甜荞dreb转录因子的制作方法
【专利摘要】本发明甜荞DREB转录因子涉及一种来自于植物且具有多于20个氨基酸的肽。所述的甜荞DREB转录因子，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本发明运用同源克隆技术（Race技术）从甜荞中分离到甜荞FeDREB1，通过农杆菌转化拟南芥，使之在拟南芥中过表达，证实所分离的甜荞FeDREB1可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜荞FeDREB1在植物抗寒性和耐旱性状改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
【专利说明】甜荞DREB转录因子
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来自于植物且具有多于20个氨基酸的肽。
【背景技术】
[0002]非生物胁迫(如干旱、高盐、低温)是植物的生长发育、生物量形成和经济产量提高的主要限制因子。近20年来，大量受非逆境胁迫的诱导的基因被分离与功能鉴定，根据胁迫诱导基因表达产物的作用，可将这些胁迫诱导表达的基因分为两大类，第一类基因的编码产物在抗逆性中直接发挥功能，包括:1)直接保护细胞免受水份胁迫伤害的功能蛋白，如LEA蛋白(胚胎发生后期丰富蛋白)、渗透蛋白、抗冻蛋白、水通道蛋自、离子通道蛋白、伴侣蛋白和mRNA结合蛋白等渗透调节因子，如脯氨酸、甜菜碱、一些糖类等的合成。在胁迫条件下，水通道蛋白，糖运输蛋自，脯氨酸运输蛋白通过质膜和液泡膜运输水分，糖类和脯氨酸，以调节内外渗透压；2)毒性降解酶，如谷肤甘肤S转移酶、可溶性环氧化物水解酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶等可以保护细胞，免受活性氧的伤害。第二类基因编码的产物参与调控下游基因的表达以及信号的传导，包括:I)感应和传一导胁迫信号的蛋白激酶，如活化分裂素的蛋白激酶、依赖钙的蛋白激酶、受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶、转录调控蛋白激酶等；2)传导信号和调控基因表达的转录因子，如AP2/ERF转录因子(乙烯反应结合因子)、bZIP转录因子(带有亮氨酸拉链的转录因子家族)、MYC转录因子(带有基本螺旋串的螺旋转录因子家族)、MYB转录因子(带有色氨酸串基元的转录因子家族)、WRKY转录因子(N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列)、NAC转录因子(N端含有高度保守的NAC结构域)和DELLA转录因子；3)以及在信号传导中起重要作用的蛋自酶，如磷酸醋酶、磷酸酶c等。
[0003]植物的抗逆性往往是由多基因控制的数量性状。植物对干早、低温抗性的强弱往往不取决于某一单一基因，而是受许多基因的共同调控。一个关键因子可以调控许多相关功能基因的表达，因此，通过增强一些关键的转录调控因子的作用可能使植物的抗逆性得到综合的、根本性的改良。这与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比，将是提高作物抗逆性的更为有效的方法和途径。研究表明DREB转录调控因子在调控非生物胁迫相关基因的转录表达中起着重要的作用。DREB转录因子属于AP2/ER家族转录因子，它结合DRE或CRT脱水反应元件,激活下游启动子区具有该元件的抗逆相关基因的表达。近年来，拟南芥、水稻、大麦、小麦、大豆、玉米、棉花和等大量植物中的DREB转录因子功能相继被鉴定，证明它参与植物调控干旱、高盐、低温、病害和细胞发育相关的基因表达，提高植物耐低温和干旱能力，是植物基因工程改良植物耐非生物胁迫的重要有效基因。如A.htalinaa的DREB1A/CBF3基因的超量表达能提高植株对低温胁迫的耐性；Yamaguch1-Shinozaki等人(2006)的研究结果表明能有效的用，来提高作物的干旱、低温的抗性。Dubuozet等人(2003)也证明水稻的以基因能明显提高单子叶植物对干旱、低温胁迫的耐性。甄伟等将CBFl基因转入烟草和油菜基因组中，对转化的烟草和油菜抗寒性的检测结果显示，转基因油菜的抗寒性有明显提高，转基因烟草的抗寒性也有一定提高。Hsieh等将拟南芥的CBFl转入番茄，转基因番茄叶片中的过氧化氢酶的活性比对照显著提高，H202含量比对照明显降低，转基因植株的抗寒性得到显著改善。韦善君等将玉米泛素启动子(Pubi)调控的CBFl基因转化烟草，发现CBFl组成型表达增强了转基因烟草的抗寒性。金建凤等将CBFl基因转入水稻中，发现低温处理后转基因植株体内脯氨酸含量比野生型明显增加，植株的抗寒性也明显增强。金万梅等利用根癌农杆菌介导的方法将拟南芥CBFl基因导入草莓中，提高了草莓对低温胁迫的抵抗力。DREB转录因子在植物非生物抗逆的作用明显，是目前被用来提高农作物的耐逆功能的重要基因之一。
【发明内容】
[0004]本发明旨在提供一种能有效提高植物耐逆性的甜荞DREB转录因子。本发明还提供了该转录因子的编码基因。
[0005]本发明还提供了一种提高植物耐逆性的方法。
[0006]本发明所述的转录因子命名为甜荞FeDREBl。
[0007]本发明所述的甜荞DREB转录因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]本发明所述的甜荞DREB转录因子的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所
/Jn o
[0009]本发明还提供了含有上述编码基因的表达载体，细胞系和宿主菌。
[0010]本发明所述的提高植物耐逆性的方法，将含有上述编码基因导入植物中即可。其中所述的耐逆性为抗寒性和耐旱性。
[0011]本发明运用同源克隆技术(Race技术)从甜荞中分离到甜荞FeDREBl，通过农杆菌转化拟南芥，使之在拟南芥中过表达，证实所分离的甜荞FeDREBl可以增加植物的抗寒性和耐旱性。甜荞FeDREBl在植物耐寒性状改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为转化FeDREBl拟南芥T3代植株和野生型植株耐寒效果比较。
[0013]图2为转化FeDREBl拟南芥T3代植株和野生型植株耐旱效果比较。
【具体实施方式】
[0014]实施1:甜荞FeDREBl基因的制备一
(I)将甜荞“西农9976”种子在MS培养基上萌发，在光照条件为8000LUX，温度为25°C条件下生长3周成苗，将整个植株放入一 6°C低温培养箱中，冷胁迫6小时，取植株叶片，锡箔纸包裹后，迅速放入液氮，于一 80°C低温冰箱永久保存，采用Takara公司RNA提取试剂盒，提取RNA，反转录成cDNA。最终用PCR方法扩增FeDREBl基因序列。其扩增引物如下，其上游引物中引入Xbal酶切位点，下游引物中引入Sac I酶切位点:
上游引物:5’_ CGTCTAGAGCGATCATGGATTCTTTCTC -3’
下游引物:5’- AGGAGCTCGGTTCAAAATTTACCAAG -3’
PCR反应体系
【权利要求】
1.甜荞DREB转录因子，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
2.一种如权利要求1所述的甜荞DREB转录因子的编码基因，其特征在于其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
3.含有权利要求2所述编码基因的表达载体。
4.含有权利要求2所述编码基因的细胞系。
5.含有权利要求2所述编码基因的宿主菌。
6.一种提高植物耐逆性的方法，其特征在于将含有权利要求2所述编码基因导入植物中即可。
7.如权利要求6所述的提高植物耐逆性的方法，其特征在于所述的耐逆性为抗寒性和耐旱性。
【文档编号】C12N15/82GK103483436SQ201310377196
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年8月27日 优先权日:2013年8月27日
【发明者】方正武, 冯佰利, 王鹏科, 高小丽, 高金锋, 杨璞 申请人:西北农林科技大学