h白天/黑夜方案下生长55天；在70% RH, 220C /16°C和16h/ i白天/黑夜方案下 为7天；在70% RH, 60C /TC和16h/ i白天/黑夜方案下为7天，在秧苗的整个生命中对 其保持加水。SAGE文库的构建使用TRIZOI 试剂(Invitrogen，CA, USA)并通过制造商描述的规程从液氮中 磨碎的组织中提取RNA。对于每个SAGE文库，使用IOOyg总RNA，并使用I-SAGE 或 I-SAGE Long试剂盒(Invitrogen，CA, USA)根据制造商的规程创建文库。从每个文库 中，对 960-1，920 个克隆进行测序(Australian Genome Research Facility, Brisbane, Australia)且使用SAGE2000软件提取标签。
SAGE生物信息学相关的数据库被设计为保留SAGE实验的标签、文库和表达计数。将每个标签序 列(包括酶的序列)对整个黑麦草无重叠基因剥离库(Gene thresher)和EST集合进行搜 索。以两个方向进行搜索并只使用完全匹配。使用General Feature format (GFF)方法 (http //www3. ebi. ac. uk/Services/ffebFeat)将结果加载至相关的数据库中。使用对一些或所有下列公共和适当数据库的同源性搜索，注释所有的黑麦草基因 剥离库和EST序列。AGI TIGR 基因目录，拟南芥(Arabidopsis)，版本 11，2004 年 1 月OGI TIGR基因目录，稻，版本14-1，2004年1月GENESEQN德温特专利DNA序列2002年12月7日GENESEQP德温特专利氨基酸序列2002年12月7日Os_unigene /Jcfg (Oryza sativa) Unigene Ι—·歹Ij 2004 ip 3 ^ 18 Hest_others其它EST序列(哺乳动物、真菌、原核生物)2003年3月11日est_plant GenBank+EMBL+DDBJ EST 分区的非冗余数据库的 Viridiplantae 亚群 2004年3月15日nr 所有非冗余 GenBank CDS 翻译物 +PDB+SwissProt+PIR 2003 年 3 月 11 日nr_plant 所有非冗余 GenBank CDS 翻译物 +PDB+SwissProt+PIR 的 BT 亚群的 HS 亚群的植物亚群2003年8月8日nt 所有非冗余 GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 序列(但没有 ESY，STS, GSS 或 HTGS 序 列)2003年3月11日nt_monocots所有非冗余GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列的单子叶植物亚群(但没 有 EST，STS, GSS 或 HTGS 序列)2003 年 3 月 11 日swissprot SWISS-PR0T蛋白质序列数据库的最后主要版本(无更新)2003年3月 28日使用E-05以下的E值界限值，将每个数据库最多10个靶向储存在相关的数据库 中。标签注释通过创建对涉及序列的所有注释的总结而注释具有命中黑麦草集合的标签。使用 计算每个单词在注释中出现频率的算法产生总结并基于出现的数目以降序将其排列。将总 结限制为10个单词，使用无单词(void word)列表过滤掉不重要信息。获得的总结线用 作哪个标签有可能是的指示。显示了实际的数目；给出可以用于评估每个单词在总结中的 重要性的附加信息。使用关键词计数的该自动注释方法与注释自动产生的蛋白质结构域 家族的 ProDom 数据库(在世界范围的网站 http://protein. toulouse. inra. fr/prodom/ current/html/home, php 可以获得)使用的自动评注(Automatic comment)相似。当观看标签数据时，显示了基于涉及序列的最高命中的详细注释。特别感兴趣的多核苷酸序列通过对推定的转录因子进行多核苷酸序列(其具有 脱水多年生黑麦草SAGE文库专属的SAGE标签)的BLASTX分析而鉴别。分析引起锌指样 蛋白质基因0RF136的鉴别。0RF136的cDNA显示在SEQ ID NO :7中。0RF136编码序列从 核苷酸位置88延伸至核苷酸位置576。我们SAGE文库中的转录图谱是
SAGE 标签 CCTGCGGCAG (SEQ ID NO 13)的数据
SAGE—标签CCTGCGGCAGtpm *冬季预放牧00冬季后放牧00冬季的根00春季预放牧00春季后放牧00开花00夏季后放牧00秋季预放牧00秋季后放牧00成熟00寒冷应激00水化的00脱水的159再水化的00*tpm =每一百万标签的标签计数下列引物用于扩增0RF136(基于 CLP0023004352-cF3_20040205) 827_ 0RF136_f AAGCCAGCCAGACTCTCTCTCGTACC (SEQ ID NO 14) 828_0RF136_r GCACCTTCAGTTTCCTCCGTTCATTC(SEQ ID NO 15)实施例2 =ORFl36变体的鉴别将0RF136多核苷酸序列作为种子序列对DGenBank核苷酸采集NR/NT数据库 (v2. 2. 17发行日期2007年8月26日)和ii)专利序列数据库(v2. 2. 17发行日期2007年 8月26日)进行不连续大比对(megablast)BLASTN搜索。用0RF136编码的多肽序列用作种子序列对GenBank NR数据库(v2. 2. 17发行 日期2007年8月洸日)进行位置特异性重复BLASTP搜索。还对EBI上的UniReflOO 蛋白质数据库(v2.2. 15发行日期2006年10月15日)进行了 USPTO搜索。该基因似乎 编码以低同源性与稻应激相关蛋白质基因相似的蛋白质，如(Mukhopadhyay等人，2004，PNAS(USA) 101 (16) :6309-6314)所述。使用EMBOSS 工具 EMMA (Thompson，J. D.，Higgins, D. G. and Gibson, Τ. J. 1994， CAB I OS, 10，19-29.)比对变体序列，EMMA是流行的多重比对程序ClustalW的界面。比对的 序列使用另一个称为prettyplot的EMBOSS工具(在分开的行中用标记的着色和共有序列 显示比对的序列)观看。比对显示在图5中。图5中比对的0RF136和变体蛋白质似乎是锌指转录因子，且通过蛋白质N末端 一半中的 A20 型锌指(pfam017M = X3-C-X(2-4)-C-Xll-C-X2-C_X2，其中 X 可以是任意氨 基酸；Marchler-Bauer A，等人，2007，Nucleic Acids Res. 35 :D237-40)基序和蛋白质 C 末端一半中的 ANl 型锌指基序(cl01438 = C-X2-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C 其中 X 可以是任意氨基酸；Marchler-Bauer A，等人，2007，Nucleic Acids Res. 35 D237-40)的存在得到鉴别。0RF136蛋白质中A20型基序的范围突出显示在图5中。来自0RF136的A20基序 的序列显示在SEQ ID N0:16中。该基序在所有的变体中很保守，25个残基中的20个完全 保守。申请人还鉴别了所有比对序列中完全保守的A20型内的基序。该完全保守的基序的 位置显示在图5中，序列显示在SEQ ID NO 17中。ORF136蛋白质中ANl型基序的范围突出显示在图5中。来自0RF136的ANl型基 序的序列显示在SEQ ID N0:18中。该基序在所有的变体中很保守，33个残基中的23个完 全保守。申请人还鉴别了所有比对序列中完全保守的Am型内的基序。该完全保守基序的 位置显示在图5中，序列显示在SEQ ID NO 19中。图5中比对的蛋白质序列的系统发生图显示在图6中。通过使用欧洲生物信息学研究所网址上ClustalW序列分析工具中的缺省参数组 (http//www, ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/)比对 SEQ ID NOs 1-6 产生系统发生图。实施例3 用于植物转化和转化植物的含有本发明多核苷酸的载体的制备含有ORF136 (C0RF136 和 DORF136)的载体用于过表达0RF136的载体通过标准的分子生物学技术制备。其中0RF136用双 35S启动子驱动的载体被指定为C0RF136。其中黑麦草脱水素样启动子驱动0RF136的载体 被指定为DORF136。(C0RF136)的图显示在图1中。CORF136的序列显示在图3中和SEQ ID NO :20中。DORF136的图显示在图2中。D0RF136的序列显示在图4和SEQ ID NO 21中。用本发明的多核苷酸转化植物多年生黑麦草(Lolium perenne L.培养的变种Impact)基本上如Bajaj等人 (Plant Cell R印orts，2006，25 :651-659)所述进行转化。源自所选黑麦草系分蘖的分生 区的胚胎发生愈伤组织和携带修饰的二元载体(C0RF136，图1或D0RF136，图2)的根瘤土 壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA101用于转化实验。连续摇动下用生长过 夜的土壤杆菌培养物浸泡胚胎发生的愈伤组织30分钟。在共同培养的培养基中将愈伤组 织传代培养4周后选择对潮霉素有抗性的愈伤组织。选择后，每2周将抗性愈伤组织在再 生培养基中传代培养直到再生出植物。在两轮或三轮选择后持续生长的再生物被证明是稳 定的转化体。然后每个再生的植物在维持培养基上繁殖从而产生克隆的小植物并随后无需 激素在MS培养基上生根。来自每个克隆的生根植物被转移进入受控制的温室条件，而将克隆的对应物保留在组织培养中作为备份。17个独立的转基因系(7ael至7ael7，还分别被 描述为D0RF136-1至D0RF136-17)已经在控制气候的环境实验室中得到分析，其中在完全 加水的条件下评估其生物量。也对这些系的分开的克隆进行了干旱应激。通过Southern印迹进行的杂交基因组DNA从多年生黑麦草的转化和非转化的对照系中分离。从每个系中收获 大约1. 5g的叶片和假茎材料。用液氮将组织在研钵及研杵中磨碎成粉末并于_80°C储存 在 50mL 管中直到提取。基本上如 Doyle 和 Doyle，1990 (Doyle J.J.和 Doyle J. L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12 :13-15)所述从制备的组织中分 离DNA。提取的DNA在800 μ 1 TE中重悬，并使用Nanodrop NlOOO估计浓度。用限制性酶EcoRV和SpeI消化大约25 μ g的基因组DNA。用100 μ 1反应体积中 40个单位的限制性酶在37°C消化DNA过夜。12小时孵育后加入另外20个单位的酶并消化 另外2小时。然后消化的反应物用乙醇沉淀、离心，弃去上清液、空气干燥并重悬于25 μ 1 dH20中用于电泳。使用IxTAE电泳缓冲液在IOxlkm琼脂糖凝胶上以45伏分离电泳消化的 DNA样品大约4小时。电泳后将凝胶变性(1. 5M NaCl，0. 5M NaOH)然后在使用供应 商(GE Healthcare, Buckinghamshire, England)所述的碱法毛细管转移至正电荷的 尼龙膜(Hybond N.)上前中禾口 (1. 5MNaCl，0. 5M Tris-base)。根据制造商的建议使用 Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, USA)将转移的 DNA 固定至膜上。在 4°C将膜储 存在塑料袋中的印迹纸之间直到需要。使用掺入了碱不稳定的地高辛-ll_dUTP(DIG，Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)的基于PCR的标记反应合成DNA探针。使用Bajaj等人2006 (Plant Cell Reports)所述的引物 rghlcpf (5' -3，，AATACGAGGTCGCCAACATCT, SEQ ID NO 22)和 rghcpr(5' -3’，AGGAACCCTAATTCCCTTATCTG，SEQ ID NO 23)从潮霉素磷酸转移酶基因中扩 增模板DNA。使用DIG Easy Hyb 试剂盒(Roche Diagnostics,Basel, Switzerland)在 42°C预 杂交尼龙膜1小时。将DIG标记的探针变性(95°C，5分钟)并加入预杂交溶液，在42°C杂 交膜大约12小时。杂交后，以摇动在室温低严谨度洗涤缓冲液(hSSC，0. 1 % SDS(w/v))中将膜进行 两次5分钟的洗涤，然后是高严谨度洗涤缓冲液(0. IxSSC,0. 1% SDS(w/v))中两次15分 钟的洗涤。进一步的洗涤使用DIG和洗涤与阻断缓冲组合(Wash and Block Buffer Set, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) iiif。 MMfflLS—DIG—AP 白勺^# (Roche Diagnostics,Basel, Switzerland)在室温用阻断溶液孵育膜30分钟。然后通过应用碱性 磷酸酶的CDP-Mar (Roche Diagnostics,Basel, Switzerland)化学发光底物检测杂交的探 针。将膜热封在塑料袋中，在X射线胶片(Kodak BioMax MS, Rochester,New York)上曝光 范围为60分钟至过夜以及在lOOPlus自动显影仪中曝光。图11中的结果显示每个0RF136转基因事件(标记为TAE1-9、TAE12-15和 TAE17 [注意在这里 0RF138 = 0RF136])是 P D0RF136T-DNA 的转基因。实施例4 用本发明多核苷酸转化的植物中对环境应激耐受性的改变生长室中的干旱筛选
植物生长系统由一米长90mm直径的塑料暴雨水管建成。将管置于移动支架上并 用绳子和金属框支撑在侧面。用石棉填塞管的底部并用水渐进地填充洗涤过的灰浆用沙以 获得均一的填塞。在每个管开口端的中心，种植多年生黑麦草丛(25个分蘖)。有三个独 立的转基因事件，将每个事件种植在6个管中。将植物随机安排，六个重复中的每个中有一 个，在70%相对湿度、16/8小时白天/黑夜周期和650μπιΟ1.πΓ2. s—1光强度下生长。在早 晨用50mL Hoagland氏溶液(Hoagland和Arnon，1938)灌溉植物每日一次，用50mL单纯的 水在下午再灌溉一次。最初使植物适应14天(图7)，然后将植物修剪回15cm的高度。允 许所有的植物从修剪中恢复另外7天。在这一恢复期后，通过不应用Hoagland氏溶液和水 只给6个重复中的3个加上干旱应激。在干旱筛选中，对所有的植物进行50%相对湿度、 16/8小时白天/黑夜周期和650 μ mol.nT2. s—1光强度。当沙质土中的容积含水量为以 下(12cm深)时，在第一轮中将干旱应激进行8天。对照和水化的植物中的容积含水量为 10%以上(12cm深)。停止干旱应激并对干旱应激的植物重新开始灌溉。所有的植物还回 复至70%相对湿度、16/8小时白天/黑夜周期和650 μ mol. m_2. s-1光强度。四天后(图8)， 测定植物的高度，然后修剪至15cm高度。测定经修剪的样品的鲜重，将样品干燥。在完全 加水的条件下允许植物生长总共14天，再进行干旱应激14天。将这一周期进行3次，在第 三次周期中，干旱的时间为21天。土壤湿度监测作为需要使用田地kout TDR 100 土壤湿度计量仪(Spectrum Technologies, Inc.，IL, USA)记录土壤湿度(VWC，容积含水量)。从12cm深的每个管中取测定物且记录 三个读数的平均值。培植期(establishment period)后，切断地下灌溉。土壤湿度含量降 低并达到1.0%以下的容积含水量(VWC)。无灌溉期后是再生长期。地上生物量测定干旱应激前(> 10% VffC)和后(< 1. 0% VffC)叶剪取物的干重。以15cm剪 取物重量切割所有的叶子。立即测定叶子的鲜重(FW)，然后将叶子在60°C干燥96小时，并 测定干重(DW)。在干旱应激下生长的能力计算为反质量损失的百分比，其被计算为相对于 非应激条件下的鲜重，非应激和干旱应激条件中鲜重的差别，即(1_[{非应激条件中的鲜 重(或干重)_干旱应激条件中的鲜重(或干重)}/非应激条件中的鲜重(或干重)])%。转基因植物比对照植物在水化和干旱应激条件中生长更旺盛(图9和10)。它们 还比非转基因对照恢复得更好。转基因系D0RF136-12(7ael2)和15(7ael5)中植物生物量 的增加在干旱和恢复中即整个实验过程中比对照显著地更高(图9)。当分析这些植物在非 应激条件中的生长时，其比对照表现得更好(图10)。实施例5 用本发明多核苷酸转化的植物生物量的改变还对完全水化条件下的转基因和野生型植物进行了实施例4所述的过程。在每 个收获中几个转基因系比野生型植物产生更多的生物量(基本上如实施例4中所述)。当 在四个收获期中测定累积生长时，系D0RF136-5、12和15持续产生比相应对照(非转基因 系)系D0RF136-5(7ae5)、7(7ae7)和15(7ael5)更多的生物量，例如显示超过非转基因系 的250-300%生物量的增加(图10)。实施例6 用本发明多核苷酸转化的植物种子产量的改变控制条件下转基因种子的制备
春化处理前，通过规律的微组织繁殖法将植物保持在组织培养中。将每个独立 转化系的单个无性系分株转移至PC2控制温室。建立的植物曾经生长在PB3/4塑胶袋中 的一般目的盆栽培养基中(60 40泥炭沙)。以每周间隔应用叶茂盛肥料(Yates New Zealand, Auckland)。以常规基础将植物修剪至大约40mm的高度以防止开花。栽培变种 Impact (登录号 A10745,Margot Forde Germplasm Centre, Palmerston North, New Zealand)的基因型作为制备与原代(Ttl)转基因物受控杂交的杂交伴侣生长。当 植物即转基因系和杂交伴侣发育了最少20个分蘖时，开始春化处理。将植物从温室中移至 6°C和8小时光周期的冷室中12周时间。用400w SonT农业高压钠灯(Philips Lighting, Mairangi Bay, Auckland, New Zealand) 共JM_。春化处理后将花诱导的植物返回温室Q0-25°C，16小时光周期)以便发育花蘖。 花序茎在3-4周生长后从分蘖中出现。来自原代转基因物和杂交伴侣的平衡匹配发育阶段 的多达8个花序茎在花药或小花柱头出现前在聚酯杂交袋中结合。杂交袋保留在植物上大 约三个月直到观察到花序茎的枯萎。在这一阶段，将每个杂交伴侣的花序分别收获至纸袋 中并在的烘箱中孵育两周。通过在种子磨粉机的两个波状橡胶表面之间研磨从收获材料的小花中分离种子。 通过穿过种子筛，从种子中去除大的谷壳。最后种子在南达科他种子鼓风机(Seedburo Equipment Co. , Chicago, USA)中得到清洁。计数并称重从单个杂交中收获的种子。T1代苗中T-DNA的分离使用为扩增潮霉素磷酸转移酶基因的片段而设计的引物通 过PCR确定。通过苗转基因T1后代和Impact (A10745)基因型的受控杂交使用如上所述规 程进行T2R种子的制备。见从收集的Ttl和T1系，对每个系进行称重和培
表1 来自单拷贝插入转基因系的Ttl植物中的禾
雌性亲代I^ollon 供体收集的种子
7AE1A107450
A107457AE12
7AE4A10745119
A107457AE4280
7AE5A1074564
A107457AE5136
7AE5A1074584
A107457AE5146
7AE7A107451
A107457AE70
7AE8A1074513
A107457AE821
7AE13A1074515
A107457AE130
7AE15A1074572
A107457AE15358
7AE17A10745 20A107457AE17451在花药或小花柱头出现前，在平衡匹配发育阶段，来自原代转基因系和种子衍生 的非转基因杂交伴侣的花序茎在聚酯杂交袋中结合。杂交袋保留在植物上直到观察到花序
茎的枯__。在这一阶段，分别收获每个杂交伴侣的花序，种子在保温箱中另外干燥后收获。
表2 来自单拷贝插入转基因系的T1代中的种子产量
T1系种子平均数/每个植物平均种子产量(g)/植物
7AE43630. 6182
7AE52050. 3496
7AE81370. 233
7AE131440. 2443
7AE152110. 3588
7AE17250. 0425
ORF138平均1810.3077
转基因对照1610.1036
转基因对照21190.2035
转基因对照平均900. 154
在花药或小花柱头出现前，在平衡匹配发育阶段，来自每个转基因后代植物的花
序茎在聚酯杂交袋中与不同种子衍生的非转基因杂交伴侣的花序茎结合。杂交袋保留在植 物上直到观察到花序茎的枯萎。在这一阶段，将两种杂交伴侣的花序茎收获在一起，种子在 保温箱中另外干燥后收获。除了只产生一个转基因后代植物的仅有的转基因事件7AE8，每 个转基因事件的种子产量从来自多于三个转基因后代植物和其各自杂交伴侣的种子产量 的平均计算得到。将种子产量数据与来自缘于用不同基因的黑麦草植物转化的两个不同的 转基因事件后代植物杂交中的平均种子产量相比。用0RF136( = 0RF138)转化的T1植物中的增加种子产量的图解表示(取自上面 表2中的平均数据)显示在图12中。上面的实施例说明了本发明的实施。本领域技术人员应该理解的是不背离本发明 的精神和范围可以做出许多变化和修改。序列的总结
权利要求
1.一种编码具有序列SEQ ID NO :1的多肽或其变体的分离的多核苷酸，其中变体是能 够调节植物中至少一种下列性状的多肽i)生物量， )种子产量，和iii)对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性。
2.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中分离的多核苷酸编码具有与序列SEQ ID NO 1至少70%同一性的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中多肽或变体含有A20型锌指结构 域和ANl型锌指结构域。
4.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中A20型结构域在多肽的N末端一半中。
5.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中ANl型结构域在多肽的C末端一半中。
6.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中A2 0型结构域具有通式 X3-C-X (2-4) -C-Xl 1-C-X2-C-X2，其中X可以是任意氨基酸。
7.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中ANl型结构域具有通式C-X2-C-X(9-12)-C-X(l-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C，其中 X 可以是任意氨基酸。
8.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中A20型结构域具有与序列SEQID NO 16至少70%的同一性。
9.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中A20型结构域含有序列SEQID N0:17。
10.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中A20型结构域含有序列SEQID NO16。
11.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中Am型结构域具有与序列SEQID NO 18至少70%的同一性。
12.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中Am型结构域含有序列SEQID NO19。
13.根据权利要求3所述的分离的多核苷酸，其中Am型结构域含有序列SEQID NO18。
14.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中分离的多核苷酸编码具有SEQID NO :1序列的多肽。
15.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中分离的多核苷酸含有具有与SEQID NO 7的编码序列至少70%同一性的序列。
16.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中多核苷酸含有能够在严谨条件下与 SEQ ID NO 7的编码序列杂交的序列。
17.根据权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中分离的多核苷酸含有SEQID N0:7的 编码序列。
18.一种含有序列SEQ ID NO :7或其变体的分离的多核苷酸，其中变体编码能够调节 植物中至少一种下列性状的多肽i)生物量， )种子产量，和iii)对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性。
19.根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，其中分离的多核苷酸含有与SEQID NO 7的编码序列至少70%同一性的序列。
20.根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，其中多肽如权利要求3至16中任一项所 述定义。
21.根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，其中分离的多核苷酸含有能够在严谨条 件下与SEQ ID NO 7的编码序列杂交的序列。
22.根据权利要求18所述的分离的多核苷酸，其中分离的多核苷酸含有SEQID NO 7 的编码序列。
23.一种由权利要求1至22任一项所述的多核苷酸编码的多肽。
24.一种由权利要求1至14任一项定义的任一多核苷酸编码的多肽。
25.一种分离的多核苷酸，其含有根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸的至少 50个核苷酸长度的片段。
26.一种含有根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸的遗传构建体。
27.一种含有根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸的表达构建体。
28.一种含有根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸或根据权利要求26或27所 述的构建体的宿主细胞。
29.—种经遗传修饰表达根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸的宿主细胞。
30.一种含有根据权利要求26或27所述的构建体的植物细胞。
31.一种含有根据权利要求30所述的植物细胞的植物。
32.—种制备具有至少一种下列性状的植物的方法i)改变的生物量， )改变的种子产量，和iii)改变的对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性，所述方法包括用下列成分转化植物细胞或植物a)根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸；b)含有a)中多核苷酸的至少15个核苷酸长度片段的多核苷酸；或c)含有a)或b)中多核苷酸互补物的多核苷酸。
33.根据权利要求32所述的方法，其中生物量和对至少一种所述环境应激的耐受性在 植物中有改变。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中改变是增加。
35.根据权利要求32至34任一项所述的方法，其中用权利要求26或27所述的构建体 转化植物。
36.根据权利要求32至35任一项所述的方法，其中多肽变体含有SEQID NO :2至6中 任一个序列。
37.根据权利要求35至35任一项所述的方法，其中多核苷酸变体含有SEQID N0:8至 12中任一个序列。
38.一种用于选择具有至少一种以下性状的植物的方法相对于合适的对照植物，i)改变的生物量， )改变的种子产量，和iii)改变的对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性， 所述方法包括测试植物的根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸或根据权利要 求23或24所述的多肽改变的表达。
39.一种根据权利要求32至37任一项所述的方法制备的植物细胞或植物。
40.根据权利要求39所述的植物细胞或植物，其经遗传修饰而含有根据权利要求1-22 任一项所述的多核苷酸。
41.一种用根据权利要求38所述的方法选择的植物群组或群体。
42.一种根据权利要求31或39所述的植物的部分、果实、种子、收获的材料、繁殖体或 后代。
43.根据权利要求42所述的植物的部分、果实、种子、收获的材料、繁殖体或后代，其经 遗传修饰而含有至少一种根据权利要求1至22任一项所述的多核苷酸或根据权利要求26 或27所述的构建体。
全文摘要
本发明提供了编码具有序列SEQ ID NO1的多肽或其变体的分离的多核苷酸，其中变体是能够调节植物中至少一种下列性状的多肽i)生物量，ii)种子产量，和iii)对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性。本发明还提供了经遗传修饰而含有所述多核苷酸的构建体、载体、宿主细胞、植物细胞和植物。本发明还提供了用于制备和选择改变了至少一种下列性状的植物的方法i)生物量，ii)种子产量，和iii)对至少一种选自干旱、寒冷、冰冻、热或盐分的环境应激的耐受性，使用本发明的多核苷酸的方法。
文档编号A01H5/10GK102099476SQ200980126566
公开日2011年6月15日 申请日期2009年5月28日 优先权日2008年6月3日
发明者C·J·布赖恩特, K·R·坦普尔顿, S·巴贾杰, S·普蒂加埃 申请人:维亚拉克什亚生物科学(新西兰)有限公司