专利名称：一株印楝内生炭角菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有广谱抗菌活性的微生物菌株。
背景技术：
印楝indica A. Juss)属楝科植物,为热带树种,具有较高的生物农药和医药价值。印度研究人员曾经从生长在印度的印楝植物中分离和鉴定了内生真菌(Rajagopal K et al, Current Science, 2000, 78, 1375; Mahesh B et al, CurrentScience, 2005, 88, 218; Verma VC et al, Microbial Ecology, 2007, 54, 119)。我们从生长在云南省元江县的印楝植物中分离获得了内生真菌，并研究了其种类组成和抗菌活性的筛选(邵士成，吴少华等，天rJf产參级贫与·万发，2007，19, 761 ;邵士成，吴少华等，生物多样性，2008，16, 63)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离自中国云南省元江县印楝indicaA. Juss)植物活体中具有广谱抗菌活性的微生物菌株一印楝内生炭角菌。本发明所述的印楝内生炭角菌系从中国云南省元江县印楝植物活体中分离获得。现在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏单位名称中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址中国，武汉大学，邮政编码430072。保藏日期为2012年9月19日，保藏编号为CCTCC No: M 2012365。本发明所述的印楝内生炭角菌命名为炭角菌YM311647U>7aria sp. YM311647)，现保藏在国家知识产权局认可的保藏单位，保藏编号为CCTCC No: M 2012365。菌株YM311647的固体培养特征
I、PDA培养基28°C培养5d，菌落直径达5. 2cm,菌落平展，初为白色，短绒状，气生菌丝呈辐射状生长，边缘逐渐开始变黑。15d后在菌落边缘处出现黑色棍棒状子座组织，形成一明显的轮纹，边缘呈平缓圆弧状。2、麦芽汁培养基28°C培养5d，菌落直径达6. 4cm，菌丝呈辐射状生长，中央部分白色有突起，边缘菌丝逐渐变老，呈绒毛状。3、查氏培养基28°C培养，菌落生长缓慢，菌落初为白色，短绒状，菌丝辐射状生长，培养7d，菌落直径达4. 2cm，菌落中心维持白色，边缘开始慢慢变黑。菌株YM311647的子座形态特征(见图I)
子座环生，长I. 5cm-4. 5cm,粗I. 5 mm _2mm,大量分枝,柄长约1cm。顶端有白色不孕小尖，长约2mm。子座外部碳化为黑色，表面黑色痂质，有小孔。内部仍为白色。随着培养时间的延长，子座变长变细，白色尖端消失。生长过程中未见子囊孢子产生。菌株YM311647的分子生物学特征
采用分子生物学PCR技术，DNA序列测定分析，YM 311647菌株ITS rDNA基因组由539个碱基(bp)组成。以ITS rDNA序列为基础构建系统发育树，该菌与炭角菌属具有较高的亲缘关系，与已知种办venosula的ITS rDNA序列同源性达98. 7%,有I个碱基的差异(图2)。菌株YM311647的发酵培养特征
I、培养基PDB培养基。2、培养温度28±21。3、发酵时间7天。4、发酵培养特征培养第I天，有零星的白色菌丝点出现；培养第3天，发酵液中出现少量白色菌丝；培养第5天，白色菌丝逐渐增多，有少量菌丝帖壁；培养第7天，长满灰白色菌丝体，发酵液粘稠。菌株YM311647的发酵工艺如下
菌种——活化——一级种子(PDA培养基)——培养(28±2°C，5-7天)——接种——二级种子(PDB培养基，摇床200 r/min，28±2°C，3-4天)——接种(按5%接种量)——发酵(PDB培养基，摇床200 r/min，28±2°C，7天)——发酵物。上述发酵工艺中的发酵条件如下
I、发酵方式液体发酵。2、种子培养基马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。马铃薯葡萄糖液体培养基的制备取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水I升煮沸30分钟，过滤，滤液加水补足至I升，加入葡萄糖20克，pH自然。上述培养基中加入15克琼脂，即为PDA培养基。3、发酵培养基马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。4、培养时间菌种活化培养5-7天，种子摇床培养3-4天，发酵摇床培养7天。5、培养温度种子和发酵培养温度均为28 ± 2 °C。6、发酵完毕，加入等体积95%乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水制得抗菌发酵液制品。本发明所述的菌株YM311647的抗菌活性试验
I、病原指示菌共9株人体致病真菌包括白色念珠菌{Candida albicans)、星^形石膏样毛癣菌、Trichophyton gypseum);植物病原真菌包括稻痕霉iPyriculariaoryzae ) >trytis ciflerea )、禾谷键刀菌 QFusarium《raffiifleara )、燕麦键抱
iFusarium;细菌包括金黄色葡萄球菌{Staphylococcus atfreus)、大肠杆菌
iBscherichia coli)(fseudomonas aeruginosa) ο2.病原指示菌培养基细菌类指示菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；皮肤致病真菌类指示菌采用沙氏培养基；植物病原真菌类指示菌采用PDA培养基。3.内生真菌的培养
将印楝内生炭角菌菌株YM311647接入含7 mL PDA液体培养基的三角瓶，置于28±2 ° C摇床(200 r/ min)培养7d，加入等体积95 %乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，得发酵液提取物样品备用。4.抗菌活性的测定
在长有指示菌的固体斜面培养基中加入ImL无菌水，震荡片刻制成指示菌悬液。将发酵液提取物样品用无菌水溶解，配制成浓度为lmg/mL的溶液，用PDB液体培养基将样品分别倍比稀释为 6 个浓度lmg/mL、500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62. 5mg/mL、31. 25mg/mL。按每孔50μ 将样品分别加入到96孔板中，再向每孔中加入50μ 活性指示菌菌悬液，以不加菌液的孔为空白对照，设置3个平行处理。将96孔板置于28 ±1°C(真菌)或37±1°C(细菌)培养箱中培养24 h后，肉眼观测活性指示菌的生长状况，以没有指示菌生长的样品最低浓度为最小抑菌浓度(MIC)。结果显示，菌株YM311647的发酵液提取物样品对9种病原指示菌白色念珠菌、星形石膏样毛癣菌、稻瘟霉、灰葡萄孢、禾谷镰刀菌、燕麦镰孢、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿色假单孢菌的MIC值分别为62. 5、125、250、125、125、250、62. 5、31. 25、250mg/mL。本发明首次从印楝植物(Azadirach ta indi ca)中分离获得内生真菌菌株YM311647，确定为炭角菌)，发现该菌对2种人体致病真菌、4种植物病原真菌和3种细菌，共9种病原微生物具有比较明显的抑制生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分。
图I为本发明所述的炭角菌YM311647的子座形态特征。图2为本发明所述的炭角菌YM311647同源性的系统发育树图。
具体实施例方式实施例一
炭角菌YM311647菌株是通过发酵获得农用或医用新型天然抗菌药物活性成分的微生物药源。取YM311647菌种，在无菌条件下用接种针挑取少量菌丝，接种于装有已灭菌的PDA培养基试管中，置培养箱内于28±2° C活化培养5-7天，备用。在无菌条件下，将活化好的菌种以相同方法接入已灭菌的一级种子PDB培养基中，在28±2° C培养3-4天，即为YM311647菌株的一级种子。将配制好的PDB培养基IOOml装入500ml三角瓶内，121°C灭菌30分钟备用。取YM311647菌株的一级种子，在无菌条件下接种于装有100ml PDB培养基的500ml三角瓶内，接种量按7-10% (v/v)计，置于28±2° C摇床(200 r/min)培养7天，期间注意检查有无染菌现象。发酵完毕，向发酵液中加入等体积95 %乙醇浸提48小时，过滤，将滤液浓缩至干，加入无菌水即制成抗菌发酵液样品。
权利要求
1.一种印楝内生炭角菌，其特征在于命名为炭角菌YM311647 (Jylaria sp.YM311647)，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCC No M 2012365。
2.按照权利要求I所述的印楝内生炭角菌，其特征是其ITSrDNA基因组由539个碱基组成，序列如下I taaccctgtg aacctacctt tgttgcctcg gcaggtctgc aacctaccct gagagtccct61 accctgtagg gaccttaccc ggtagttgcg ggcataacct gccggtggtc taccaaactc121tgtttactatgttattctgataaataagttacaacggatc181tcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga241attcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccattagtattctagtgggcat301gcctgttcgagcgtcatttcaacccttaagccctgttgcttagcgttgggagcctacaga361tacactctgtagttccttaaagttagtggcggagtcggtttcacactctagacgtagtaa421attttatctcgcctatagatgagccggtcccttgccgtaaaaccccctaatttctaaagg481ttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcgcggaggaao
3.--种印楝内生炭角菌的用途，其特征在于用于制备抗菌药物。
全文摘要
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种具有广谱抗菌活性的微生物菌株。本发明所述的印楝内生炭角菌命名为炭角菌YM311647(Xylariasp.YM311647)，现保藏在国家知识产权局指定的保藏单位，保藏编号为CCTCCNoM2012365。该菌株为首次从印楝植物(Azadirachtaindica)中分离获得,对2种人体致病真菌、4种植物病原真菌和3种细菌，共9种病原微生物具有比较明显的抑制生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵获得农用或医用的新型天然抗菌药物活性成分。
文档编号A01P3/00GK102936570SQ20121039927
公开日2013年2月20日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者吴少华, 苗翠苹, 陈有为 申请人:云南大学