专利名称：三倍体高甜苷罗汉果培育技术的制作方法
技术领域：
本发明结合植物组织培养、多倍体诱导和遗传育种杂交技术，培育获得三倍体高甜苷罗汉果，属现代生物技术领域。
背景技术：
罗汉果果实性凉味甘，有清热润肺、凉血、润肠通便的功效，特别是其中罗汉果甜苷V甜度约为蔗糖的300倍，是肥胖病人、糖尿病病人、高血压病人理想的食品添加剤，它集天然甜味剂与保健品于一体，被国际公认为综合性状最佳的天然甜味剂。罗汉果被认为是ー种非常有潜力的甜味植物品种。长期以来，由于罗汉果落后栽培技术，病毒病害严重，品种退化，导致罗汉果资源稀缺。近十年，经过脱毒技木，罗汉果组培繁殖快速发展起来，但发现组培苗果实中籽粒多且大，不含甜苷成分的种子占整果的50%，整果利用率低，果实种子内的油脂使提取液浑浊，増加了提取难度和成本，二倍体罗汉果甜苷的提取仅在1%左右。品种缺陷造成提取得率低的问题很难通过改进提取エ艺来得到解决，使得甜苷价格昂贵，仅能在高端产品中使用。这ー问题制约了罗汉果种植业及其加工业的发展。 采用现代生物技术培育罗汉果苷含量高、果实结籽减少或无籽优良罗汉果品种，对罗汉果产业发展意义重大。通过人工诱导多倍体是现代育种工作的ー个重要手段。植物多倍体中含有较多的染色体组数，往往在体型上表现出巨大性和高抗逆境能力，而且多倍体植物在品质和生物量上，都较二倍体优越。特别是植物三倍体具有不结籽的特性，是解决罗汉果多籽缺陷的最有效途径。中国专利申请CN101120653B公开了无籽罗汉果及其培育方法，通过I)取二倍体罗汉果雌、雄株外植体繁育组培苗；2)取组培继代苗，进行染色体加倍的诱导；3)切取经诱导处理后的雌、雄株的不同部位进行分化培养；4)切取分化培养成的新芽茎尖和茎段进行丛生芽培养；5)将培养成的完整植株进行染色体数目检测，筛选出四倍体植株进行生根培养、炼苗；6)将四倍体植株和二倍体植株按常规技术种植，开花时进行人工授粉杂交，得到杂交种子；7)将杂交种子繁殖成完整植株，进行染色体数目检测；筛选出三倍体植株,生根培养、炼苗；8)将三倍体植株和二倍体植株种植，开花时用二倍体雄株对三倍体的雌株人工授粉，雌株挂果后得到无籽罗汉果。本发明人通过长期研究发现，上述技术存在获得的四倍体和三倍体的不稳定问题，(能否进ー步说明ー下其不稳定的表现)，并且在其技术流程中经秋水仙素处理，结合丛生芽诱导，获得四倍体的周期长，嵌合率高，重复性差，影响了该项技术的推广应用。本发明采用幼胚获得脱毒组培苗，嫩芽茎尖直接在秋水仙素培养基上诱导染色体加倍，结合流式细胞重复鉴定分析，获得稳定四倍体，进而与二倍体杂交获得稳定三倍体，大大缩短了四倍体诱导周期，使该项技术的生产应用成为可能，本技术将通过大幅提高甜苷含量和整果利用率，迅速解决甜苷价格昂贵的瓶颈问题，促进罗汉果甜苷售价大幅降低和广泛应用于饮料、食品、保健品、药品等行业(取代有副作用的其他甜味剂)，经济效益可观。
发明内容
本发明的目的是提供ー种适用于三倍体高甜苷罗汉果培育的生产技木。本发明三倍体高甜苷罗汉果的培育方法，具体步骤如下
I、取田间表型好的罗汉果鲜果，在超净台中进行整果消毒先用75%こ醇消毒5-8分钟，再用20%次氯酸钠消毒15-20分钟，最后无菌水冲洗3-5次。2、消毒完毕的整果在超净台中破壳，取出罗汉果种籽，于培养皿中剥出种仁，并将种仁放置于MS培养基中光照培养,诱导出芽。3、待芽长至15-20天左右，切取2-3片嫩叶提取DNA，RFLP分析进行雌雄株鉴定。鉴定为雌株(见附图I)的株系切取嫩芽茎尖，O. 2%秋水仙素诱导48-52小时，诱导后于MS 培养基上继续培养。CTAB法提取罗汉果基因组DNA方法如下
A.1//2U/3片叶在液氮中研成粉末(或用打样机)；
B.将样品放入液氮冻过的EP管中，加65°C预热2XCTABIml ；
C.65°C 水浴 Ih ；
D.カロ入等体积的酌·:氯仿:异戍醇(2524 :1)抽提,离心IOOOOrpm, IOmin,取上清；
E.加入等体积异丙醇，_2(TC沉淀20-30min；
F.IOOOOrpm离心IOmin,倒掉上清,70%こ醇，IOOOOrpm, IOmin,倒掉上清,晾干；
G.加30-50ul dd H2O 水溶解，-20°C 保存；
RFLP分析PCR扩增反应体系(20ul)如下
水13. 2ul
IOXbuffer 2 ul dNTP0.4ul
引物Iul
TaqO. 4ul
DNA3ul
RFLP分析PCR扩增程序
950C 3min,94°C 30sec, 32-36°C 60sec,72°C 90sec，30 个循环，72で 10min，4°C。
4、切取秋水仙素诱导30-40天左右的嫩芽叶片1-2片，进行细胞流式分析并且重复3次以上均鉴定为四倍体(见附图2)的株系继续培养。流式细胞术检测方法如下
(I)配制缓冲液
A.缓冲液I (配制后室温保存)45mmol/L MgCl2 ;30mmol/L朽1檬酸三钠；20mmol/LMOPS ；0.1% (w/v) TritonX-100 ；pH 7. 0。100ml 缓冲液 I :
MgCl2 0. 915g
ニ水柠檬酸三钠(λ 882g
MOPS 0.419g
TritonX-100 94ulB. PI 染液50 ug/ml PI 和 50 ug/ml Rnase (RNA 酶)的缓冲液 I。(2)取半片或者I片嫩叶，加入Iml冰冷缓冲液于培养皿，用刀片迅速快速切碎，过40um细胞过滤器到I. 5ml离心管,放置冰上,500rpm离心5min,弃上清至O. Iml刻度(即留少量液体)，加入500ulPI染液，放置冰上，避光。用流式细胞仪进行检測。5、将获得的四倍体雌株与商品性质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，45-60天左右，采集幼叶进行流式细胞仪和RFLP分析。6、流式细胞仪和RFLP分析为三倍体雌株(见附图3)的脱毒苗于次年春天种植后，与商品性质优良的二倍体雄株杂交，挂果后即得到三倍体无籽罗汉果(见附图4)。三倍体无籽罗汉果果实表型普遍偏小，果型正常。果实与对照相比表现为高度不育，果实内结几颗种籽至无籽。7、三倍体高甜苷罗汉果总甜苷含量測定 (I)标准溶液配制精密称取罗汉果甜苷VI 10. Omg于5ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至5ml,即标准溶液的浓度为2. Omg/mlo(2)样品溶液配制精密称取干燥的罗汉果粉末lg，置索氏提取器中，加入甲醇50ml，浸泡过夜，再加入甲醇40ml，提取6h，溶剂回收至干。以甲醇溶解，定容至25ml，精密吸取上清液10ml，置蒸发皿中水浴蒸干。以20ml蒸馏水分次溶解(15ml溶解，5ml洗涤)，并全部转移至IOgAB-S吸附树脂内(こ醇浸泡，用时抽滤，称重)，控制流速，使缓慢流下，先用50ml蒸馏水慢慢洗去杂质，然后用90%こ醇溶液30ml洗脱，收集醇液，水浴蒸干，残渣以甲醇溶解，定容至IOml,备用。(3)标准曲线精确吸取罗汉果甜苷标准品溶液30、60、90、120、15(^1，分别加AlOml的容量瓶中，水浴挥尽溶剂，加新配制的香草醛_5 %冰醋酸溶液O. 2 ml，高氯酸
0.8ml，于60で水溶加热15 min后取出，立即以冰水冷却，加冰醋酸5 ml，并摇匀，静置10 min后，于5 9 O n m处测定吸光度，并以标准品罗汉果甜苷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制成标准曲线，求得该标准曲线的回归方程为Y=0. 0137Χ-0. 0163 (R2=O. 9991)
(4)罗汉果中总甜苷含量測定精密吸取样品液150μ 1，置容量瓶中，挥干溶剂，加入5%香草醛-冰醋酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，60°C水浴加热15min，立即以冰水浴冷却，カロ入5ml冰醋酸，摇匀，IOmin后測定，其测定波长λ =590nm，以随行树脂柱为空白，并根据标准曲线计算出总甜苷含量。8、三倍体无籽罗汉果成熟果实中罗汉果苷含量3-5%之间，罗汉果的整果利用率增加45%以上，罗汉果苷含量增加80%以上。
图I为罗汉果雌雄株的鉴定图。
图2为流式细胞技术对罗汉果多倍体的倍性鉴定结果图。
图3为流式细胞技术对罗汉果三倍体的鉴定图。
图4为无籽罗汉果图。
具体实施例方式实施例I
I、取田间表型好的罗汉果鲜果，在超净台中进行整果消毒先用75%こ醇消毒5分钟，再用20%次氯酸钠消毒15分钟,最后无菌水冲洗3次。2、消毒完毕的整果在超净台中破壳，取出罗汉果种籽，于培养皿中剥出种仁，并将种仁放置于MS培养基中光照培养,诱导出芽。3、待芽长至15天，切取2片嫩叶提取DNA，RFLP分析进行雌雄株鉴定。鉴定为雌株的株系切取嫩芽茎尖，O. 2%秋水仙素诱导48小时，诱导后于MS培养基上继续培养。4、切取秋水仙素诱导30天左右的嫩芽叶片2片，进行细胞流式分析并且重复3次以上均鉴定为四倍体的株系继续培养。5、将获得的四倍体雌株与商品性质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，45天时，采集幼叶进行流式细胞仪和RFLP分析。6、流式细胞仪和RFLP分析为三倍体雌株的脱毒苗于次年春天种植后，与商品性 质优良的二倍体雄株杂交，挂果后即得到三倍体高甜苷无籽罗汉果。7、罗汉果中总甜苷含量測定精密吸取样品液150μ 1，置容量瓶中，挥干溶剂，カロ入5%香草醛-冰醋酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，60°C水浴加热15min，立即以冰水浴冷却，加入5ml冰醋酸，摇匀，IOmin后測定，其测定波长λ =590nm，以随行树脂柱为空白，并根据标准曲线计算出总皂苷含量。三倍体无籽罗汉果中平均总甜苷含量为3. 69%，二倍体商品果中平均总甜苷含量为2. 01%，甜苷含量提高83. 6%。实施例2
I、取田间表型好的罗汉果鲜果，在超净台中进行整果消毒先用75%こ醇消毒8分钟，再用20%次氯酸钠消毒20分钟，最后无菌水冲洗5次。2、消毒完毕的整果在超净台中破壳，取出罗汉果种籽，于培养皿中剥出种仁，并将种仁放置于MS培养基中光照培养,诱导出芽。3、待芽长至20天，切取3片嫩叶提取DNA，RFLP分析进行雌雄株鉴定。鉴定为雌株的株系切取嫩芽茎尖，O. 2%秋水仙素诱导52小时，诱导后于MS培养基上继续培养。4、切取秋水仙素诱导40天左右的嫩芽叶片2片，进行细胞流式分析并且重复3次以上均鉴定为四倍体的株系继续培养。5、将获得的四倍体雌株与商品性质优良的二倍体雄株杂交，秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，60天时，采集幼叶进行流式细胞仪和RFLP分析。6、流式细胞仪和RFLP分析为三倍体雌株的脱毒苗于次年春天种植后，与商品性质优良的二倍体雄株杂交，挂果后即得到三倍体高甜苷无籽罗汉果。7、罗汉果中总甜苷含量測定精密吸取样品液150μ 1，置容量瓶中，挥干溶剂，カロ入5%香草醛-冰醋酸溶液O. 2ml，高氯酸O. 8ml，60°C水浴加热15min，立即以冰水浴冷却，加入5ml冰醋酸，摇匀，IOmin后測定，其测定波长λ =590nm，以随行树脂柱为空白，并根据标准曲线计算出总甜苷含量。三倍体无籽罗汉果中平均总甜苷含量为3. 63%，二倍体商品果中平均总甜苷含量为I. 92%，甜苷含量提高89. 1%。
权利要求
1.ー种三倍体罗汉果的培养方法，其步骤依次如下 a)取罗汉果鲜果进行整果消毒，将其幼胚诱导出芽并制成脱毒苗； b)RFLP分析鉴定出脱毒苗的雌株，对其进行多倍体诱导及细胞流式分析； c)将获得的稳定四倍体雌株与二倍体雄株杂交，获得果实； d)将果实内的杂交种籽繁殖成植株，流式细胞仪和RFLP分析为三倍体雌株的脱毒苗种植后，与二倍体雄株杂交，挂果后即得到三倍体高甜苷无籽罗汉果。
2.权利要求I所述的培养方法，其特征在干步骤a)中，整果的消毒先用75%こ醇消毒5-8分钟，再用20%次氯酸钠消毒15-20分钟，最后无菌水冲洗3-5次。
3.权利要求I或2中所述的培养方法，其特征在干步骤a)中，消毒完毕的整果在超净台中破壳，取出罗汉果种籽，于培养皿中剥出种仁，并将种仁放置于MS培养基中光照培养，诱导出芽。
4.权利要求I或2所述的培养方法，其特征在干步骤b)中，多倍体的诱导是将雌株的株系切取嫩芽茎尖，用O. 2%秋水仙素诱导48-52小时，诱导后于MS培养基上继续培养。
5.权利要求I或2所述的培养方法，其特征在于步骤c)中，稳定四倍体是通过切取秋水仙素诱导30-40天左右的嫩芽叶片1-2片，进行细胞流式分析鉴定获得。
6.权利要求I或2所述的培养方法，其特征在于步骤d)中，种籽播种于营养钵内后，45-60天左右，采集幼叶进行流式细胞仪和RFLP分析。
7.ー种无籽罗汉果，由权利要求1-5任一所述的方法培育而成。
8.一种无籽罗汉果的组织器官，由权利要求1-5任一所述的方法培育而成。
9.一种无籽罗汉果的细胞，由权利要求1-5任一所述的方法培育而成。
全文摘要
本发明将公开一种甜苷含量和整果利用率高的三倍体罗汉果的培育方法，其步骤如下1)取田间表型好的罗汉果鲜果，整果消毒，将其幼胚诱导出芽并制成脱毒苗；2)脱毒苗RFLP分析鉴定出的雌株进行多倍体诱导及细胞流式分析；3)将获得的稳定四倍体雌株与商品性质优良的二倍体雄株杂交；4)秋季收获果实并将果实内种籽播种于营养钵内，流式细胞仪和RFLP分析为三倍体雌株的脱毒苗种植后，与商品性质优良的二倍体雄株杂交，挂果后即得到三倍体高甜苷无籽罗汉果。
文档编号A01H4/00GK102812902SQ20111037522
公开日2012年12月12日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者刘敬梅, 夏勉, 游览, 谢莹 申请人:未名兴旺系统作物设计前沿实验室(北京)有限公司