专利名称：一种二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株的方法,属于针对二棱大麦进行组织培养的范畴。
背景技术：
大麦是禾本科(Gramineae)大麦属(Hordeum),大麦至今依然是高寒、干旱和盐碱地区主要的粮食作物，大麦占世界谷物种植面积的第六位，次于小麦、玉米、水稻、燕麦及黑麦，在我国，大麦超过燕麦及黑麦，占第四位。栽培大麦有3个种六棱型大麦(H. vulgare)，花穗有两个相对的凹槽，每个凹槽生长3个小穗，每个小穗开I朵小花，结I粒种子；二棱大麦(H. distichum)为两列型， 小穗中有I中心小花，可结籽，侧生小花通常不育。不规则型大麦(H. irregulare)很少栽培，中心花能育，侧生小花能育或不育。目前，世界上大麦主要用作饲料和食用。在我国，大麦产量的三分之一用作啤酒，三分之二以上用作饲料和食用。青藏高原地区的藏民今天仍然以裸大麦为主食。苏啤4号原名“盐97024”，由江苏沿海地区农业科学研究所以盐96084 (申6/美酿黄金//单二大麦/3/单二大麦)/盐麦3号,于2004年育成,属弱春性中晚熟二棱啤酒大麦。苏啤4号为大穗大粒型品种，分蘖性强，成穗率一般，每公顷有效穗675万 750万，产量水平6000kg，产量潜力可达7500kg，鉴定编号为苏鉴大麦200902。经扬州大学农学院大田自然病圃鉴定，中抗大麦黄花叶病。用植物基因工程技术进行大麦遗传改良，提高大麦的产量、改善大麦的品质、增强大麦的抗病虫和抗逆能力，是大麦遗传育种的一个新的发展方向。在植物基因工程技术中，组织培养是不可缺失的一个重要环节，组织培养中愈伤组织的诱导率和分化率直接影响到离体培养再生植株的数量，提高愈伤组织的诱导率和分化率一直是本领域密切关注的课题。目前，对大麦品种进行组织培养的过程由愈伤组织诱导培养、幼苗分化培养和生根培养三个环节构成，使用的愈伤组织培养基中一般都含有常用的激素2，4-D,以苏啤4号为例，采用上述传统的组织培养方式获得的愈伤组织诱导率只能达到80%左右，愈伤组织分化率只能达到75%左右。
发明内容
本发明的目的在于针对目前二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株过程中，愈伤组织的分化率低的实际问题，提供一种新的二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株的方法。本发明的目的是这样实现的一种二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株的方法，包括愈伤组织诱导培养、幼苗分化培养和生根培养，其特征在于在愈伤组织诱导培养基上形成的愈伤组织后，进行愈伤组织的促分化培养，然后再进行幼苗分化培养和生根培养，具体方法是
a)将苏啤4号幼胚在愈伤组织诱导培养基上培养7-10天，形成良好的愈伤组织；
b)愈伤组织在促分化培养基上培养7-10天，再转移至分化培养基；
c)在分化培养基上培养15-20天，获得再生幼苗；
d)再生幼苗转到生根培养基上，培养20天左右，形成发育良好的根系，获得完整的再生植株；
愈伤组织诱导培养基为1/2MS培养基+ 2-4mg/L Dicamba + l_2mg/L ABA+ 30g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6. O ;
促分化培养基为改良MS培养基+ l-2g/L VBl + 150mg/L谷氨酰胺+ 30g/L蔗糖 + 3g/L植物凝胶，PH调至6. O ;
分化培养基为1/2MS培养基+ 3-5mg/L ZT + 20g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至
6.O ；
生根培养基为1/2MS培养基+0. 5 mg/L IAA+0. 5g/L麦芽提取物+20g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6.0 ;
愈伤组织诱导培养基、分化培养基和生根培养基中所述的1/2MS培养基是指MS基本培养基中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质的含量减半；促分化培养基中所述的改良MS培养基是指仅含有大量元素、微量元素和铁盐的MS基本培养基。在本发明中所述的愈伤组织诱导培养基、促分化培养基、分化培养基和生根培养基中的植物凝胶为PhytOgel或Gelrite。本发明的优点在于在愈伤组织诱导培养基中没有使用植物愈伤组织诱导常用的激素2，4-D，而以低浓度的除草剂Dicamba代替，可以促进诱导较为困难的植物材料在愈伤组织诱导培养基上形成的愈伤组织；在愈伤组织诱导培养基上形成的愈伤组织后，进行愈伤组织的促分化培养，然后再进行进行愈伤组织的促分化培养，然后再进行幼苗分化培养和生根培养，将苏啤4号的愈伤组织诱导率由常规培养方法的80%左右提高至100%，愈伤组织分化率由常规培养方法的75%左右提高到95%以上。
图I大麦苏啤4号愈伤组织的幼苗分化 图2大麦苏啤4号愈伤组织分化的幼苗生根图。
具体实施例方式实施例I
实验组 供试受体
大麦苏啤4号幼胚。各种培养基
愈伤组织诱导培养基1/2MS培养基+ 2-4mg/L Dicamba + l_2mg/L ABA+ 30g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6. O。促分化培养基为改良MS培养基+ l-2g/L VBl + 150mg/L谷氨酰胺+ 30g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6. O ;其中，改良MS培养基是指添加MS基本培养基的大量元素、微量元素和铁盐，而不添加MS基本培养基的有机物质。分化培养基为1/2MS培养基+ 3-5mg/L ZT + 20g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6. O。生根培养基为1/2MS培养基+ O. 5mg/L IAA+0. 5g/L麦芽提取物+20g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，PH调至6. O。上述各种培养基中，涉及的1/2MS培养基为MS基本培养基中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质的含量均减半；涉及的植物凝胶为Phytogel或者Gelrite。实验方法 供试取胚受体大麦苏啤4号的种子于2011年10月底播于盆钵中，2012年5月初取的幼嫩种子(种子内的幼胚大小为Imm左右)，置于I升的烧杯中，用酒精含量为75%溶液浸泡I分钟，用无菌水冲洗I次，再用升汞含量0.1%的表面消毒液消毒20分钟，用无菌水水洗5次。剥取Imm大小的幼胚，盾片向上放置于愈伤诱导培养基上，一般每个培养皿放置100个胚。置于黑暗的条件下培养，温度26°C，培养7-10天，形成愈伤组织。愈伤组织诱导率的计算方法如下
愈伤组织诱导率=形成愈伤组织的幼胚数/接种的总幼胚数X100%。计算结果显示，愈伤组织诱导率达到100%。先将形成的愈伤组织转至促分化培养基上光照下培养7-10天后，转移到分化培养基上光照下培养，在分化培养基上培养20天左右，即可获得l-2cm高的再生幼苗(见图I)。愈伤组织分化率的计算方法如下
愈伤组织分化率=分化I株及以上幼苗的愈伤组织块数/总愈伤组织块数X 100%。计算结果显示，愈伤组织分化率达到95%以上。将分化培养基上形成的幼苗接种在生根培养基上，10天左右开始有不定根萌发，20天左右平均每株根数可达到3飞条，形成完整的再生植株(见图2)。将具有3飞条根的再生植株移栽于由泥炭土和园土两者按体积比I :1的比例配制的基质中，采取穴盘移栽，半个月左右可获得移栽成活的幼苗。移栽的成活率可以达到95%以上。移栽成活的幼苗即可移植于盆钵，进行常规管理。实施例2 对照组
对照组采用任江萍等的方法[任江萍，李磊，王新国，尹钧.大麦幼胚离体培养条件的建立.麦类作物学报2005，25(6) :25-28]，由于该参考方法只有愈伤组织的诱导、幼苗分化等步骤，而没有介绍再生幼苗的生根培养方法，故对照组采用与实验组相同的生根培养方法。供试受体
大麦苏啤4号幼胚(与实验组同批次)。各种培养基
愈伤组织诱导培养基MS培养基+ 2 mg/L 2,4-D + O. 5mg/L ΑΒΑ+ O. 3g/L水解酪蛋白+ 50g/L麦芽糖+8g/L琼脂，PH调至5. 6-5. 7。
分化培养基为MS 培养基 +1.0 mg/L ZT + O. I mg/L IAA+ 50g/L 麦芽糖 +8g/L琼脂，PH调至5. 6-5. 7。 生根培养基为1/2MS培养基+ O. 5mg/L IAA+0. 5g/L麦芽提取物+20g/L蔗糖+3g/L植物凝胶，PH调至6. O。上述生根培养基中涉及的1/2MS培养基为MS基本培养基的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质的含 量减半，涉及的植物凝胶为Phytogel或Gelrite。实验方法
供试取胚受体大麦苏啤4号的种子于2011年10月底播于盆钵中，2012年5月初取的幼嫩种子(种子内的幼胚大小为Imm左右)，置于I升的烧杯中，用酒精含量为75%溶液浸泡I分钟，用无菌水冲洗I次，再用升汞含量0.1%的表面消毒液消毒20分钟，用无菌水水洗5次。剥取Imm大小的幼胚，盾片向上放置于愈伤诱导培养基上，一般每个培养皿放置100个胚。置于黑暗的条件下培养，温度26°C，培养7-10天，形成愈伤组织，计算结果显示，愈伤组织诱导率为80%左右(愈伤组织诱导率的计算方法与实施例I相同)。将形成的愈伤组织在诱导培养基上培养至14天转至分化培养基上光照下培养，在分化培养基上培养20天左右，可获得l_2cm高的再生幼苗。计算结果显示，愈伤组织分化率在75%左右(愈伤组织分化率的计算方法与实施例I相同)。将形成的幼苗接种在生根培养基上，10天左右开始有不定根萌发，20天左右平均每株根数可达到3飞条，形成完整的再生植株。将具有3飞条根的再生植株移栽于由泥炭土和园土两者按体积比I :1的比例配制的基质中，采取穴盘移栽，半个月左右可获得移栽成活的幼苗。移栽的成活率为95%左右。移栽成活的幼苗即可移植于盆钵，进行常规管理。将实施例I和实施例2的实验结果进行比较，可以看出采用本发明的实施例1，愈伤组织诱导率和分化率均明显高于实施例2，愈伤组织诱导率达到100%，愈伤组织分化率达到95%以上；而实施例2 (对照组)采用传统的培养方法，愈伤组织诱导率只有80%左右，愈伤组织分化率只有75%左右。实施例I涉及的实验方法不是对本发明的具体限制，只要本领域的普通技术人员根据本实施例的启示，运用相同或相近似的方法对大麦苏啤4号幼胚进行组织培养，都属于本发明的保护范畴。
权利要求
1.一种二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株的方法，包括愈伤组织诱导培养、幼苗分化培养和生根培养，其特征在于在愈伤组织诱导培养基上形成的愈伤组织后，进行愈伤组织的促分化培养，然后再进行幼苗分化培养和生根培养，具体方法是 a)将苏啤4号幼胚在愈伤组织诱导培养基上培养7-10天，形成良好的愈伤组织； b)愈伤组织在促分化培养基上培养7-10天，再转移至分化培养基； c)在分化培养基上培养15-20天，获得再生幼苗； d)再生幼苗转到生根培养基上，培养20左右，形成发育良好的根系，获得完整的再生植株； 愈伤组织诱导培养基为1/2MS培养基+ 2-4mg/L Dicamba + l_2mg/L ABA+ 30g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6. O ; 促分化培养基为改良MS培养基+ l-2g/L VBl + 150mg/L谷氨酰胺+ 30g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6. O ; 分化培养基为1/2MS培养基+ 3-5mg/L ZT + 20g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6.O ； 生根培养基为1/2MS培养基+0. 5 mg/L IAA+0. 5g/L麦芽提取物+20g/L蔗糖+ 3g/L植物凝胶，PH调至6.0 ; 愈伤组织诱导培养基、分化培养基和生根培养基中所述的1/2MS培养基是指MS基本培养基中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物质的含量减半；促分化培养基中所述的改良MS培养基是指仅含有大量元素、微量元素和铁盐的MS基本培养基。
2.根据权利要求I所述的一种二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株的方法,其特征在于各培养基中所述的植物凝胶均为Phytogel或Gelrite。
全文摘要
本发明涉及一种二棱大麦苏啤4号的幼胚离体培养再生植株的方法，在愈伤组织诱导培养基上形成愈伤组织后，进行愈伤组织的促分化培养，然后再进行幼苗分化培养和生根培养。其优点是在愈伤组织诱导培养基中不含植物愈伤组织诱导常用的激素2,4-D,而以低浓度的除草剂Dicamba代替，可以促进诱导较为困难的植物材料在愈伤组织诱导培养基上形成的愈伤组织。在愈伤组织诱导培养基上形成的愈伤组织后，进行愈伤组织的促分化培养，然后再进行幼苗分化培养和生根培养，能将苏啤4号的愈伤组织诱导率提高至100%，将愈伤组织分化率提高到95%以上。
文档编号A01H4/00GK102919130SQ20121046707
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者余桂红, 张旭, 孙晓波, 马鸿翔, 王磊 申请人:江苏省农业科学院