专利名称：一株短小芽孢杆菌及其在防治小麦禾谷孢囊线虫病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株短小芽孢杆菌及其在防治小麦禾谷孢囊线虫病中的应用。
背景技术：
禾谷抱囊线虫又名燕麦抱囊线虫(Heterodera avenae Wollen-weber 1924,Cereal Cyst Nematodes,简称CCN),为世界性禾谷类作物的病原线虫,现已对我国11个省市(自治区、直辖市)的小麦造成危害，而且逐年加重，成为小麦生产上的主要病害。目前对小麦禾谷孢囊线虫病的防治主要是化学防治和抗病品种的利用。具有较好防效的化学杀线剂，如铁灭克(Temik)、呋喃丹(Furadan)等，属于高毒农药，存在毒性大、成本高、污染环境、危害人类健康等问题，在生产上不能得到推广应用。选育抗禾谷孢囊线虫新品种是防治根线虫病最为有效的方法，但是已鉴定的抗禾谷孢囊线虫基因普遍存在于小麦近源属(如大麦属、燕麦属、山羊草属等)中，来源于六倍体小麦的抗禾谷孢囊线虫基因十分有限，使得抗病育种进展缓慢。禾谷孢囊线虫种内存在严重致病型分化现象，抗性基因对不同致病型的禾谷孢囊线虫具有不同抗性，导致品种抗性分布不稳定，很容易造成抗性品种抗性的丢失。目前我国种植的小麦品种中还没有发现对禾谷孢囊线虫完全免疫的品种。源于对环境友好、绿色无公害、有利于人类健康，生物防治在植物病害防治研究中一直处于热点。虽然国内外在植物寄生线虫生防细菌的种类、筛选、防治效果和土壤添加剂等方面也有了一些研究，但生产上还没有应用效果稳定的生防制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株短小芽孢杆菌及其在防治小麦禾谷孢囊线虫病中的应用。
本发明提供的菌株属于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),命名为B202,已于2012年03月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.5838。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) B202 CGMCC N0.5838 简称短小芽孢杆菌 B202。本发明还保护短小芽孢杆菌B202在制备小麦禾谷孢囊线虫生防制剂中的应用。本发明还保护一种小麦禾谷孢囊线虫生防制剂，其活性成分为如下(a)、(b)、(C)和(d)中的至少一种:(a)短小芽孢杆菌B202的发酵培养物(包括发酵上清和菌体);(b)短小芽孢杆菌B202 ; (c)短小芽孢杆菌B202的芽孢；(d)短小芽孢杆菌B202的发酵上清。本发明还保护一种防治植物发生小麦禾谷孢囊线虫病的方法，包括在播种前将待测植物种子进行如下处理的步骤:用短小芽孢杆菌B202的芽孢悬浮液对待测植物的种子进行浸种处理。所述待测植物具体可为小麦(小麦品种“温麦19”)。所述短小芽孢杆菌B202的芽孢悬浮液的具体制备方法如下:将短小芽孢杆菌B202的芽孢悬浮于无菌水，得到芽孢浓度为8X IO8个/ml的芽孢悬浮液。所述浸种的时间具体可为I小时。
本发明还保护另一种防治植物发生小麦禾谷孢囊线虫病的方法，包括将待测种子进行如下处理的步骤:(I)将待测植物种子用短小芽孢杆菌B202的菌体浸种；(2)将完成步骤(I)的种子催芽，得到幼苗；(3)将步骤(2)得到的幼苗用短小芽孢杆菌B202的发酵上
清灌根。所述待测植物具体可为小麦(小麦品种“温麦19”)。所述短小芽孢杆菌B202的发酵培养物具体按照如下方法制备:将短小芽孢杆菌B202接种到NA改良培养基中，振荡培养得到0D6(l(lmi=4.0的发酵培养物。所述短小芽孢杆菌B202的发酵上清具体按照如下方法制备:将所述发酵培养物4000rpm离心30min,收集上清液。NA改良培养基(pH7.0)由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度如下:3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、3g/L葡萄糖。
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采用芽孢杆菌(Bacillus spp.)进行生物防治具有如下优势:适应性广；作用机制多样，不易产生抗药性；发酵周期短，生产成本低；形成芽孢、易储运；环境友好，对人畜安全。本发明提供了一株短小芽孢杆菌B202，通过室内杀线活性、温室盆栽和田间试验筛选证明其对小麦禾谷孢囊线虫病具有稳定防治效果，为小麦禾谷孢囊线虫生防制剂的研发奠定了基础。
图1为B202菌株的形态(10倍放大的照片)。图2为B202菌株的形态(40倍放大的照片)。图3为B202菌株的形态(100倍放大的照片)。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。小麦禾谷抱囊线虫(Heteroderaavenae):Yuan, H.X., Sun, J.ff., Yang, ff.X.，Xing, X，P.，Wang, Z.Y.，Riley, L.T.，and Li，H.L.New pathotypes of Heteroderaavenae (cereal cyst nematode)from winter wheat in Zhengzhou, Henan, China.[J].Australasian Plant Pathology 2010，39:107-111。小麦品种“温麦19”(小麦禾谷孢囊线虫病感病品种):由河南省农业科学院植保所提供；袁虹霞，年高磊，邢小萍，付博，张鹏，李洪连.鲁豫皖交界地区四个小麦禾谷孢囊线虫群体致病型鉴定.植物保护学报，2011, 38(5):408-412。实施例1、短小芽孢杆菌B202菌株的获得和鉴定一、短小芽孢杆菌B202菌株的获得从中国中部平原小麦主产区河南省、河北省和陕西省地区小麦禾谷孢囊线虫发病严重的地块挖取重病小麦和健康小麦，保留根部土壤。小心去掉小麦植株根部土壤，随机剪取新生主根和毛细根，置于50ml含玻璃珠的无菌水中，充分摇动。将根取出，获得土壤悬液。取出的根系先用无菌水冲洗，然后用1%次氯酸钠消毒8分钟，再用无菌水漂洗4次，冲净残余次氯酸钠，将2克根和IOml无菌水并适当加少量石英砂于无菌研钵中研磨，获得根系悬液。将各个悬液摇匀，取Iml加入装有9ml无菌水的试管中，混合均匀后梯度稀释至1(Γ6浓度，将10'10'Kr6浓度的稀释液在80°C的水浴中保持30min以杀死大部分的非芽孢细菌，取100 μ I涂布牛肉膏平板，每个稀释度涂平板3个，30°C保存培养。培养3天后，挑取不同的单菌落，进行转管并在4°C下保存备用。共获得293株芽孢杆菌，其中根内生芽孢杆菌74株，根际土壤芽孢杆菌219株，根际土壤的芽孢杆菌数量明显多于根内生芽孢杆菌数量。将其中I个纯培养的菌株命名为B202菌株。二、B202菌株的形态特征和分子鉴定结果B202菌株的 形态见图1 (10倍放大的照片)、图2 (40倍放大的照片)和图3(100倍放大的照片)。B202菌株的菌株形态为呈短杆状，菌体大小0.54X2.3um，具内生芽孢。在牛肉膏蛋白胨培养基平板上37 °C培养48小时后，菌落突起，菌落呈圆形，表面光滑，边缘光滑细腻，菌落不透明，颜色为乳白色，直径1.3mm 2.1mm。革兰氏染色阳性。提取B202菌株的总DNA，对16S rDNA进行扩增，将扩增产物进行测序(见序列表的序列I )，将测序结果在NCBI的GENBANK比对，结论如下:菌株B202和Bacillus pumilus相似度最高，为99%。通过Biolog GEN III系统鉴定，SIM等于0.674，大于0.5。根据以上鉴定结果,菌株B202属于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)B202已于2012年03月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJias:北京市朝阳区北辰西路I号院 3 号)，保藏号为 CGMCC N0.5838。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)B202CGMCC N0.5838简称短小芽孢杆菌B202。实施例2、短小芽孢杆菌B202的培养1、将短小芽孢杆菌B202单菌落接种到NA改良培养基(溶剂为水，含有3g/L牛肉膏、5g/L蛋白胨、3g/L葡萄糖；pH7.0)中，30°C、180rpm/min振荡培养48小时，得到OD600nm=4.0的发酵体系悬液。2、将步骤I得到的发酵体系悬液4000rpm离心30min，分别收集上清液和菌体沉淀。3、将步骤2得到的菌体沉淀悬浮于无菌水，得到芽孢浓度为8X IO8个/ml的芽孢
悬浮液。实施例3、室内条件下短小芽孢杆菌B202对小麦禾谷孢囊线虫活性影响1、将小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫用无菌水悬浮。2、分组处理如下:实验组:将250 μ I步骤I得到的悬浮液(含100±5条小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫)与250 μ I实施例2得到的发酵体系悬液混合,常温培养24小时。对照组:将250 μ I步骤I得到的悬浮液(含100±5条小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫)与250 μ I无菌水混合，常温培养24小时。3、在步骤2的各个培养体系中各加入lmol/L NaOH水溶液(在碱性刺激下存活的幼虫会动,不动的幼虫计为死亡幼虫),统计小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫的死亡率。死亡率(％)=死亡线虫数/供试线虫数X 100%。校正死亡率(％)=(实验组的死亡率-对照组的死亡率)/(1-对照组的死亡率)X 100%O进行三次重复实验，每次重复实验中设置3个重复处理，结果取平均值。实验组的死亡率为100%，对照组的死亡率为0%，校正死亡率为100%。结果表明，短小芽孢杆菌B202可以使小麦禾谷孢囊线虫幼虫死亡。实施例4、温室盆栽条件下短小芽孢杆菌B202对小麦禾谷孢囊线虫病的防治1、从北京地区延庆县玉米田中取表层土，将10体积份表层土、3体积份蛭石、2体积份草炭和I体积份腐熟鸡粪混合，然后180°C干热灭菌3小时，得到培养基质。2、将小麦品种“温麦19”的种子用实施例2得到的菌体沉淀浸种I小时，然后进行催芽。3、取IOcmX IOcm的培养钵，每个培 养钵放入450g培养基质，轻轻压实，然后放置完成步骤2的种子，每个培养钵5粒种子，然后在种子上覆盖l_2cm的培养基质，将培养钵放在塑料托盘中，从盘中浇透水后放在15_20°C培养室中培养，种子出苗后，用实施例2得到的上清液灌根，每株IOml。4、步骤3中的种子出苗7天后，用玻璃棒在培养钵中的小麦幼苗的根部附近插入3-6cm深的小洞，灌注用无菌水制备的小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫的悬浮液(200条幼虫/株)，用培养基质封上小洞，每隔3天采用相同的步骤接种小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫一次，共接种3次。设置不用菌体沉淀浸种且不用上清液灌根的空白对照。设置不用菌体沉淀浸种，而改用1.8%阿维菌素乳油的1000倍稀释液代替实施例2的上清液进行灌根的阳性对照。从第一次接种小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫开始计天数，60天后调查小麦根部根结形成情况，将植株连根挖出(尽可能保持根系完整)，用自来水洗干净，放在盛有清水的塑料盘中进行病情调查，计算防治效果。病情分级标准如下:O级:根部无根结；I级:每株根部有1-5个根结；2级:每株根部有6-10个根结；3级:大部分根上有根结，单株10个根结以上；4级:根结相连成须根团，难以计数。病情指数(％) = Σ (级数X同级株数)/ (总株数X4) X 100%。防治效果(％)=(空白对照组病情指数-实验组或阳性对照组病情指数)/空白对照组病情指数X100%。进行三次重复实验，每次重复实验中设置30株植株作为重复处理，结果取平均值。实验组的病情指数为37.50%,空白对照组的病情指数为91.67%，阳性对照组的病情指数为50%。实验组的防治效果为59.09%,阳性对照组的防治效果为45.45%。
实施例5、田间条件下短小芽孢杆菌B202对小麦禾谷孢囊线虫病的防治2010年试验:地点为中国农业大学上庄试验站，播种时间为2010年10月22日。2011年实验:地点为河南省许昌市河街乡黄庄村，播种时间为2011年10月21日。一、实验方法1、将短小芽孢杆菌B202接种于NA改良培养基，30°C、180rpm/min振荡培养48小时，4000rpm离心30min，收集菌体，悬浮于无菌水，得到芽孢浓度为8 X IO8个/ml的芽孢悬浮液。2、分组处理如下:实验组:将小麦品种“温麦19”的种子用步骤I得到的芽孢悬浮液浸种I小时；空白对照组:将小麦品种“温麦19”的种子用无菌水浸种I小时；阳性对照组:将小麦品种“温麦19”的种子用1.8%阿维菌素乳油的1000倍稀释液浸种I小时。3、将农田中，随机划分9个区域(每个区域60m2)，将完成步骤2的种子每组种子播种3个区域，各区域四周设置保护行。小麦灌浆期调查小麦孢囊线虫发病情况。每个小区随机三点取样调查，每点取10株，用铁锹连同植株根系土壤挖出，带回室内调查小麦根部调查孢囊数，进行分级，计算病情指数和防治效果。对病情指数使用SPSS进行方差分析和显著性检验。
分级标准:O级:根部无孢囊,无病；I级:感染极轻微(1-5个孢囊/单株)；2级:轻度发生(6-20个孢囊/单株)；3级:中度发生(20-40个孢囊/单株)；4级:严重发生(单株孢囊在40个以上)。病情指数(％) = Σ (级数X同级株数)/ (总株数X4) X 100%。防治效果(％)=(空白对照组病情指数-实验组或阳性对照组病情指数)/空白对照组病情指数X100%。结果见表I和表2。表12010年菌株B202对小麦禾谷孢囊线虫田间防治效果
权利要求
1.短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus) B202，其保藏编号为 CGMCC N0.5838。
2.权利要求1所述短小芽孢杆菌在制备小麦禾谷孢囊线虫生防制剂中的应用。
3.一种小麦禾谷孢囊线虫生防制剂，其活性成分为如下(a)、(b)、(c)和(d)中的至少一种: Ca)权利要求1所述短小芽孢杆菌的发酵培养物； (b)权利要求1所述短小芽孢杆菌； (c)权利要求1所述短小芽孢杆菌的芽孢； Cd)权利要求1所述短小芽孢杆菌的发酵上清。
4.一种防治植物发生小麦禾谷孢囊线虫病的方法，包括在播种前将待测植物种子进行如下处理的步骤:用权利要求1所述短小芽孢杆菌的芽孢悬浮液对待测植物的种子进行浸种处理。
5.一种防治植物发生小麦禾谷孢囊线虫病的方法，包括将待测种子进行如下处理的步骤: (1)将待测植物种子用权利要求1所述短小芽孢杆菌的菌体浸种； (2)将完成步骤(I)的种子催芽，得到幼苗； (3)将步骤(2)得到的幼苗用`权利要求1所述短小芽孢杆菌的发酵上清灌根。
全文摘要
本发明公开了一株短小芽孢杆菌及其在防治小麦禾谷孢囊线虫病中的应用。本发明提供的菌株属于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，命名为B202，保藏号为CGMCCNo.5838。本发明还保护短小芽孢杆菌B202在制备小麦禾谷孢囊线虫生防制剂中的应用。本发明还保护一种小麦禾谷孢囊线虫生防制剂，其活性成分为如下(a)或(b)或(c)或(d)中的至少一种(a)短小芽孢杆菌B202的发酵体系；(b)短小芽孢杆菌B202；(c)短小芽孢杆菌B202的芽孢；(d)短小芽孢杆菌B202的发酵体系的上清液。本发明提供法人短小芽孢杆菌B202对小麦禾谷孢囊线虫病具有稳定防治效果，为小麦禾谷孢囊线虫生防制剂的研发奠定了基础。
文档编号A01P5/00GK103103155SQ20131004605
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者王 琦, 李洪涛, 李燕 申请人:中国农业大学