专利名称：枳抗寒转录因子PtrICE1及其在植物抗寒改良中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及ー种从积(Poncirust rifoliata)中分离、克隆得到一个编码MYC类型的bHLH (basic helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋)家族转录因子的基因PtrlCEl，还涉及一种枳抗寒转录因子PtrICEl基因在植物抗寒改良中的应用，将该基因转化烟草和柠檬，获得的转基因植株抗寒能力明显提高。
背景技术：
自然界中，植物生长在ー个开放的环境中，经常会受到恶劣环境如寒冻、高温、干旱、水涝和高盐等逆境的胁迫。低温是植物区域性和季节性的主要生态限制因子，低温冷害是农业生产的ー种严重的自然灾害。因此，弄清植物寒冻损伤及其抗寒性机理具有非常重要的理论意义和实践价值。事实上，植物在漫长的演变过程中，已经建立了一套应答逆境胁迫的机制，涉及到植物对逆境信号的感受、逆境信号的传递，以及相应受体对逆境信号的识别与转导等三个阶段，此过程受ー个错综复杂的信号通路调控。近年来，国内外在植物抗冻方面开展了大量工作，研究结果表明冷诱导基因在植物抗低温和冷驯化过程中起着重要的作用(Th omashow，1999)。这些冷诱导基因编码的产物可以分为两类，一类是与植物抗寒性的提高直接相关的功能性蛋白，比如一些涉及脂类代谢、糖代谢以及抗氧化的酶，分子伴侶，抗冻蛋白，其它起渗透调节作用的物质；另一类是调控性蛋白，參与寒冷信号传导的调控、抗寒基因表达的调控和抗寒蛋白活性的调节(Shinozaki andYamaguchi-Shinozaki 2007 ；Lata and Prasad, 2011 ;Qin 等，2011)。大多数冷和干旱响应的基因在它们的启动子里都有ー个或多个DRE/CRT顺式作用元件，它的核心序列是CCGAC。ー个被称之为CBF/DREBls的转录因子家族能够结合这个核心元件井能激活或诱导下游干旱或低温响应基因的表达，但是这类转类因子它们自身却是受低温的诱导然后才就进一步诱导含有DRE/CRT作用元件的下游基因的表达。因此，低温胁迫下的基因表达网络是ー个级联连锁反应过程。CBFs或DREBls基因的超表达，可在室温下启动下游基因的表达，并提高转化植物的耐寒能力。由于CBF/DREB1的转录是在将植物置于低温15Min后才开始的，Gilmour等(1998)提出了一种假说可能在常温的情况下那里已经有ー个转录因子，可能识别CBF的启动子并诱导其表达但在常温的情况下是以非活化的状态存在的，Gilmour将这个未知的转录因子称之为ICE1，并假设将植株置于低温的条件下，修饰ICEl或者与其互作的蛋白并允许ICEl结合到CBF的启动子并诱导CBF的表达。HOSl基因编码ー种环指泛素E3连接酶，它可以与ICEl蛋白结合并參与调控ICEl的泛素化降解，它是ICEl及其下游目标基因的负调控因子(Dong等，2006).在低温的过程中，SIZl蛋白起着SUMO E3连接酶的作用，在冷驯化的过程中，SIZl可以促进SUMO蛋白与ICEl蛋白的赖氨酸(K393)位点结合，从而阻止ICEl的泛素化降解，提高ICEl的稳定性并激活ICEl蛋白(Mi ura等，2007)。拟南芥的转录组分析结果表明，在ICEl功能缺失型突变体中，939个拟南芥冷响应基因中有369个(39. 3%)表达水平发生了变化。其中133个编码冷响应转录因子的基因中有52个(39. 1%)表达水平发生了变化。另外，ICEl基因是组成型表达，但它的超表达可在低温下增强CBF3的转录表达并提高转基因植株的耐寒能力。因此，ICEl基因在拟南芥的抗寒中起着关键性的调控作用。Lee等(2005)采用基因芯片的方法从整个转录组水平上研究了 ICEl在拟南芥耐寒及其在基因表达调控中的作用，icel突变体影响了ー些低温胁迫早期应答基因以及受ABA或生长素调控基因的表达，进ー步验证了 ICEl在植物低温胁迫应答中起着关键性的核心作用。迄今，ICEl基因已从拟南芥(Chinnusamy 等，2003)、芥菜(Wang 等，2005)、杨树(Lin 等，2007)、小麦(Badawi 等，2008)、茶(Wang等，2012)、苹果(Feng等，2012)中分离得到。枳是柑橘产业中应用较广泛的ー种砧木，极抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有关抗寒基因克隆问题的通想材料。因此，克隆积抗寒有关基因是抗寒基因工程的关键和基础。
发明内容
本发明目的在于提供了一种从积(Poncirus trifoliata)中分离克隆的抗寒 转录因子基因，此基因可编码MYC (myelocytomatosis oncogene)类型的bHLH (basichelix-loop-helix，碱性螺旋-环-螺旋)家族转录因子，申请人将此基因命名为PtrlCEl，其序列为SEQ ID NO. I所示。本发明另ー个目的是提供了一种从积(Poncirus trifoliata)中分离克隆的转录因子基因在植物抗寒改良中的应用，通过农杆菌介导遗传转化方法将该转录因子转化烟草和柠檬，获得的转基因植株经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICEl基因具有调控抗寒功能。为了实现以上目的，本发明采用以下技术方案申请人:利用植物基因克隆技术从枳中克隆得到ー个新基因PtrICEl，一种分离的PtrICEl基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO :I所示，其中161_1840bp处为该基因的编码区，包含1680bp的开放阅读框；编码559个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:2所示，等电点为5. 27，分子量为61kD。申请人:设计了克隆上述基因PtrICEl的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示正向引物5，-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3，，即SEQ ID NO. 3 ；反向引物5’ -ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3，，即 SEQ ID NO. 4。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICEl基因具有调控抗寒功能。在本发明的实施例部分，我们阐述了枳PtrICEl转录因子的分离、功能验证和应用。与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果l、PtrICEl基因的发现，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。2、通过农杆菌介导遗传转化方法将该转录因子转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICEl基因具有调控抗寒功能。
图I为一种本发明的技术流程示意图。图2为一种本发明的PtrICEl基因在脱水、低温和盐胁迫下的表达示意图。其中图2A是本发明的基因在枳田间苗(未转基因)室温下脱水不同时间点的表达模式；图2B是枳的田间苗(未转基因)在4°C处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明的基因相对表达量；图2C是枳的田间苗(未转基因)在200mM氯化钠处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量。
图3为一种本发明的PtrICEl基因亚细胞定位示意图。其中图3A，GFP基因(对照)在明场(图左)、紫外线(UV)光(中)下的成像，右图为二者叠加后的成像；图3B，PtrICEl基因在明场(左)、UV光(中)下的成像，右图为二者叠加后的成像。图4为一种本发明的PtrICEl基因转录激活鉴定示意图。其中图4A是空载体(pGBKT7)在不同培养基上的生长情况；图4B是融合载体PtrICEl基因在不同培养基上的生长情况。图5A为一种本发明的实施例3的载体构建流程示意图。图5B为一种pMV载体示意图。图6为一种本发明的PtrICEl基因转化烟草过程示意图。其中图6A，叶片共培养；图6B转基因烟草再生愈伤；图6(，转基因烟草再生芽；图6D，抗性芽伸长；图6E和图6F，抗性苗及植株生根。图7为一种本发明中实施例PtrICEl转化柠檬及植株再生过程示意图。其中图7A是转化后30天的照片；图78是在筛选培养基上生长60天的材料；图7(是抗性芽在伸长增殖培养基上；图7D是再生芽诱导生根。图8为一种PtrICEl基因转基因植株的PCR鉴定示意图。图8A，利用NPTII基因特异引物(上)和基因特异引物(下)PCR鉴定烟草TO代转基因植株。图8B，是采用CaMV35S-PtrICEl特异引物(上)和NPTII基因特异引物(下)对柠檬转基因植株进行PCR鉴定。M =Marker, P :质粒，WT :野生型植株，1-20 :转基因株系。图9为一种PtrICEl基因转基因植株的基因表达量分析示意图。图9A，烟草转基因植株中外源基因PtrICEl的表达量分析(半定量RT-PCR)。CK为野生型，其作为转基因系。图9B，实时定量PCR分析柠檬不同转基因株系中的PtrICEl基因的表达量。WT :野生型植株，其余编号转基因株系。图10为一种本发明中实施例转PtrICEl基因株系(0E22和0E12)及野生型(WT)非转基因植株(WT)低温处理表型和生理指标测定示意图。其中图IOA是30天大的烟草植株在室温生长和4°C处理2天的表型；图IOB是4°C处理2天的植采用NBT (氯化硝基四氮唑蓝)和DAB (二氨基联苯胺)染色，分别指示02-含量和H202含量(染色越深，含量越高)。图IOC是4°C处理后的相对电导率分析结果。图11为一种本发明中实施例PtrICEl转基因株系(0E22和0E12)及野生型植株(WT) _6°C处理2. 5小时的表型和生理指标测定示意图。其中图IlA是生长正常生长的盆栽植株(处理前)。图IlB是_6°C处理2. 5小时后的表型。
图IlC是_6°C处 理2. 5小时的成活率。图12为一种本发明中实施例PtrICEl转基因柠檬两个转基因系(#21和#17)及野生型植株的抗寒性分析。其中图12A是两个转基因系(#21和#17)及野生型植株_6°C处理I. 5小时，然后在25°C恢复4天的表型。图12B是两个转基因系(#21和#17)及野生型植株-6°C处理I. 5小时后的电率率。图12C是采用台盼蓝和氯化硝基四氮唑(NBT)检测WT、#17和#21植株叶片细胞死亡程度(左图)和超氧阴离子含量(右图)。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例1，PtrICEl基因分离克隆及表达分析以ICEl为关键词搜索柑桔EST数据库(HarvEST:Citrus ver. O. 51)，得到I个相近序列，通过序列分析软件(ORF Finder)发现基因ICEl缺少5端编码序列，利用5’ RACE试剂盒(Clontech, Palo Alto, CA, USA)扩增出一个完整的ORF序列，该序列用Primer Premier 5. O 设计引物 GSPl (GSP，5’ -GGCCAGTAACATACCAGTCATCTTCCA-3’ )，用 RT-PCR 方法扩出5’端序列。将扩增的5’端序列及已有的一个ICEl利用软件DNAstar重叠成一条序列。4°C低温处理下从枳叶片抽提RNA及反转录，所得的第一链cDNA用于扩增PtrICEl基因全长。RNA抽提使用Trizol试剂盒(购自TakaRa，Code:D9108A，按照该试剂盒提供的操作说明书操作)，利用抽提的I μ g总RNA样品经IU的DNaseI (购自Fermentas公司)室温处理30分钟后，加入I μ I EDTA(25mM)，于65°C温育10分钟。第一链cDNA的合成用MBI反转录试剂盒(货号K1621,购自Fermentas公司，按照试剂盒说明书操作)。扩增基因PtrICEl 引物对为正向引物PtrICEl Forward, 5，-TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3，；反向引物PtrICEl Reverse, 5，-ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’。50 μ I 的反应体系中包括 200ng cDNA, I X 缓冲液(TransSta rt FastPfuBuffer), IOmM dNTP, IU Taq 聚合酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)(前述缓冲液和Taq聚合酶购自TRANS公司)，1.0μΜ上述引物。PCR反应在ΑΒΙ9700 (AppliedBiosystem)扩增仪上按以下程序完成95°C，I分钟，95°C变性20秒，58°C退火20秒，72°C延伸60秒，40个循环；循环完成后72°C延伸5分钟。产生一条单一 PCR条带产物。产物经1% (g/ml)的琼脂糖凝胶电泳后,用 ,Ζ.ΝΑ*" DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带，提取步骤参照使用说明。回收纯化的DNA溶液与pMD18_T载体(购自宝生物工程大连有限公司即TaKaRa公司)进行连接反应，按说明书操作。连接反应体系中插入PtrICEl基因与pMD18_T载体的摩尔比为3:1连接反应总体积是IOy 1，其中包括5μ I的2Χ缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，4. 5μ I纯化的PCR产物，0. 5μ1 T载体。16°C过夜连接。取10 μ I连接产物，采用热击法(参照《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)转化大肠杆菌DH5a，在含有50mg/L氨苄霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取5个克隆测序(由上海联合基因公司完成)，测序结果表明，本发明克隆PtrICEl基因全长为1650bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO :I所示，通过测序、t匕对确定是本发明需要的目的基因，申请人将这个基因命名为PtrlCEl。PtrICEl基因包括1650bp的编码阅读框，编码549个氨基酸，等电点为5. 27，预测的分子量为61kD。BLASTX分析该序列与已知的(所有已发表的文献和数据库)的植物序列高度同源。推导的PtrICEl基因的氨基酸序列与报道的蓖麻(RcICEl，XP_002511101，70%)、杨树(PtICEl，EF405966，74%)、毛果杨(PsICEl，EF405966，72%)、榛(CsICEl)的序列高度同源(69%)。多序列比对结果显示PtrICEl有C末段保守结构域，bHLH-ZIP结构域，和一个SUMO结构域。ExPASy分析表明编码的氨基酸PtrICEl有二个核定位信号(NLS)。SMART预测氨基酸PtrICEl有一个转录激活区域。为分析PtrICEl基因是否对低温、脱水和盐处理响应，采用实时定量PCR分析该基因在上述处理下的表达。结果表明，，脱水处理(见图2A)和低温(见图2B)盐胁迫处理下该基因表(见图2C)均能诱导该基因表达，表明它是一个逆境应答候选基因。实施例2，PtrICEl基因亚细胞定位和转录激活分析 由于PtrICEl基因有2个核定位信号，本实施例利用洋葱表皮研究PtrICEl基因的亚细胞定位。利用RT-PCR扩增出PtrICEl基因整个0RF，并在其扩增引物两端加上BamHI和Xhol两个酶切位点。首先将扩增产物装在PMD18-T载体上，从而得到一个PMD18-Tb/x_PtrICEl重组载体。同样将GFP编码整个ORF阅读框装在pMD18_T载体上，并在其两端加上BamHI和KpnI两个酶切位点，从而构建了一个pMD18_TB/K_GFP。同时用BamHI和KpnI去切pMD18-TB/x_PtrICEl和pMD18_TB/K_GFP，回收产物并连接，从而构建了一个重组载体，最后将这个重组载体和PMV载体同时用Xhol和KpnI酶切，回收并连接产物，从而得到pBI121-PtrICEl-GFP重组载体。在确认序列无误后，将pBI121_PtrICEl_GFP重组载体及对照载体(PBI121-GFP)用热击法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验手册》第三版，科学出版社，2002)分别转入农杆菌EHA105。农杆菌侵染洋葱表皮按如下方法进行I.划平板，挑单克隆(含有重组质粒的农杆菌)于3ml YEB培养基(含卡那霉素(Km) 40 μ g/ml,利福平(Rif) 25mg/L)，28°C震荡培养 24 小时，至 0D_ 约 O. 6。2.用手术刀将洋葱内表皮划成Icm2大小,撕下置于报道的MS基本培养基(含3%蔗糖，O. 75%琼脂，不含激素)上暗培养24小时。3.按体积比为I :1000比例，接种50 μ I农杆菌菌液于50ml YEB (含Km 40 μ g/ml, Rif 25 μ g/ml)中，28°C振荡培养 12-24 小时。4. 4000rpm,4°C离心 10 分钟，弃上清。5.加入50mlYEB培养基(含有IOmM MgCl2)。将洋葱表皮放入菌液中浸泡30分钟。6.吸干表面菌液，置于MS基本培养基(含3%蔗糖，O. 75%琼脂，不含激素)上28°C培养两天。用Olympus BX61型显微镜观察报告基因(GFP)定位情况。亚细胞定位结果表明含对照载体的农杆菌转化的洋葱表皮细胞中GFP荧光充满整个细胞(图3A)，而含PtrICEl基因载体的农杆菌浸染的洋葱表皮中GFP荧光只在细胞核中(图3B)，证明PtrICEl是核定位基因。利用酵母体系验证本发明基因PtrICEl是否具有转录激活活性。方法如下
首先将PtrICEl基因构建到pGBKT7的GAL4-DB (购自CLONTECH公司)上，得到融合表达载体，(利用RT-PCR扩增出PtrICEl基因整个0RF，并在其扩增引物两端加上NcoI和BamHI两个酶切位点。首先将扩增产物装在pMD18_T载体上，从而得到一个 PMD18-TN/B_PtrICEl 重组载体。同时用 NcoI 和 BamHI 去切 PMD18_TN/B_PtrICEl和pGBKT7，回收产物并连接，从而得到pGBKT7+PtrICEl重组载体)将融合表达载体及空载体(PGBKT7)分别转化酵母菌株AH109 (购自CLONTECH公司)，然后在不同缺失培养基(SD/-Trp/-HiS/-Ade)上培养，从而确定本发明的基因是否具有激活功能。实验结果表明，对照载体转化的酵母细胞在含有3-AT (3-氨基三唑)的培养基上生长完全受到抑制，(图4A)。而当融合载体(有PtrICEl基因)转化酵母细胞后，在所在培养基上均能正常生长，表明PtrICEl确实具有转录激活功能(图4B)。实施例3，植物转化载体构建
根据pMV载体(植物二元转化载体PBI121切除⑶S基因后得到的载体，由华中农业大学园艺林学学院叶志彪教授惠赠，Wang et al.，2011)中的多克隆位点和PtrICEl基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用Primer Premier5. O软件设计出扩增PtrICEl基因整个编码区的上、下游PCR引物(该引物对就是扩增本发明PtrICEl基因cDNA序列的引物对)。其序列如下所示Forward primer :5’ -TTGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTGG-3> ；Reverse primer :5’ -ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3’ ；下划线为酶切位点。以PtrICEl基因的克隆子为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为60°C。PCR反应体系及扩增程序同实施例I。双酶切体系反应总体积为40μ 1，其中含有PCR的纯化产物 8μ 1，IOXT 缓冲液(购自 TakaRa 自公司)6μ I 及 O. 1% (g/ml)BSA 4μ I,Kpn I 及 Sail 各2μ 1，双蒸水18 μ I。在37°C酶切过夜后纯化回收。pMV载体的双酶切体系反应总体积为40 μ 1，其中含有经过质粒提取获得的pMV载体DNA8y 1，10XM缓冲液(购自TakaRa公司)4μ 1，Kpn I及Xho I各2μ1，加双蒸水24μ L·于37°C酶切过夜后纯化回收。连接反应体系中插入PtrICEl基因与载体pMV的摩尔比为3:1，反应总体积为10 μ 1，其中含有IOXBuffer I μ 1，T4DNA连接酶I μ l，PtrICEl基因的双酶切回收产物6 μ 1，pMV载体的双酶切回收产物2 μ I。在16°C反应14-16小时，连接产物转化大肠杆菌菌株DH5 α，在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有读码框突变，获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为PMV-PtrICEl重组载体，应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pMV-ICEl导入到农杆菌EHA105中。真核表达载体PMV-PtrICEl构建流程见图5A所示，其中pMV载体图见5B。实施例4，烟草的遗传转化应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)将重组载体pMV-PtrlCEl导入到根癌农杆菌EHA105中，根癌农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下I.农杆菌EHA105培养取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L的LB平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本培养基中，28°C 180转/分钟振荡培养，待菌液浓度达到OD_=0. 3^0. 8时作浸染。2.浸染取未转基因的烟草叶片，切成O. 5cmX0. 5cm大小,然后放入制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8 10分钟，期间不断振荡。3.共培养取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然后接种于共培养培养基上(叶背面向下)，25°C暗培养3天。4.筛选培养经共培养3天后的烟草叶片，用500mg/L浓度的头孢霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗3飞次，再转移入添加了 100mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的筛选
培养基中。5.生根培养待筛选培养基上的不定芽长到Icm左右时，切下并转入添加了IOOmg/ L Km和500mg/L Cef的生根培养基上。 6.烟草苗转入土培待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。烟草转化过程见图6。烟草转化苗所用培养基见表I。表I烟草转化苗所用培养基配方
培养Il名Il !1分及介M(i#养基均含會30g/L蔗糖卿0‘7g/L iill, pH调—ti 5.8)
共培养培养基 MS坫木培养坫+2.0 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA締选培养基丨:述凡培养培莽越+100 mg/L Km+500 mg/L Cef
免根培养搞 MS 搞本培养坫+0.3 mg/L NAA+100 mg/L Km +500 mg/L Cef7.阳性转基因烟草初步确定按照上述方法得到转PtrICEl烟草抗性芽，提取DNA。方法如下 设计引物NPTII和基因特异引物(引物见表2)进行PCR扩增鉴定阳性苗。鉴定为可能的阳性植株移栽后独立收获种子(Tl代种子)，4°C春化处理3天，取O. Ig在1.5ml的离心管中，先用70%(V/V)酒精浸泡种子20秒，接着用灭菌双蒸水洗一次，再加入lml2. 5%NaC10(V/V)表面消毒7分钟，充分振荡，弃去NaClO后用灭菌双蒸水洗3次，最后用接种针将灭好的种子播于50mg/l具有卡那霉素(Km) MS基本培养基的上，结果表明本发明获得的抗性苗在抗性平板上能正常生长，为绿色，而非抗性苗则黄化死去。成活的植株移栽再收获Tl代种子，T2代种子用于播种及抗性分析。实施例5，柠檬的遗传转化I、取柠檬种子，用lmol/L的NaOH浸泡15分钟后洗净，再在超净工作台上用2%(体积比)的次氯酸钠浸泡灭菌15-20min，无菌水洗涤3次再在无菌条件下剥去种皮，接种于MT固体培养基上，暗培养3-4周再光照培养3-5d用于转化。2、农杆菌在含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基上划线，28°C暗培养两天；挑取单菌落接种在新的加有卡那霉素的LB平板上，28°C暗培养2-3天；用手术刀刮下已长好的农杆菌，接种在不加抗生素的液MT培养基中，同时加20mg/L (IOOuM) AS，28°C 200r/min振荡培养2h (同时在这段时间准备切上胚轴)；用分光光度计测量菌液的0D_值，用MT液体培养基调整OD6tltl值到O. 6-0. 8进行侵染。3、取实生苗上胚轴，于超净工作台斜切成1-1. 5cm长茎段，切好的茎段暂时放于灭菌的空三角瓶中(加少量水保湿)，待农杆菌菌液制备完成后用于转化。4、将切好的外植体浸泡在已制备好的农杆菌菌液里，侵染20min，中间摇动几次。侵染完后用无菌吸水纸吸干外植体表面菌液，再接种到共培养基上21-23°C暗处共培养3天。5、共培养3天后，用无菌水洗3-5次，再用无菌吸水纸吸干表面的农杆菌，转到加有卡那霉素50mg/L及头孢霉素400mg/L的筛选培养基上，25°C暗培养4周后再转到光照条件下培养。在筛选培养基上长出抗性芽，当抗性芽>0. 5cm时，再转到伸长培养基上促其伸 长。待芽有I. 5cm长时，切下并转入生根培养基诱导生根，柠檬转化过程见图7。常用培养基配方LB固体培养基蛋白胨10g/l+酵母提取物5g/l+NaCl 10g/l+琼脂15g/l柠檬生芽及伸长培养基MT+BAL Omg/1 +琼脂 . 5g/l+蔗糖35g/l (pH为5. 8)柠檬生根培养基1/2MT+IBA0.lmg/l+NAAO. 5mg/l+ 活性炭 O. 5g/l+ 琼脂 7. 5g/l +鹿糖 35g/l (pH 为 5. 8)实施例6，转基因植株的分子鉴定I、烟草和柠檬叶片DNA提取取适量的叶片放入I. 5mL离心管中，加液氮，充分研磨后；加入700 μ 165°C预热的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴化铵(简称CTAB，配方IOOmM Tris-HCl (pH8. O)，I. 5MNaCl, 50mM EDTA(pH8. O)溶液加1%聚乙烯吡咯烷酮，2% (体积比)CTAB，65°C水浴充分溶解备用，用前在65°C水浴预热后，加入1-4% (体积比)巯基乙醇，混匀，65°C温浴60-90分钟，隔15分钟取出上下轻轻颠倒混匀；10000g，离心10分钟；取上清，加600 μ I氯仿，颠倒混匀静置3分钟;10000g，离心15分钟；取上清450μ 1，加入900 μ I预冷无水乙醇，420 μ I 5ΜNaCl，混匀后，冰冻30分钟，IOOOOg,离心10分钟；弃上清后，用Iml 75%的乙醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。2、阳性转基因植株PCR检测采用引物NPTII和基因特异引物对烟草DNA进行PCR扩增。引物序列、反应程序及体系分别见表2、表3和表4。采用特异引物进行PCR鉴定。烟草转基因植株鉴定见图8A，柠檬转基因植株鉴定见图SB。表2引物序列信息
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NPTII IHi-I-JIfi S- AGACAATCGGCTGCTCTGAT -3'56 74权利要求
1.一种分离的基因，其特征在干PtrICEl基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。
2.根据权利要求I所述的ー种分离的基因，其特征在于所述基因的正向引物为5’-ITGTCGACCTCTCTGCATCTGCTGAGCTGCTG-3’；反向引物为5’ - ATGGTACCACAATGTTCGGCTCCTCGAAGGGC-3，。
3.权利要求I所述基因在植物抗寒改良中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种枳抗寒转录因子PtrICE1基因及其在植物抗寒改良中的应用，申请人利用植物基因克隆技术从枳中克隆得到一个新基因PtrICE1，其核苷酸序列为SEQ ID NO1所示，其中161-1840bp处为该基因的编码区，包含1680bp的开放阅读框；编码559个氨基酸，其编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO2所示，等电点为5.27，分子量为61kD。利用农杆菌介导的遗传转化方法转化烟草和柠檬，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明克隆的PtrICE1基因具有调控抗寒功能。PtrICE1基因的发现，为植物抗非生物逆境分子设计育种提供新的基因资源，为实施绿色农业提供新的遗传资源，该遗传资源的开发利用有利于降低农业生产成本和实现环境友好。
文档编号A01H5/00GK102776203SQ20121025825
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者付行政, 刘继红, 黄小三 申请人:华中农业大学