专利名称：花生根瘤Fe(Ⅱ)转运蛋白及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、生理学以及基因工程等领域，具体地说，涉及一种来源于 豆科作物花生根瘤的Fe (II)转运蛋白及其编码基因。
背景技术：
氮素是农业生产中最重要的养分之一，多年来，为了维持或提高作物产量，化学氮 肥用量不断增加，给能源的需求和持续供应带来了巨大压力；同时，由于氮肥利用效率低， 大量氮肥通过氨挥发，反硝化和淋溶径流等途径进入大气、水体环境或盈余在农田生态系 统中，造成了严重的环境污染和食品安全等问题，严重威胁着人类健康和生态系统的平衡 稳定，也已经成为世界关注的科学热点问题。但值得关注的是豆科植物与根瘤菌在根际微 生态系统中形成的根瘤共生体，不但是一个高效的共生固氮体系而且是一个环境友好的共 生系统，豆科作物可以通过高效的固氮作用减少对肥料氮的需求，从而能够提高作物产量 和达到环境保护，因此，挖掘豆科植物的生物固氮潜力对于可持续农业的发展具有重要的 理论和实践意义。根瘤是由豆科植物根皮层细胞分化增生而形成的组织，当根瘤菌产生的结瘤因子 与寄主植物专一性识别后，寄主植物根表皮细胞、皮层细胞和中柱鞘细胞发生反应并形成 侵染线和根瘤原基，接着根瘤菌通过侵染线进入根瘤原基细胞内大量增殖，同时根瘤原基 细胞不断分裂，突出根表形成能够进行生物固氮的根瘤。这主要是由于专一识别后根瘤菌 和寄主豆科植物在各自的代谢方式和形态结构上会发生相应改变，共同构建出一个厌氧、 高效的固氮环境。具体来讲，根瘤菌的形态由杆状变为球状(类菌体)，被起源于寄主细 胞质膜的一层称为类菌体周膜(PBM)的生物膜所包裹，形成一个类似于细胞器的共生体， 该共生体由类菌体(bacteroid)、类菌体周膜(PBM) (peribacteroid membrane)和介于二 者之间的空间(PBS) (peribacteroid space)所组成(White L. F. , Day D. Α. , 1997. The peribacteroid membrane. Physiologia PIantarum. 100 :30_44)。#生/[本形@后，二者] 禾 共生的关系便开始了，豆科植物将部分光合作用合成的碳源和根系吸收的必需营养元素如 氮、磷和微量元素如铁等提供给类菌体，以满足其生长及固氮所需，同时类菌体将固定的氮 素供给豆科植物所用。在二者互惠的过程中，交换的能量和营养物质需借助类菌体周膜上 的转运通道或运输载体跨过类菌体周膜，供给对方，因此，类菌体周膜上运输载体及其转运 能力的研究极为重要。铁是直接参与豆科作物共生固氮的重要营养元素之一，在共生体形成、根瘤发育、 类菌体高效固氮等各个环节都发挥着重要的作用。它是固氮酶、豆血红蛋白、铁氧还蛋白 等含铁蛋白的重要金属组分(Dakora，D. F. 1995. A functional relationship between leghaemogbin and nitrogenase based on novel measurements of the proteins in legume root nodules. Annals of Botany. 15 :49_54.),而根瘤的固氮酶活性禾口豆血红蛋 白含量是评价根瘤固氮能力的两个重要指标。研究表明共生固氮体系对铁的相对需求程 度比豆科植物本身还要高，可见，铁元素的充足供给是高效共生的重要保障，因此，揭示铁元素跨类菌体周膜(PBM)运输的途径是为进一步如何调控豆科植物并增强其共生固氮功 能发挥的重要研究内容。研究表明跨越类菌体周膜(PBM)运输进入类菌体的铁主要有两 种方式一种是类菌体直接吸收和利用含铁化合物如柠檬酸铁(III)，第二种是植物细胞 中Fe(II)通过PBM上的Fe(II)运输载体进入共生体内部，事实上类菌体更容易利用通 过 Fe (II)运输载体运输的 Fe (II) (Levier K.，Day D. Α.，Guerinot Μ. L. Iron uptake by symbiosomes from soybean root nodules. Plant Physiology.1996. Ill :893_900)。
Kaiser等(2003)首次从大豆根瘤中分离鉴定出一个定位于类菌体周膜，而且与 二价金属离子转运体NRAMP基因家族高度同源的GmDmtl ；1运输载体。该基因具有较强 的跨膜运输Fe(II)的能力，而且该基因在大豆根瘤尤其是发育成熟具有固氮能力的根瘤 中强烈表达，表明了这个铁的运输载体在跨类菌体周膜运输二价铁进入共生体并进而满 足共生固氮对铁的不断需求上发挥着重要的作用(Kaiser BN, Moreau S，Castelli J，et al. The soybean NRAMP homo1οgue,GmDMTl,is a symbiotic divalent metal transporter capable of ferrous iron transport. Plant Journal. 2003. 35:295_304.)。NRAMP 基 S MiM (natural resistanceassociated macro-phage protein) i 一 ^ W ^； ^ IM 运二价金属离子的基因，它不仅转运Fe2+，还能转运其他二价金属阳离子，如Cd2+、Zn2+、 Cu2+、Mn2+等，因而该家族基因对转运、储存金属离子以及维持细胞内金属离子平衡具有重 要作用(Rosakis A, Koster W. Divalent metal transport in the green microalga, Chlamydomonas reinhardtii is mediated by a protein similar to prokaryotic Nramp homolgues. BioMetals 2005 ；18 :107_120)。花生(Arachis hypogaea L.)是继大豆之后另一个重要的油料作物，同时也是能 够进行生物固氮的豆科植物，对于铁营养而言，从生理水平来讲，大豆和花生都属于缺铁适 应性反应为机理I的植物，从遗传背景而言，二者染色体和基因组大小也非常相似，在石灰 性土壤上，花生非常容易缺铁黄化从而导致其产量和品质的下降，这主要是由于铁营养不 仅影响花生的正常生长和发育，同时也影响其生物固氮，因此，提高花生铁的利用效率和根 瘤固氮能力具有重要的实践意义和生态意义。
发明内容
本发明目的为提供一种花生根瘤Fe (II)转运蛋白及其编码基因。为了实现本发明目的，本发明的花生根瘤Fe (II)转运蛋白，其具有如SEQ ID No. 1 所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列。编码前述花生根瘤Fe(II)转运蛋白的基因，其具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸 序列。含有编码前述花生根瘤Fe (II)转运蛋白的基因或其片段的载体及含有该载体的宿主。含有编码前述花生根瘤Fe (II)转运蛋白的基因或其片段的转化植物细胞。编码前述花生根瘤Fe (II)转运蛋白的基因或其片段在提高植物铁的利用效率和 根瘤固氮能力中的应用。本发明还提供一种用于扩增前述花生根瘤Fe(II)转运蛋白编码基因的引物，包括正向引物 5 ‘ -DMT-F 5 ‘ -ACGCGGGGGAGCATAAATGTGGAAACACCACTAGCAT-3 ‘，以及反向引 物 3' -DMT-R 5' -AACTATGATGTTCAAAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。本发明提供的花生根瘤Fe (II)转运蛋白，名称为AhDmtl，是具有序列表中SEQ ID No 1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等 功能的氨基酸序列的蛋白质；序列表中的SEQ ID No :1由504个氨基酸组成 ，该蛋白自N端 第1位氨基酸到第25位氨基酸是其信号肽序列，其N-末端位于膜外，而C-末端位于膜内， 具有11个典型的跨膜序列，分别为序列1 :46-68aa ；序列2 :75_97aa ；序列3 :154_176aa ； 序列 4 :183-205aa ；序列 5 :225_244aa ；序列 6 :265_287aa ；序列 7 :319_341aa ；序列 8 362-384aa ；序列 9 :399_416aa ；序列 10 :429_451aa ；序列 11 :484_504aa。其中序列 2-序 列10共9个跨膜区是典型的NRAMP功能区，并且在第7和第8区域之间具有NRAMP基因家 族同源蛋白典型的铁转移序列，表明该基因属于NRAMP基因家族。上述花生根瘤Fe (II)转运蛋白编码基因(AhDmtl)，具有序列表中SEQ ID No :2所 示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID No 2为花生根瘤AhDmtl全长cDNA序列，包括5'-端 UTR，蛋白编码区和3' -UTR包括poly (A)，共有1898bp组成，分别为5' -UTR(l_156bp)和 3' -UTR(1674-1989bp)，中间区域为蛋白编码区(157_1673bp)。本发明利用上述含有AhDmtl基因的表达载体pYES2_AhDmtl、pDR195_AhDmtl和 转入pYES2-AhDmtl、pDR195_AhDmtl表达载体的酵母突变体进行酵母异源表达功能验证， 结果表明花生根瘤AhDmtl转运体能够转运Fe2+、Mn2+，但是不能转移Zn2+，同时证明其转运 Fe2+的过程是依赖质子的。本发明还根据序列表中SEQ ID No: 2设计AhDmtl基因专一性引物，利用RT-PCR 技术分析其组织表达情况，结果表明AhDmtl基因主要在花生根瘤中表达，在叶片、根部的 表达量很低。本发明首次发现并证明了花生根瘤中二价铁离子转运蛋白及其编码基因，揭示了 豆科植物与根瘤菌共生固氮过程中铁元素的转运、利用方式，为通过基因工程技术提高豆 科植物铁利用效率、发挥根瘤高效固氮潜力提供了必要的理论依据和技术支持，具有较大 的应用前景。
图1为本发明花生根瘤AhDmtl基因cDNA序列片段PCR扩增结果；图2为本发明花生根瘤AhDmtl基因的5，RACE PCR扩增结果；图3为本发明花生根瘤AhDmtl基因的3，RACE PCR扩增结果；图4为本发明花生根瘤AhDmtl基因全长cDNA序列PCR扩增结果；图5A为本发明酵母表达载体pDDl图谱；图5B为本发明酵母表达载体pYDl图谱；图6A为本发明酵母表达载体pDDl鉴定结果；图6B为本发明酵母表达载体pYDl鉴定结果；图7为酵母异源功能互补验证AhDmtl转运二价铁离子的功能；图8为酵母验证AhDmtl转运二价铁离子受pH的影响；图9为酵母异源功能互补验证AhDmtl转运二价锰离子的功能；
图10为酵母异源功能互补验证AhDmtl转运二价锌离子的功能；图11为本发明AhDmtl基因在花生不同器官中的表达。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中涉及的材料及来源1.花生(Arachis hypogaea L.)品种鲁花14号，购自中国农业科学院；2.花生根瘤菌菌种05272，购自中国农业大学生物学院；3.酵母菌株(由首都师范大学生命科学学院印莉萍教授惠赠)DEY1453 (fet3-2: HIS3/fet3_2 :HIS3, fet4_l: LEU2/fet4_l :LEU2, ade2/+ura3/ura3 trpl/trpl 1 eu2/lue2 his3/his3 canl/canl)DEY1457(MAT ade6 canl his3 leu2.trpl ura3)SMFl(MATa ade2 his3 leu2 trpl ura3 smfl::URA3 ura3::TRP1)ZHY3(MATa ade6 canl his3 leu2 trpl ura3 zrtl::LEU2 zrt2::HIS3)(Vert G. ,Briat J. F. , and Curie C. ,2001, Arabidopsis IRT2 gene encodes a root-periphery iron transporter. The Plant Journal, 26 (2) : 181—189 中包f舌上述酵母 体的使用描述)；4.大肠杆菌DH5 α感受态细胞购自TIANGEN公司；Τ0Ρ10感受态细胞购自 invitrogen 公司；5. pMD20-T购自TAKARA公司；酵母表达载体pDR195由中国农业大学资源与环境 学院袁立行教授惠赠(Thomine S, Wang R, Ward MJ, Crawford 匪，Schroeder JI (2000) Cadmium and iron transport by members of a plant metal transporter family in Arabidopsis with homology to Nrampgenes. Proc Natl Acad Sci USA 97 :4991_4996中 使用该载体进行试验)，PYES2为invitrogen公司产品；6.质粒DNA小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA分子量标准、Amp抗生素 购自天根生物技术公司；T4连接酶、限制性内切酶购自NEB公司；各种氨基酸、鲑鱼精DNA 购自北京拜尔迪公司；Trizol试剂、Super Script II阴性逆转录酶试剂盒、Taq等DNA聚 合酶、3' RACE试剂盒为invitrogen公司产品，5' RACE试剂盒为clonetech产品，RT-PCR 试剂、SYBE GREEN为东洋纺产品；其他主要化学试剂为国产AR级试剂。以下实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海生物工程 公司合成，DNA测序工作由上海英俊生物技术有限公司和上海生物工程公司完成。实施例1花生根瘤Fe (II)转运体蛋白及其编码基因的获得一、花生根瘤材料的获得将花生种子用去离子水洗净，用10%的双氧水浸泡20-30分钟后，用高纯水将种子洗干净，然后放入饱和硫酸钙中浸泡6-7小时，取出种子，洗净摆放在托盘中润湿的吸水 纸上，然后盖上润湿的吸水纸，避光催芽；待种子露白后，将其放入根瘤菌液中浸泡20分钟 (菌液浓度为1 X IO7个细胞/毫升)进行接种，然后将接种后的种子播种于石英砂中，避光 发苗。待花生长出两片子叶后，将花生植株移入促进根瘤形成的低氮营养液中培养，营养液 中各养分含量为ΚΝ03(3· 2mM)、KH2PO4 (1. ImM)、MgSO4 · 7H20 (0. 6mM)、CaSO4 · 2H20 (4. 32mM)、H3BO3 (50 μ Μ)、MnSO4 · 4Η20 (0. 77 μ Μ)、ZnSO4 · 7Η20 (0. 77 μ Μ)、CuSO4 · 5Η20 (0. 3 μ Μ)、
(NH4) 6Μο7024 · 4Η20 (0. 02 μ Μ)、EDTA-Fe (80 μ Μ)，ρΗ 值为 5. 8。培养过程中，保持通气，培养 条件为光照28°C，16h/黑暗22°C，8h。待根瘤形成后，花生停止供铁，缺铁三天后取根瘤样 品，液氮速冻，_80°C保存。二、花生根瘤总RNA的提取和cDNA第一条链的合成1.花生根瘤总RNA提取采用Trizol法。
2. cDNA第一条链的合成(1)用于AhDmtl基因cDNA中间片段及全长序列扩增的cDNA第一条链是利用 invitrogen公司的Super ScriptII阴性逆转录酶试剂盒，以Oligo (dT)15为引物，42°C进 行RT-PCR合成。(2)用于AhDmtl基因5，端cDNA序列扩增的cDNA第一条链是利用clonetech RNA 反转录5，末端交换机制cDNA末端快速克隆试剂盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)合成，用于5' RACE的预备cDNA。具体合成方法如下向离心管中加入以下混合物， 轻轻混勻，简短离心收集混合物，反应混合物如表1所示表 1 70°C加热2分钟，然后置于冰上2分钟；简短离心约10秒，收集混合物于管底，力口 入表2中的反应混合物表2
反应混合物_体积(μ ) 轻轻吹吸混勻以上反应液，简短离心后42°C温浴1.5小时，然后加入ΙΟΟμ 1 Tricine-EDTA缓冲液[N-三(羟甲基)甲基甘氨酸-乙二胺四乙酸缓冲液]稀释反应产 物，最后72°C加热7分钟，终止反应。-20°C保存合成的cDNA样品，用于AhDmtl5，端cDNA 片段的扩增。(3)用于AhDmtl基因3，端cDNA序列扩增的cDNA第一条链是利用InvitrogencDNA-3，末端快速克隆试剂盒(3' RACE system ForRapid Amplification of cDNA Ends) 合成的。具体合成方法如下首先，向离心管中加入表3中的反应混合物表3 轻轻混勻，简短离心后收集反应物，70°C水浴加热10分钟，冰上冷却至少1分钟， 然后加入表4中的反应混合物表 4 轻轻混勻，简短离心后，42°C水浴3分钟，加入1 μ 1 Super Script阴性逆转录酶， 42°C水浴50分钟，70°C水浴15分钟，冰上冷却，简短离心后，加入1 μ 1 RNase H，37°C水浴 20分钟，结束反应，-20°C保存。三、AhDmtl基因cDNA序列的克隆1.引物设计以大豆根瘤GmDmtl基因cDNA序列为基础，通过对GmDmtl与其所属NRAMP基因 家族中其它同源基因进行蛋白序列比对分析，找到该基因家族在不同植物中高度保守的蛋 白序列区域，然后根据分子进化和比较基因组学的原理，选用GmDmtl基因中高度保守区域 对应的cDNA序列设计同源专一性外侧(WF1、WR1)和内侧(NFl、NRl)双重嵌套引物，通过 两轮嵌套式PCR从花生根瘤中扩增出AhDmtl基因的cDNA中间片段；然后根据获得的cDNA 片段分别设计扩增3，端和5，端cDNA序列的基因专一性引物(3GSP、5GSP)配合3' RACE、 5' RACE(3‘ and 5' RACE system For Rapid Amplification of cDNA Ends 3，/5，_cDNA 末端快速克隆试剂盒)试剂盒中提供的引物，分别扩增得到花生根瘤AhDmtl的3'端cDNA 片段和5'端cDNA片段，最后将上述经测序证实的花生根瘤AhDmtl的5'端cDNA片段、中 间片段和3'端cDNA片段进行比较分析，利用DNA和蛋白翻译序列(DNAman程序)发现重叠 序列后拼接得到包括5' UTR，ATG-TGA和3' UTR-poly(A)的AhDmtl正确的全长cDNA，最后 根据该拼接后的序列设计基因专一性引物(Dmt-F、Dmt-R)，用于PCR获得花生根瘤AhDmtl 完整的cDNA序列，具体引物序列如表5所示表5
2. PCR反应体系(I)AhDmtl基因cDNA序列片段的获得以上述反转录获得的花生根瘤cDNA第一条链为模板，同源专一性外侧(WF1、WR1) 和内侧(NF1、NR1)双重嵌套引物，PCR扩增AhDmtl基因cDNA序列片段，PCR反应体系如下第一步利用外侧引物进行第一轮PCR扩增，反应体系(50 μ 1)如表6所示表6 将各反应物混勻后进行PCR，PCR反应条件为先94°C预变性4min ；92°C变性30S ； 45°C退火30S ；72°C延伸2min ；40个循环；最后72°C延伸lOmin。
第二步以第一轮PCR产物为模板，利用内侧引物进行第二轮PCR扩增，反应体系 (50 μ 1)如表7所示表 7 将各反应物混勻后进行PCR，PCR反应条件为94°C预变性4min，92°C变性30S ； 45°C退火30S ；72°C延伸2min ；40个循环；最后72°C延伸lOmin。经过上述两轮PCR扩增，获得大概860bp的目的基因片段(图1，A为第一轮PCR 产物；B为第二轮PCR产物，M为DNA Markerl00bp-1500bp)，与预期的GmDmtl ；1同源基因 大小接近，将此PCR产物片段纯化回收后，通过克隆载体pMD20-T，转化至E. coli的DH5 α 感受态细胞中进行目的基因克隆，测序分析。将所得花生cDNA序列在NCBI中进行同源序列比对分析(Blast)表明，该序列与 大豆(GmDmtl ； 1) cDNA保守一致性为82%，蛋白序列高达89%，说明花生中该基因片段与大 豆具有很好的同源性，也证明了花生根瘤中存在促进铁的跨膜吸收和利用(GmDmtl ；1)的 同源基因。(2) AhDmtl基因5，端cDNA序列的获得利用clonetech RNA反转录5’末端交换机制cDNA末端快速克隆试剂盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)试剂盒通过 5' RACE 的方法获得 AhDmtl 5，端 cDNA 片段。 PCR反应体系如表8所示表 8 将各成分混合后进行PCR反应，程序如下1.变性94°C5min (预变性)2.变性94°C30s (变性)3.延伸72 °C3min (延伸)4.返回至2(5个循环)5.变性94°C30s (变性)6.退火70°C30s (退火)7.延伸72°C3min (延伸)8.返回至5(5个循环)9.变性94°C30s (变性)10.退火68°C30s (退火)11.延伸72°C3min (延伸)12.返回至9(25个循环)13.延伸72°CIOmin (延伸)利用花生专一性引物和5' RACE反应体系经RT-PCR扩增之后，产物通过琼脂 糖凝胶电泳检测得到921bp的专一性片段(图2)，与预测计算的花生理论上应获得cDNA片 段的大小相同，将该cDNA片段纯化回收、进行分子克隆和测序分析。该序列与上述获得的 AhDmtl中间cDNA片段有完全一致的重叠序列(约300bp)，同时将该序列在NCBI数据库中 进行同源性序列比对分析结果表明该序列与大豆(GmDmtl ； 1) DNA —致性为83%，证明该基 因片段为花生AhDmtl 5'端cDNA片段。(3) AhDmtl基因3，端cDNA序列的获得利用Invitrogen cDNA-3，末端快速克隆试剂盒(3 ‘ RACE systemFor Rapid Amplification of cDNA Ends)通过 3' RACE 的方法获得 AhDmtl 3'端 cDNA 片段。PCR 反应体系如表9所示表9 将各成分混合后进行PCR反应，程序为94°C预变性3min ；92°C变性30s ；60°C退 火 30s ；72°C延伸 2min ；40 个循环；72°C延伸 IOmin0 利用花生专一性引物和3' RACE反应体系经RT-PCR扩增之后，产物通过琼 脂糖凝胶电泳检测得到约IOOObp的专一性片段(图3)，与预测计算的花生理论上应获 得cDNA片段的大小相同，将该cDNA片段进行纯化回收，进行分子克隆和测序分析。花生 AhDmtl 3'端cDNA片段测序结果表明，该片段大小为981bp，与上述AhDmtl中间cDNA片段 有完全一致的重叠序列(约300bp)，同时将该序列在NCBI数据库中进行同源性序列比对分 析(Blast)，结果表明该序列与大豆(GmDmtl ； 1) DNA保守一致性为84%，证明该基因片段为 花生AhDmtl 3'端cDNA片段。(4) AhDmtl 基因全长 cDNA (5 ‘ UTR 和 ATG-TGA 和 3 ‘ UTR-poly (A))的获得以上述反转录获得的花生根瘤cDNA第一条链为模板，5' -DMT-F和5' -DMT-R为 引物，PCR扩增AhDmtl基因全长cDNA序列。PCR反应体系如表10所示表10 将各成分混合后进行PCR反应，程序为94°C预变性3min ；92°C变性30s ；45°C退 火 30s ；72°C延伸 2min ；35 个循环；72°C延伸 IOmin0
PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测得到约1900bp的片段(图4)，与理论推 测基因大小相同，将该cDNA片段进行纯化回收，进行分子克隆和测序分析。测序结果表 明，该片段大小为1898bp，该序列包括5'非翻译区(5‘ UTR)、蛋白编码区和3'非翻译区 (3' UTR)。同时将该序列在NCBI数据库中进行同源性序列比对分析(Blast)，表明该序列 与大豆(GmDmtl ； 1)DNA保守一致性为83%，属于NRAMP基因家族。实施例2酵母异源功能互补验证花生根瘤AhDmtl基因功能一.主要试剂配制及培养基配方1.主要试剂配制1. OM LiAC 10. 2g LiAC用稀的冰醋酸调pH至7. 5，加水定容至100ml，121°C灭菌 20min，室温保存；50% PEG :50gPEG3350 加水定容到 100ml，121°C 灭菌 20mins，室温保存；40%葡萄糖40g葡萄糖，加IOOml水，121°C灭菌20mins，4°C保存；IOmM BPDS 0. 1341g BPDS，加水定容至 25ml，过滤灭菌，4°C保存；0. 5MEDTA 3. 6531gEDTA，加水定容至 25ml，121°C灭菌 20min，4°C保存。2.培养基配方(1)细菌培养基LB培养基IOg胰蛋白胨，5g酵母提取物，IOg NaCl，15g琼脂粉(固体)，pH7. 0 ；(2)酵母培养基YPAD培养基20g蛋白胨，IOg酵母提取物，0.04g腺嘌呤半硫酸盐，20g琼脂粉(固 体)，pH 5.8 ；(3)酵母转化子筛选培养基合成完全省却成分培养基(Syntheticcomplete (SC) drop outmedium，缩写为 SD
培养基)配方培养基成分用量(g)酵母氮基(不含氨基酸)6. 7腺嘌呤半硫酸盐、精氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨 0. 05酸、络氨酸苯丙氨酸、色氨酸0.075缬氨酸0.225琼脂粉20高纯水950ml用NaOH调pH值至5. 8，121°C灭菌20min后，待培养基温度降至55°C时，加入50ml 预热的无菌40%葡萄糖。(4)酵母异源互补功能验证培养基DAhDmtl转运二价铁离子功能验证SD+BPDS培养基SD培养基加入IOmM BPDS, 使其终浓度分别为0、55、80、100 μ M，pH为5. 8 ；同时用pH值分别为5、6、7、8，BPDS终浓度为80 μ M的培养基验证该转运体转运铁的过程是否受pH值影响；2) AhDmtl转运二价锰离子功能验证SD+EGTA培养基SD培养基组成同前，再加入(7. 608g EGTA,使其终浓度为20mM, pH值为5. 8 ；3)AhDmtl转运二价锌离子功能验证SD+EDTA培养基SD培养基中加入0.5M EDTA, 使其终浓度分别为0、0. ImM, PH值为5. 8。二.酵母表达载体构建1.引物设计 分析载体pYES2、pDR195以及AhDmtl开放阅读框序列中的酶切位点，选择合适的 限制性内切酶，利用其酶切位点序列设计载体构建的引物。具体引物序列如表11所示表11
构建载体名称 引物名称引物序列酶切位点 下划线标注的核苷酸为使用的酶切位点序列。2.获得两端含有酶切位点序列的AhDmtl开放阅读框序列以实施例1中克隆到的AhDmtl全长cDNA(以质粒形式保存)为模板，用上述引物 进行PCR扩增，反应体系如表12所示表12 将各成分混合后进行PCR反应，程序为94°C预变性3min ；94°C变性30s ；60°C退 火30s ；72°C延伸2min ；30个循环；72°C延伸lOmin。凝胶电泳分离PCR产物，将回收纯化 的目的片段连入PMD20-T载体后，转入DH5 α或TOPlO感受态细胞中，然后筛选阳性克隆菌 株及酶切鉴定，最后测序、分析确定两端酶切位点序列及中间AhDmtl开放阅读框核苷酸序 列完全正确的菌株。用该菌株提取pMD20-T+AhDmtl质粒，用于载体构建。
3. AhDmtl基因酵母表达载体的构建及其鉴定根据上述引入的酶切位点选择相应的内切酶BamH Ι/Sphl或BamH Ι/Notl分别对 质粒pMD20-T+AhDmtl、pDR195和pYES2进行双酶切，将回收到的AhDmtl酶切产物分别与 经相同酶切后的载体用T4DNA连接酶于16°C连接12h，构建含有AhDmtl基因的重组表达载 体，分别命名为PDDl (图5A)、pYDl (图5B)，将连接产物用热激转化法导入DH5 α感受态细 胞中，然后用含有氨苄青霉素的LB平板，370C，培养过夜，初步筛选阳性重组质粒。挑取单 菌落，370C，200rpm振荡培养12h左右，小量提取质粒，以提取的质粒为模板，分别以与其对 应的pYES-F/pYES-R或PDR-F/PDR-R为引物进行PCR扩增，PCR产物经过1 %琼脂糖凝胶 电泳分析均得到了一条约1500bp大小的条带(图6A)，与预期条带大小相符；同时分别用 BamH Ι/sphl或BamH Ι/Notl双酶切对应的质粒，酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析， 分别得到一条约6kb的载体带和1. 5kb的目的条带(图6B)，与预期条带相符，表明重组质 粒构建成功。三.酵母表达载体转化及成功转化子的筛选1.表达载体转入各酵母菌株首先，将待转化酵母接种到5ml液体(2\八 々0培养基中，于301，200印111条件下 振荡培养过夜。次日，计数过夜培养物细胞密度，以最终5X IO6个/ml的细胞密度(0D·= 0. 5)接种到50m YPAD培养基中，置于30°C，200rpm振荡培养至2 X IO7个细胞/ml (OD600 = 2)后，3000g离心5min收集细胞，弃去上层培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再离心收 集细胞，弃水，把细胞悬浮在Iml无菌水中，转移至无菌的1.5ml离心管中，离心，去上清，再 加入Iml无菌水悬浮细胞，根据转化需要的量分装细胞悬液，再次离心l-2min沉淀细胞，用 微量移液器小心吸出上清，然后，加入表13中的转化混合液表13剧烈振荡每个反应管直到细胞完全混勻后，置于42°C水浴中热激至少40min，然 后高速离心30sec，用微量移液器除去转化混合液，吸0. 2-1. Oml无菌水加到每个反应管 中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。用等份的100-200μ 1转化混合液涂布在合成完全 省却成分培养基选择平板上，28-30°C培养2-4天，待单菌落长出后，挑取单菌落接种在合 成完全省却成分液体培养基中，于30°C，200rpm条件下振荡培养。将上述质粒PDR195、pYES2转入DEY1457野生型酵母菌株作为正对照，质粒 pDR195、pYES2转入酵母突变株DEY1453、SMFU ZHY3作为负对照，构建的AhDmtl酵母表达质粒pYDl、pDD转入酵母突变体DEY1453、SMF1、ZHY3作为功能验证菌株。2.菌落PCR筛选成功转化子取20 μ 1菌液，离心弃去培养基，用无菌水洗1-2遍，加入10 μ 1无菌水，煮沸 3min，然后离心取上清液约2μ 1进行PCR反应。PCR反应体系、反应程序与酵母表达载体 构建中所用的PCR反应体系及反应程序相同。通过PCR筛选，最终得到分别转入pDR 195、 PYES2质粒的DEY1457、DEY1453、SMFU ZHY3的八个菌株以及分别转入pYDl、pDDl质粒的 DEY1453、SMF1、ZHY3 的六个菌株。
四.酵母异源功能互补验证AhDmtl转运二价金属离子的功能用新鲜合成完全省却成分培养基活化、摇培上述各成功转化的酵母菌株，待菌液 OD值约等于IdXlO7个细胞/ml)时，将各菌株的菌液按细胞密度(0D值)分别做10倍梯 度稀释，然后按顺序将菌液分别点布在相应的酵母异源互补功能验证培养基上，于28°C培 养3-4天，观察并记录各菌株的生长情况。以转入pDR195、pYES2质粒的DEY1457野生型酵 母菌株为正对照，转入pDR195、pYES2质粒的DEY1453、SMF1、ZHY3酵母突变株为负对照，观 察转入pYDl、pDDl质粒的DEY1453、SMFl、ZHY3酵母菌株的生长情况，确定AhDmtl转运不 同二价金属离子的能力。1. AhDmtl转运二价铁离子能力的功能验证在含有不同浓度BPDS (Fe2+螯合剂)的合成完全省却成分培养基上验证AhDmtl转 运二价铁离子能力。结果表明，随着BPDS浓度的增大，即培养基中Fe2+的含量不断减少，无 论是用PDR195还是pYES2作为表达载体进行功能验证，都可以观察到转入空质粒的酵母生 长逐渐受到抑制，而转入AhDmtl基因的酵母生长良好(图7)，说明AhDmtl具有转运Fe2+的 能力，是一个高亲和的Fe2+转运体蛋白；而且当含有80μΜ BPDS的SC培养基ρΗ值由5升 高到8时，野生型酵母正常生长的情况下，转入AhDmtl的酵母突变株的生长逐渐受到抑制， 最后与负对照一样，其转运功能完全丧失(图8)，说明AhDmtl转运铁的过程是质子依赖的， 有研究表明，质子的存在一方面可以改变膜表面的电化学势，另一方面可以提高AhDmtl转 运体对二价金属离子的亲和能力。2. AhDmtl转运二价锰离子能力的功能验证在含有20mM EGTA(Mn2+螯合剂)的合成完全省却成分培养基上，用pDR195、pYES2 作为表达载体进行功能验证得到相同的结果，即当培养基中锰离子浓度很低时，转入空质 粒的酵母突变株SMFl生长状况明显差于转入AhDmtl基因的酵母突变株SMFl (图9)，说明 AhDmtl具有转运Mn2+的能力，是一个高亲和的Mn2+转运体蛋白。3. AhDmtl转运二价锌离子能力的功能验证在不含EDTA螯合剂的SC培养基上，无论转入空质粒还是转入AhDmtl基因的酵母 都能生长，二者长势没有明显的差异，但加入0. ImMEDTA后，野生型酵母能够正常生长，而 转入空质粒或AhDmtl基因的酵母突变体生长都受到很明显的抑制，基本上失去了生长活 性(图10)，表明AhDmtl转运体的存在并不能改善转运锌能力缺失的酵母突变体的生长，进 而说明AhDmtl不具备转运锌的能力。实施例3花生不同器官中AhDmtl基因的表达分析水培花生并接种根瘤菌诱导结瘤，具体方法同前，分别提取花生叶片、根、根瘤的 总RNA，DNaseI去除DNA污染后，紫外分光光度计分别测定不同器官RNA的含量，取等量的上述RNA，反转录成单链cDNA。以该单链cDNA为模板，以花生18S rDNA作为内参，扩增引 物为18S-F :5’ -CCGTCTCAAACAAGAACAAAACC-3，，18S-R :5’ -TCACACCAAGTATCGCATTTCG-3，； 花生 AhDmtl 的 PCR 扩增引物为QDMT_F1 :5，-GTGCTGTTTCCTTTTCGCCTTG-3，，QDMT-Rl 5，-AGTGTATCCATTGAAAGTCTTGAGT-3，，通过RT-PCR分析AhDmt 1基因在花生不同器官中的表 达情况。分析的仪器是ABI7000荧光定量PCR仪，定量分析反应体系如表14所示表14
反映程序50°C预热2min ；95°C预变性 Imin ；95°C变性 30sec ；60°C退火 30sec ； 72°C延伸45sec ；40个循环；反应结束。分析每个样品的扩增曲线，获得每个样品的Ct值， 根据公式AhDmtl相对表达量=2[ct(25s)-ct(dmtl)]计算出该基因在花生不同器官中的表达量， 每个样品重复3次。分析结果表明=AhDmtl基因主要在花生根瘤表达，而在花生叶片和根 表达要弱的多(图11)，说明AhDmtl主要在花生根瘤中转运二价金属离子。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
花生根瘤Fe(II)转运蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的花生根瘤Fe(II)转运蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有如SEQID No. 2所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因或其片段的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主。
6.含有权利要求2或3所述基因或其片段的转化植物细胞。
7.权利要求2或3所述的基因或其片段在提高植物铁的利用效率和根瘤固氮能力中的应用。
8.一种用于扩增权利要求1所述的花生根瘤Fe (II)转运蛋白编码基因的引物，包括 正向引物 5 ‘ -DMT-F 5 ‘ -ACGCGGGGGAGCATAAATGTGGAAACACCACTAGCAT-3 ‘，以及反向引物 3' -DMT-R 5' -AACTATGATGTTCAAAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'。
全文摘要
本发明提供了一种花生根瘤Fe(II)转运蛋白及其编码基因，所述花生根瘤Fe(II)转运蛋白具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其编码基因具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明提供的花生根瘤Fe(II)转运蛋白及其编码基因，揭示了豆科植物与根瘤菌共生固氮过程中铁元素的转运、利用方式，为通过基因工程技术提高豆科植物铁利用效率、发挥根瘤高效固氮潜力提供了必要的理论依据和技术支持，具有较大的应用前景。
文档编号A01H5/00GK101838321SQ201010196538
公开日2010年9月22日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者左元梅, 张福锁, 熊宏春, 王朋飞, 申红芸 申请人:中国农业大学