专利名称：以藻泥为添加剂生产香蕉专用生物有机肥的工艺及其产品的制作方法
技术领域：
本发明提供一种以藻泥为添加剂生产香蕉专用生物有机肥的工艺及其产品，属于农业集约化生产技术，该生物有机肥富含大量促进香蕉生长的功能菌，同时含有大量的游离氨基酸，能够显著促进香蕉生长、防控枯萎病的发生。
背景技术：
随着生产力的不断发展，人们生活水平的不断提高，大量的工业废水和生活污水排入河流、湖泊和水库中，排入水体的营养物质不断增加，导致湖泊水体的富营养化日趋严重。水体富营养化会导致蓝藻的大面积爆发性繁殖。蓝藻的大量繁殖不仅会抑制其它藻类的生长，使水体的透明度下降，还会向水体排放有毒的代谢物质，且大量的蓝藻死亡后，会造成水体的溶解氧严重不足，产生恶臭。给生态环境和人类健康构成了严重的威胁。清除蓝藻的方法很多，直接清除水体中蓝藻，并移出水体，即打捞蓝藻法，这是目前非常有效 的和学术界没有争议的一种方法。太湖蓝藻爆发后，直接打捞蓝藻作为应急措施，每天都有1000多吨蓝藻水从太湖水体中打捞上来，累计约18万吨。蓝藻的打捞及打捞后的处理是现阶段太湖治理过程中一大亟待解决的问题。但是蓝藻对家畜、家禽生长有明显不良影响，引起动物肝、肾的变性，不宜直接利用。在能源匮乏、环境污染的今天，将废弃的生物质能转化为人们可利用的化学能源，越来越成为人们关注的焦点。这样既可以解决环境污染问题，又能够缓解能源危机。蓝藻主要有铜绿微囊藻、水华鱼腥藻和变异鱼腥藻等，以上3种蓝藻含有丰富的营养成分，有专家对这几种藻的氨基酸和脂肪酸的含量进行了测定，并与其它藻(绿藻、隐藻、裸藻和硅藻)作了比较。发现三种蓝藻的氨基酸含量比其它藻类都高，其中微囊藻及鱼腥藻中均以亮氨酸含量最高。打捞藻泥的含水量在86-89 %之间，藻泥干物质全N含量为7. 5-8. 5%，全P含量为O. 44%，全K含量为O. 5%;有机质含量大于70%。(I、沈银武，刘永定，吴国樵，等.富营养化湖泊滇池水华蓝藻的机械清除[J].水生生物学报，2004,25(2) :131-136. 2、蓝藻快速好氧堆肥的研究江南大学硕士论文2009第2页)。但原料蓝藻里面含毒素、蛋白等大分子物质，不经过处理会二次污染环境(氮、磷、藻毒素)，而且养分不能直接被植物所利用(杜静，《太湖水华蓝藻资源化技术研究》D，南京农业大学，2008，硕士学位论文；韩志国，武宝王，郑解生，等.淡水水体中的蓝藻毒素研究进展(综述)[J].暨南大学学报自然科学版，2001，22 (3) 129-134 ;杨海麟，李克朗，张玲，等.蓝藻资源无害化利用技术的研究[J].生物技术，2008，18 (6) :95-98)。因此近年来对打捞藻泥的废弃资源利用势在必行。打捞藻泥中含有植物蛋白、多糖等丰富营养成分，本专利从太湖打捞藻泥富含的丰富氨基酸出发，利用该类蛋白质资源与普通腐熟鸡粪堆肥二次固体发酵香蕉促生微生物，研发出了香蕉专用促生生物有机肥。生物有机肥是指特定功能微生物与主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸杆等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料复合而成的一类兼具微生物肥料和有机肥效应的肥料。其本质特征是含有特定功能的、表现出一定肥料效应的微生物，这些功能微生物的生命活动是生物有机肥优于其它肥料的关键因素。生物有机肥施用后能产生多种活性物质溶解土壤中难溶化合物以提高土壤肥力并有利于农作物吸收养份；产生抑菌物质和生长调节因子减少作物土传病虫害的发生并促进作物稳健生长。生物有机肥发挥作用的关键在于肥料中有益微生物的数量，因此研究不同的配方和二次固体发酵工艺确保肥料中活菌数达到最高变得尤为重要。简单将功能微生物与动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸杆等)为来源并经无害化处理、腐熟的有机物料进行混合堆置很难得到高质量的生物有机肥，前期研究表明在动植物残体中加入少量外源氨基酸二次发酵功能微生物能够显著增加功能微生物的数量，提高肥料质量。外源氨基酸的种类很多，如菜饼、豆饼等，但此类氨基酸成本很高，尤其是豆饼，探求和开发新型低成本氨基酸则能够大幅度提高生物有机肥的市场竞争力。
发明内容
技术问题本发明的目的在于针对太湖打捞藻泥资源无法充分利用和生物有机肥生产成本昂贵的问题，开发研制出一种新型香蕉专用生物有机肥的配方及工艺，降低生物有机肥的生产成本，生产的香蕉专用生物有机肥能够显著促进香蕉生长、防控枯萎病的发生。 技术方案以藻泥为添加剂生产香蕉专用生物有机肥工艺，包括I)将菌种保藏号为CGMCC NO. 3183的促生拮抗菌NJN-6接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为pH6. O 7. 5，发酵温度范围30 35°C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量^ I X IO10个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH 值调至 7. 2-7. 4，121°C灭菌 20min。2)将腐熟后的鸡粪堆肥和藻泥按干重比，9. 3 : O. 7进行均匀混合；3)将促生拮抗菌发酵液接种入腐熟后的鸡粪堆肥和藻泥混合物中进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入功能菌菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I次,使固体发酵温度不超过50°C，发酵7天后结束，功能菌含量可达到2 X IO7个/g以上，最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为成品香蕉专用生物有机肥；所用腐熟后的鸡粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，有机氮质量比含量为2-3%，含水量质量比为25-30%。用上述配方工艺生产的微生物有机肥料中有益活菌数2X107CFU/g(肥料干重)以上，全氮含量为2-3%,总氮磷钾养分为5-7%,有机质含量> 45%,该产品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。上述微生物有机肥料专用于促进香蕉生长和防控香蕉枯萎病的发生。有益效果本发明提供一种以藻泥为添加剂的低成本香蕉专用生物有机肥的配方及工艺。使用该发明生产的香蕉专用微生物有机肥具有生产成本低，使用方便，促生效果好的优点，适合香蕉种植区域大面积使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。
产品与目前市场上的产品相比具有如下优点I)本专利利用太湖打捞藻泥和腐熟鸡粪普通肥作为配方，二次固体发酵香蕉专用生防芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens NJN-6,研制香蕉专用生物有机肥,该配方及工艺能够大幅度增加该新型生物有机肥中功能微生物的数量，大幅度降低了生物有机肥的成本，同时通过微生物的作用，蓝藻里的大分子藻蛋白能够被分解成小分子的氨基酸，可供植物直接利用，藻毒素能够被大幅度降低，生产的产品具有极强的市场竞争力。2)本发明产品利用太湖打捞藻泥为固体发酵原料，能够降低生物有机肥的原料成本。藻泥中蛋白含量可高达50%以上，氨基酸组份比较齐全，肥料中高效菌株的含量达到2X107CFU/g (肥料干重)以上，超过国家标准2 X IO7个/g，施入土壤后能形成优势群，并在土壤中存活下来。肥料产品中含有丰富的可溶性有机碳氮和种类齐全的游离氨基酸，能给功能菌提供十分优越的生长环境，极大地提高了促生拮抗菌在土壤中的定殖和发挥功能的能力。
3)采用液相色谱法测定生物有机肥中藻毒素LR和RR (microcystin-LR和microcystin-RR)的含量，结果表明微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg(肥料干重)，而我们测得原料纯藻泥中微囊藻毒素LR和RR的含量分别为3. lmg/kg (藻泥鲜重)和62. 16mg/kg(藻泥鲜重)，因此放置两月的藻泥再利用本专利技术固体发酵后能够将藻毒素LR和RR的含量降低到4ug/kg (肥料干重)以下，目前国内外还没有肥料中藻毒素的标准，仅仅有地下水中的标准，低于lug/kg。4)试验结果表明，在香蕉苗期上上施用本产品后，能显著促进香蕉生长。
四
图I不同含量藻泥与腐熟鸡粪混合固体发酵NJN-6菌株的数量变化图2生物有机肥发酵中NJN-6菌株的数量图3藻泥添加生物有机肥中氨基酸的含量图4盆栽效果图
五具体实施例方式I、藻泥的获得由太湖周边打捞站免费提供，放置藻泥储存池2个月。2、功能菌菌剂的生产将菌种保藏号为CGMCC NO. 3183的促生拮抗菌NJN-6 (公知公用，见授权发明专利ZL200910183361.3，防除连作香蕉巴拿马枯萎病的拮抗菌及其微生物有机肥料。)接种到PDA培养液进行液体发酵生产，发酵条件为pH6. 0-7. O,发酵温度范围30_35°C，搅拌速度为180-300转/分钟，发酵时间为48小时，发酵液的含菌或芽孢量> IOltl个/ml。所用PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH值调至7. 2-7. 4，121°C灭菌 20min。3、固体发酵生成生物有机肥3. I固体发酵配方的获得
首先将藻泥以不同梯度加入腐熟鸡粪堆肥中，进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入功能菌菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵7天后结束。发酵完后测定各处理中的功能菌的数量，结果如图，表明加入7 % (干重)藻泥的堆肥为藻泥梯度中的最佳处理，功能菌数量达到6. 7X 107CFU/g (干重)(图I)。所用腐熟后的鸡粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量>45%，有机氮质量比含量为2-3%，含水量质量比为25-30%。进行残留藻毒素的检测，方法如下向IOOg肥料中加入100mL5%的乙酸，在-70和常温下反复冻融多次后，12000r/min离心lOmin，分别取出上清液(I)和沉淀；将沉淀用100mL80%甲醇溶液震荡提取4h，离心15min，得上清液(II)；将上清液(I)与上清液(II)充分混合后得上清液(III)，将上清液(III)用稀盐酸将PH调至3，静置过夜后离心，弃残渣，得上清液(IV)，将上清液(IV)用稀氨水将pH调至7后，40°C旋转蒸发去除甲醇，将剩余样品过O. 45 μ m滤膜得藻毒素粗提液。依次用20mL100%甲醇、20mL超纯水活化C18固相萃取柱(500mg/6ml),将藻毒素粗提液通过固相萃取柱进行富集浓缩，再分别用20mL10%以及20ml20%甲醇溶液淋洗固定相，最后用10mL80%甲醇溶液(加入O. 05%三氟乙酸)将吸附在固定相上的微囊藻毒素洗脱下来，将纯化后的微囊藻毒素通过旋转蒸发除去甲醇得MCs储备液，将储备液冷冻干燥后，用20%甲醇定容到2ml，液 体供HPLC上机检测。采用液相色谱法测定生物有机肥中藻毒素LR和RR(microcystin-LR和microcystin-RR)的含量，结果表明微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg(肥料干重)，而我们测得原料纯藻泥中微囊藻毒素LR和RR的含量分别为3. lmg/kg (藻泥鲜重)和62. 16mg/kg (藻泥鲜重)，因此放置两月的藻泥再利用本专利技术固体发酵后能够将藻毒素LR和RR的含量降低到4ug/kg (肥料干重)以下，目前国内外还没有肥料中藻毒素的标准，仅仅有地下水中的标准，低于lug/kg。3. 2固体大堆发酵生成成品有机肥根据上述配方和工艺，将腐熟后的鸡粪堆肥和太湖打捞藻泥(干重比，9. 3 O. 7)进行均匀混合，将促生拮抗菌NJN-6接入混合堆，每吨固体有机物料中加入功能菌菌液50L进行固体发酵，中每天翻堆I次，使固体发酵温度不超过50°C，一般发酵7天后结束；设计鸡粪腐熟有机肥作为对照。发酵结束后新型生物有机肥中功能菌数量达到8. 2X IO7CFU/g(干重)(图2)，超过鸡粪腐熟有机肥I个数量级。所用腐熟后的鸡粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，有机氮质量比为2-3%，含水量质量比25-30%。研制成的新型香蕉专用生物有机肥含有8. OX 107CFU/g(干重)以上的促生拮抗菌NJN-6，全氮含量为2. 0-3. 0%,总氮磷钾养分为5-7%,有机质含量大于45%。以上结果表明所研制配方和工艺完全能够最大化的发酵生产新型生物有机肥，且该生物有机肥完全能够符合国家标准。3. 3生物有机肥中的氨基酸含量和成分利用茚三酮比色法测定所研制的低成本生物有机肥中游离氨基酸的含量，结果见图3，发酵完成后，新型生物有机肥(BIO)中游离氨基酸的含量(7.9g/kg)远远超过对照鸡粪直接添加促生拮抗菌株固体发酵而成的肥料(OF)中游离氨基酸的含量(2. 2g/kg)。4、温室促生试验共设4个处理，分别为本专利研制的新型促生生物有机肥处理(BIO)、腐熟后的鸡粪堆肥处理(OF)、腐熟后的鸡粪堆肥接入功能菌固体发酵后肥料处理(OFJ)和生物有机肥配方不接功能菌固体发酵后肥料处理(OFL)。每个处理18盆，每盆装IOkg 土，肥料的添加量为2%。肥料与土充分混合均匀，常规管理。定期测定香蕉生长指数。结果如图4、表一、表二、表三、表四、表五、表六、表七、表八和表九。I)株高与OF处理相比，OFJ处理能够增加植株的株高，但差异不显著，在鸡粪中添加藻泥后，能够显著增加植株的株高。与其他三个处理相比，本专利研制的生物有机肥BIO的应用能够显著增加植株的株高。2)茎粗与OF处理相比，OFJ处理能够增加植株的茎粗，前30天差异显著，在鸡粪中添加藻泥后，能够显著增加植株的茎粗。与OF和OFJ处理相比，本专利研制的生物有机肥BIO的应用能够显著增加植株的茎粗，但与OFL处理差异不显著。3)倒三叶叶面积与OF处理相比，OFJ处理能够增加植株的倒三叶叶面积，但差异不显著，在鸡粪中添加藻泥后，能够显著增加植株的倒三叶叶面积，差异显著。与OF和OFJ处理相比，本专利研制的生物有机肥BIO的应用能够显著增加植株的茎粗，但与OFL处理相比，前30天差异显著。4)倒三叶叶绿素含量OF和OFJ处理的叶绿素含量差异不大。与OF和OFJ处理相比，OFL处理和本专利研制的生物有机肥BIO的应用能够显著增加植株的叶绿素含量，差异显著。5)叶片数量与OF处理相t匕，OFJ处理能够显著增加叶片数量，差异显著。与OF和OFJ处理相比，OFL处理和本专利 研制的生物有机肥BIO的应用能够显著增加植株的叶片含量，差异显著。6)地上部鲜重和干重与OF处理相比，OFJ处理能够地上部鲜重和干重，但达不到显著差异。与OF和OFJ处理相比，OFL处理和本专利研制的生物有机肥BIO的应用能够显著增加植株的地上部鲜重和干重，差异显著。与OFL处理相比，本专利研制的生物有机肥的应用后，地上部鲜重的差异达到显著，干重的差异在第50天达到显著。7)地下部鲜重和干重0F和OFJ处理间差异不大。与OF和OFJ处理相比，OFL处理和本专利研制的生物有机肥BIO的应用能够显著增加植株的地下部鲜重和干重，差异显著。与OFL处理相比，本专利研制的生物有机肥BIO的应用，地下部鲜重和干重的差异在第20天和40天时显著。试验结果整体表明，功能菌株的应用能够促进香蕉植株的生长，本研究的配方和工艺能够显著促进功能菌的二次固体发酵效率，增加肥料中功能菌的数量和肥料的养分，最终促进香蕉植株的生长。表一不同肥料对于植株株高的影响单位cm
移苗后10天移苗后20天移苗后30天移苗后40天移苗后50天 ~OF 6.78 Γ.01 b X4±098 b 7.4—5±1.22b 7.6 士 0.98 b 10.78 士 1.19 b OFJ 6.95士0.93 ab 7.74±0.83 b 8.08±0.73 b 8.74±1.26 b 10.94士0.91 b OFL 7.68±0.50 ab 11.2士0.94 a 11.64士0.69 a 12.44±0.86 a 15.18±0.57 a BIO 8.1 士0.73 a 10.06士 1.20 a 12.6士1.14 a 13.18士0.92 a 16.2士 1.01 a表二不同肥料对于植株茎粗的影响单位_
运苗后—10关移苗后20天涵涵夫 苗,40关移苗后50天~
"of [66士0^7 ab8.73 士 1.21 c8.78 土 0.87 df0.89±0.99 b11.57 土 1.35 b
OFJ 8.68土0.61 ab10.04土0.73 b10.57土 1.13 c12.06±0.94b12.73士0.33 b
OFL 8.11 士0.32bll.55il.03 a13.73±0.75b15.05±0.81 a16.59土 1.57a
ΒΙΟ 9,45土0.65 a11.81±0.28a15.35±1.01 a15.55±0.69a17.14±1.33 a
表三不同肥料对于植株倒三片叶面积的影响单位cm权利要求
1.以藻泥为添加剂生产香蕉专用生物有机肥工艺，包括 1)将菌种保藏号为CGMCCNO. 3183的香蕉专用促生拮抗芽孢杆菌NJN-6接种到PDA培养液，进行液体发酵生产，发酵生产的条件为pH6. O 7. 5，发酵温度范围30 35°C，搅拌速度为180 300转/分钟，发酵中后期形成芽孢，发酵时间为48h，使发酵液中含菌或芽孢量> I X IOltl个/ml ;所用PDA培养液配制方法为，以配制IL培养基为例用200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，定容至1000ml，pH 值调至 7. 2-7. 4，121°C 灭菌 20min ； 2)将腐熟后的鸡粪堆肥和藻泥按干重比9.3 O. 7进行均匀混合； 3)将促生拮抗菌发酵液接种入腐熟后的鸡粪堆肥和藻泥混合物中进行固体发酵，每吨固体有机物料中加入功能菌菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I次,使固体发酵温度不超过50°C，发酵7天后结束，功能菌含量可达到2X IO7个/g以上，最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为成品香蕉专用生物有机肥；所用腐熟后的鸡粪堆肥其发芽指数为98%以上，有机质质量比含量> 45%，有机氮质量比含量为2-3%，含水量质量比为25-30%。
2.权利要求I所述工艺生产的香蕉专用生物有机肥产品，该产品中微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。
3.根据权利要求I所述的香蕉专用生物有机肥产品，该产品中功能菌NJN-6活菌数大于2 X 107CFU/g肥料干重，全氮含量为2. 0-3. O %，总氮磷钾养分为5_7 %，有机质含量≤ 45%。
4.权利要求2和3所述产品在促进香蕉生长和防控香蕉枯萎病中的应用。
全文摘要
本发明提供了以藻泥为添加剂生产香蕉专用生物有机肥的工艺及其产品，属于农业集约化生产技术。所用配方为腐熟鸡粪普通肥(93％干重，重量比，下同)和太湖打捞藻泥(7％)；所用菌株为香蕉专用促生生防芽孢杆菌NJN-6；工艺流程为将原料以上述最优配方混合，5％接入功能菌，条垛式发酵，每天翻抛1次，发酵7天。所生产的肥料有益活菌数大于2×107CFU/g(肥料干重，下同)，全氮含量为2-3％，总氮磷钾养分为5-7％，有机质含量超过45％，微囊藻毒素LR和RR的含量均低于4ug/kg。富含大量的有益氨基酸，促生效果好，抗病能力强。
文档编号C05F15/00GK102887743SQ20121043638
公开日2013年1月23日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者沈其荣, 李 荣, 黄炎, 杨兴明, 张苗, 施娟娟, 曹亮亮, 刘红军 申请人:南京农业大学, 江苏新天地生物肥料工程中心有限公司