专利名称：一种适宜南高丛蓝莓高效快繁技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蓝莓高效快繁技术，具体涉及一种适宜南高丛蓝莓高效快繁技术。
背景技术：
蓝莓属杜胃$花科(Ericaeae)越桔亚科(Vaccinioideae)越橘属(Vaccinium)。蓝莓果实富含花青素、不饱和脂肪酸、鞣酸及钙、钾、锌、铁等元素，B族维生素含量尤为突出，被国际粮农组织列为五大健康食品之一，堪称世界水果之王，是近几年来发展最迅速的集营养与保健于一身的第3代果树品种[1_4]。近几年，蓝莓鲜果和加工品风靡欧美等发达国家市场，虽然价格昂贵但仍供不应求，其传统的北美产区的产量己远不能满足本地和世界市场的需求，为此世界上其他国家己先后引种。我国有着可以生产蓝莓的广阔天地，南方红黄壤土地面积达2179600km2，占全国土地面积的22%，其中2040000km2 土壤属酸性，而且很大一部分pH < 5.0[5]。由于土壤酸度大和肥力不足，农业生产水平较低，人民生活水平低下。蓝莓特别适合酸性和强酸性土壤，正是红黄壤地区脱贫致富的理想作物。奥尼尔(O' Neal)为南高丛蓝莓的代表品种之一，果实大粒、蒂痕小、果粉较少、果肉质硬耐储运、丰产、香味浓，在南高丛蓝莓品种中香味评价较高，适宜在长江流域大部分地区种植。随着引种规模日益扩大,优良种苗需求量急剧增加,种苗生产供不应求。组织培养凭借其无性繁殖的独特优势，可以迅速去除病毒和更新品种，保留品种的本来特性，变异性小，并且可在较小空间内和较短时间内快速地获得大量无性系组培苗，成为蓝莓脱毒和快速繁殖的主要途径。目前，国内外蓝莓组织培养技术的研究己取得一定的成果，国内在带芽茎段诱导和增殖方面的研究报道较多，而国外在对叶片进行直接再生的研究占了较大的比例。我们从带芽茎段诱导增 殖、叶片直接再生、瓶内生根、到炼苗各环节就南高丛蓝莓奥尼尔建立了一种适宜于蓝莓苗木的工厂化育苗技术体系，以满足商品基地建设的需要。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，组织培养凭借其无性繁殖的独特优势，可以迅速去除病毒和更新品种，保留品种的本来特性，变异性小，并且可在较小空间内和较短时间内快速地获得大量无性系脱毒组培苗，成为蓝莓脱毒和快速繁殖的主要途径，本发明就兔眼蓝莓建立了一种脱毒高速快繁的有效方法。本发明的技术方案是:一种适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，a、选材:植物材料为智博生物科技公司种植园种植的南高丛蓝莓品种奥尼尔，夕卜植体材料选用当年生幼嫩枝；b、初代培养获得无菌苗:以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片。用洗衣粉水溶液洗净灰尘等污物后，自来水冲洗。转到超净工作台上，先后用75%酒精和0.1%升汞对外植体分别进行50s与IOmin的表面灭菌，接着用无菌水冲洗4次，2分钟/次，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分，将灭菌后的嫩枝切段形成l-2cm长的单芽茎段，然后放置在初代培养基中培养，诱导侧芽萌发；C、继代培养的优化:待单芽茎段的茎段腋芽伸长后，将茎段腋芽切下转接于含有不同浓度激素组合的改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉的增殖培养基(pH =5.2)中进行光照培养，光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗；改良WPM培养基的改良方法是:以Ca(NO3)2.4H20、KNO3代替原WPM培养基中的CaCl2、K2SO4 ；d、叶片再生体系的建立:将继代培养2个月的无菌苗植株叶片切下，按垂直叶片主脉离叶尖端的1/3处切下叶片分成叶尖端和叶柄端，将叶尖端、叶柄端和全叶这三部分均背面朝下分开放置接种于不同盐浓度和不同ZT浓度的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)的培养瓶内，每瓶各10片左右，每个处理组重复12瓶。先进行20d的暗培养，暗培养的温度为25±2°C,随后进行光照培养,光照培养条件为:温度25±2°C,光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，30d后统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数，从而获得最佳的叶片再生体系；e、试管苗生根培养:将继代培养的无菌苗植株距顶端2.5 3.0cm左右切下，随机接种于含有不同盐浓度、不同IBA浓度和不同活性碳浓度组合的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)的培养瓶中进行光照培养，光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，记录起始生根时间，60d后统计生根率和生根数并观察苗的生长状况，从而筛选 出最适宜的生根培养基；f、炼苗:提前3d将瓶内生根试管苗打开瓶盖进行过渡，洗净根部培养基，随机移栽于不同炼苗基质，在保持湿度100%的育苗大棚中培养20d，然后在湿度80%、透光度70 %的室外条件下过渡3d，再逐步通风换气，7d后完全揭去棚膜，2周后统计成活率，每套基质的栽植量不少于50株，各试验的重复次数不少于3次，统计成活率，以完成炼苗。优选地，步骤b中初代培养基为改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉+1.0mg/L ZT，其 pH = 5.2。优选地，步骤c中，待单芽茎段的茎段腋芽伸长后，将茎段腋芽切下转接于含有不同浓度ZT、6-BA或TDZ的改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉的增殖培养基(pH = 5.2)中进行光照培养。优选地，步骤c中，不定芽的发生率与培养基中的ZT浓度有密切的关系；当ZT质量浓度为0.5mg/L时，培养IOd左右在茎基部产生黄绿色的愈伤组织，节处出现丛生芽，28d后增殖率达到5.02倍，且主要为主枝芽，丛生芽粗壮，生长势头好，呈鲜嫩状；当ZT质量浓度升高到lmg/L时，开始生长和分化的时间与0.5mg/L时相差不大，其增殖率稍有所增加；当ZT质量浓度等于和高于2mg/L时，再生苗开始生长和分化现象提前，多数分化出来的新梢枝上出现2次枝，增殖率达到10倍左右，由于侧枝芽多使苗长势较弱易出现玻璃化苗现象；使用6-BA时，外植体不萌芽生长，生长停滞。使用TDZ时，IOd后在外植体基部形成少量愈伤，虽然能萌芽，但萌芽率低且生长缓慢；从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本等方面进行综合考虑，继代培养基以WPM+0.5mg/L ZT为最佳。优选地，在步骤d中，在不同盐浓度的培养瓶中统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数，高盐浓度不利于叶片的再生，其诱导再生苗率为0-2.7% ;将大量元素浓度减少一半，能明显促进叶片的再生，叶片诱导再生苗率提高至23.1-70.9% ;在叶片不同部位中，叶尖端的再生苗诱导率最低，叶柄端居中，全叶的诱导率最高。优选地，在步骤d中，在不同浓度ZT或TDZ的培养瓶中统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数；TDZ不能诱导叶片形成再生苗，叶片培养IOd后在切口处形成愈伤组织，随着培养时间的延长，愈伤组织慢慢褐化，未见再生苗形成；ZT对叶片再生苗诱导效果明显优于TDZ，不定芽的发生率与培养基中的ZT有密切的关系，ZT对叶片再生苗诱导存在明显的浓度效应，叶尖端在0.5mg/L ZT时诱导率为0%，随着ZT浓度的升高诱导率逐渐增力口，在5mg/L ZT时的诱导率达到32.3%;叶柄端和全叶的诱导率均随ZT质量浓度的升高逐渐增加，在2.0mg/L ZT时诱导率均达到最高，叶柄端和全叶的再生苗诱导率分别为54.3%和71.4%,5mg/L ZT时的诱导率却均下降；不同部位叶片的再生苗诱导率存在明显差异，叶尖端的诱导率最低，叶柄端的居中，全叶的诱导率最高；低浓度ZT主要诱导形成单生苗，而高浓度ZT有利于簇生苗的形成；叶尖端叶片诱导的重生苗主要形成于切口处，叶柄端和全叶诱导的再生苗主要形成于叶柄一侧；选用全叶进行叶片再生苗诱导，其再生苗诱导的最佳ZT质量浓度为2.0mg/L。优选地，在步骤e中，不同盐浓度对单个芽苗的生根诱导存在重要影响，高盐浓度不利于芽苗生根，开始生根时间长且生根率仅为30%;当大量元素减半时，约14d后开始生根和生根率为75% ;当大量元素减少到原来的1/4时，开始生根时间提前为7天左右且生根率高达100%，苗长势强；大量元素减少到原来的1/8时，虽然开始生根时间和生根率与大量元素减少到原来的1/4的相似，然而由于营养物质的缺乏，苗长势弱，适当降低盐浓度有利于生根且不影响苗的生长，奥尼尔试管苗瓶内生根的生根培养基的盐浓度选用大量元素减少到原来的1/4。优选地，在步骤e中 ，活性炭对培养瓶内生根具有重要影响，当培养基中无活性炭时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后在其上生根，由于根茎之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势很差；培养基中添加活性炭后，茎基部很少或不长愈伤组织而直接从茎上生根，从而有利于苗的生长；活性炭对生根存在浓度效应，随着活性炭浓度的升高，生根率愈高、生根数愈多且根愈长，苗长势愈好；当活性炭为0.05%时，生根率为58% -75%，每株生根数1-3条，根长l-3cm，苗生长较慢；当活性炭提高至0.2%时，生根率提高20%左右，每株生根数达4条以上，根长4-6cm，苗生长快；IBA对奥尼尔生根也具有浓度效应，高浓度IBA更有利于生根，活性炭与IBA两者之间存在协同效应，两者浓度均高时，生根率及苗长势都愈好。在0.2%活性炭、0.6mg/L和0.8mg/L IBA的有效生根率均达到100%，但是后者起始生根的时间和根长均比前者早和长，后者7天左右可见茎基部有根形成，45天左右长出4-6条根,根长达6cm左右,苗高9cm以上，叶色碧绿叶片大,苗生长健壮，奥尼尔瓶内生根培养基中最佳的活性炭浓度和IBA浓度分别为0.2%和0.8mg/L,有效生根率高达100%。优选地,步骤f中:炼苗基质选择草炭:河沙=1:1 ;或者草炭:园土 = 1:1;或者草炭:石英砂=2 3:1 ;或者草炭:珍珠岩=I 2:1 ;或者纯水苔藓。优选地，步骤f中:生根试管苗在五种不同炼苗基质中生长，其中纯水苔藓的效果最好，成活率高达100%，苗木的生长量达3cm以上，新增叶片6-8枚；效果其次的是2 3: I的草炭与石英砂组合，其成活率为84%，苗木的生长量较高；I: I的草炭与河沙基质的成活率仅为50%，但成活苗的质量却很高，表现为生长墩实、植株健壮、生长量与“草炭+石英砂”相当；草炭+园土基质与草炭+珍珠岩基质的效果居中。本发明的有益技术效果是:为获得南高丛蓝莓奥尼尔高效快繁的技术体系，以奥尼尔幼嫩茎段为试验材料，对增殖培养基、叶片再生体系、生根培养基、炼苗基质进行了优化。结果表明，改良WPM+0.5mg/L ZT的增殖培养基能使新梢增殖率提高4倍以上，且丛生苗生长健壮和生长速度快；降低盐浓度有利于叶片再生苗的诱导，全叶的再生诱导优于切断叶片的再生，前者在1/2改良WPM+2.0mg/L ZT的培养基中的再生率高达71%，且主要形成簇生苗；1/4改良WPM+0.2%活性碳+0.8mg/L IBA的生根培养基能使试管苗生根率达100% ;以水苔藓为炼苗基质可使幼苗的成活率高达100%。因此，将最佳的增殖培养、叶片再生和生根培养相结合，加上有效的幼苗成活基质，可高效、快速、持续获得优良的奥尼尔组培种苗。
图1是本发明实施例适宜南高丛蓝莓高效快繁技术的不同炼苗基质对试管苗成活率的影响的柱形图。 本发明目的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施例方式应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。具体实施的一种适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，包括以下步骤:a、选材:植物材料为智博生物科技公司种植园种植的南高丛蓝莓品种奥尼尔，夕卜植体材料选用当年生幼嫩枝；b、初代培养获得无菌苗:以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片。用洗衣粉水溶液洗净灰尘等污物后，自来水冲洗。转到超净工作台上，先后用75%酒精和0.1%升汞对外植体分别进行50s与IOmin的表面灭菌，接着用无菌水冲洗4次，2分钟/次，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分，将灭菌后的嫩枝切段形成l-2cm长的单芽茎段，然后放置在初代培养基中培养，诱导侧芽萌发；C、继代培养的优化:待单芽茎段的茎段腋芽伸长后，将茎段腋芽切下转接于含有不同浓度激素组合的改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉的增殖培养基(pH =5.2)中进行光照培养，光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗；改良WPM培养基的改良方法是:以Ca(NO3)2.4H20、KNO3代替原WPM培养基中的CaCl2、K2SO4 ；d、叶片再生体系的建立:将继代培养2个月的无菌苗植株叶片切下，按垂直叶片主脉离叶尖端的1/3处切下叶片分成叶尖端和叶柄端，将叶尖端、叶柄端和全叶这三部分均背面朝下分开放置接种于不同盐浓度和不同ZT浓度的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)的培养瓶内，每瓶各10片左右，每个处理组重复12瓶。先进行20d的暗培养，暗培养的温度为25±2°C,随后进行光照培养,光照培养条件为:温度25±2°C,光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，30d后统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数，从而获得最佳的叶片再生体系；e、试管苗生根培养:将继代培养的无菌苗植株距顶端2.5 3.0cm左右切下，随机接种于含有不同盐浓度、不同IBA浓度和不同活性碳浓度组合的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)的培养瓶中进行光照培养，光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，记录起始生根时间，60d后统计生根率和生根数并观察苗的生长状况，从而筛选出最适宜的生根培养基；f、炼苗:提前3d将瓶内生根试管苗打开瓶盖进行过渡，洗净根部培养基，随机移栽于不同炼苗基质，于组培室条件下保持 湿度100%的育苗大棚中培养20d，然后在湿度80%、透光度70%的室外条件下过渡3d，再逐步通风换气，7d后完全揭去棚膜，2周后统计成活率，每套基质的栽植量不少于50株，各试验的重复次数不少于3次，统计成活率，以完成炼苗。本发明的特征在于，步骤b中初代培养基为改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L 日产琼脂粉 +1.0mg/L ZT，其 pH = 5.2。本发明的特征在于，步骤c中，待单芽茎段的茎段腋芽伸长后，将茎段腋芽切下转接于含有不同浓度ZT、6-BA或TDZ的改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉的增殖培养基(pH = 5.2)中进行光照培养。本发明的特征在于，步骤c中，不定芽的发生率与培养基中的ZT浓度有密切的关系；当ZT质量浓度为0.5mg/L时，培养IOd左右在茎基部产生黄绿色的愈伤组织，节处出现丛生芽，28d后增殖率达到5.02倍，且主要为主枝芽，丛生芽粗壮，生长势头好，呈鲜嫩状；当ZT质量浓度升高到lmg/L时，开始生长和分化的时间与0.5mg/L时相差不大，其增殖率稍有所增加；当ZT质量浓度等于和高于2mg/L时，再生苗开始生长和分化现象提前，多数分化出来的新梢枝上出现2次枝，增殖率达到10倍左右，由于侧枝芽多使苗长势较弱易出现玻璃化苗现象；使用6-BA时，外植体不萌芽生长，生长停滞。使用TDZ时，IOd后在外植体基部形成少量愈伤，虽然能萌芽，但萌芽率低且生长缓慢；从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本等方面进行综合考虑，继代培养基以WPM+0.5mg/L ZT为最佳。本发明的特征在于，在步骤d中，在不同盐浓度的培养瓶中统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数，高盐浓度不利于叶片的再生，其诱导再生苗率为0-2.7% ;将大量元素浓度减少一半，能明显促进叶片的再生，叶片诱导再生苗率提高至23.1-70.9% ;在叶片不同部位中，叶尖端的再生苗诱导率最低，叶柄端居中，全叶的诱导率最高。本发明的特征在于，在步骤d中，在不同浓度ZT或TDZ的培养瓶中统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数；TDZ不能诱导叶片形成再生苗，叶片培养IOd后在切口处形成愈伤组织，随着培养时间的延长，愈伤组织慢慢褐化，未见再生苗形成；ZT对叶片再生苗诱导效果明显优于TDZ，不定芽的发生率与培养基中的ZT有密切的关系，ZT对叶片再生苗诱导存在明显的浓度效应，叶尖端在0.5mg/L ZT时诱导率为0%，随着ZT浓度的升高诱导率逐渐增加，在5mg/L ZT时的诱导率达到32.3%;叶柄端和全叶的诱导率均随ZT质量浓度的升高逐渐增加，在2.0mg/L ZT时诱导率均达到最高，叶柄端和全叶的再生苗诱导率分别为54.3%和71.4%,5mg/L ZT时的诱导率却均下降；不同部位叶片的再生苗诱导率存在明显差异，叶尖端的诱导率最低，叶柄端的居中，全叶的诱导率最高；低浓度ZT主要诱导形成单生苗，而高浓度ZT有利于簇生苗的形成；叶尖端叶片诱导的重生苗主要形成于切口处，叶柄端和全叶诱导的再生苗主要形成于叶柄一侧；选用全叶进行叶片再生苗诱导，其再生苗诱导的最佳ZT质量浓度为2.0mg/L。本发明的特征在于，在步骤e中，不同盐浓度对单个芽苗的生根诱导存在重要影响，高盐浓度不利于芽苗生根，开始生根时间长且生根率仅为30% ;当大量元素减半时，约14d后开始生根和生根率为75% ;当大量元素减少到原来的1/4时，开始生根时间提前为7天左右且生根率高达100%，苗长势强；大量元素减少到原来的1/8时，虽然开始生根时间和生根率与大量元素减少到原来的1/4的相似，然而由于营养物质的缺乏，苗长势弱，适当降低盐浓度有利于生根且不影响苗的生长，奥尼尔试管苗瓶内生根的生根培养基的盐浓度选用大量元素减少到原来的1/4。本发明的特征在于，在步骤e中，活性炭对培养瓶内生根具有重要影响，当培养基中无活性炭时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后在其上生根，由于根茎之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势很差；培养基中添加活性炭后，茎基部很少或不长愈伤组织而直接从茎上生根，从而有利于苗的生长；活性炭对生根存在浓度效应，随着活性炭浓度的升高，生根率愈高、生根数愈多且根愈长，苗长势愈好；当活性炭为0.05%时，生根率为58% -75%，每株生根数1-3条，根长l-3cm，苗生长较慢；当活性炭提高至0.2 %时，生根率提高20 %左右，每株生根数达4条以上，根长4-6cm，苗生长快；IBA对奥尼尔生根也具有浓度效应，高浓度 IBA更有利于生根，活性炭与IBA两者之间存在协同效应，两者浓度均高时，生根率及苗长势都愈好。在0.2%活性炭、0.6mg/L和0.8mg/L IBA的有效生根率均达到100%，但是后者起始生根的时间和根长均比前者早和长，后者7天左右可见莖基部有根形成，45天左右长出4-6条根,根长达6cm左右,苗高9cm以上，叶色碧绿叶片大，苗生长健壮，奥尼尔瓶内生根培养基中最佳的活性炭浓度和IBA浓度分别为0.2%和
0.8mg/L，有效生根率高达100%。本发明的特征在于,步骤f中:炼苗基质选择草炭:河沙=1:1 ;或者草炭:园土 = I: I ;或者草炭:石英砂=2 3:1 ;或者草炭:珍珠岩=I 2:1 ;或者纯水苔藓。本发明的特征在于，步骤f中:生根试管苗在五种不同炼苗基质中生长，其中纯水苔藓的效果最好，成活率高达100%，苗木的生长量达3cm以上，新增叶片6-8枚；效果其次的是2 3: I的草炭与石英砂组合，其成活率为84%，苗木的生长量较高；I: I的草炭与河沙基质的成活率仅为50%，但成活苗的质量却很高，表现为生长墩实、植株健壮、生长量与“草炭+石英砂”相当；草炭+园土基质与草炭+珍珠岩基质的效果居中。具体实施时:I材料与方法1.1 材料植物材料为智博生物科技公司种植园种植的南高丛蓝莓品种奥尼尔(O' Neal)。外植体材料选用当年生幼嫩枝。1.2 方法1.2.1初代培养获得无菌苗以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片。用洗衣粉水溶液洗净灰尘等污物后，自来水冲洗。转到超净工作台上，先后用75%酒精和0.1%升汞对外植体分别进行50s与IOmin的表面灭菌,接着用无菌水冲洗4次,2分钟/次,最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分。将枝条切成l_2cm长的单芽茎段，在无菌条件下将单芽茎段接种于改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉+1.0mg/L ZT的初代培养基中，初代培养基的pH =
5.2，进行光照培养，诱导侧芽萌发，培养30d后茎段腋芽伸长5cm以上，着生4_5片叶。光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗。1.2.2继代培养的优化
将初代培养获得的无菌苗切下，切成单芽茎段后转接于不同激素浓度的改良WPM培养基(各处理激素浓度组合见表l)+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉的增殖培养基(pH= 5.2)中进行光照培养，培养40d后观察芽的增殖倍数和生长状况。光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗。改良WPM培养基具体改良方法:以Ca (NO3) 2.4H20、KNO3 代替原 WPM 培养基中的 CaCl2、K2S04。1.2.2叶片再生体系的建立将继代培养2个月的无菌苗植株叶片切下，按垂直叶片主脉离叶尖端的1/3处切下叶片分成叶尖端和叶柄端，将叶尖端、叶柄端以及全叶这三部分均背面朝下分开放置接种于不同盐浓度(各处理盐浓度见表2)和不同ZT浓度(各处理ZT浓度见表3)的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)的培养瓶内，每瓶各10片左右，每个处理组重复12瓶。先进行20d的暗培养(温度25±2°C )，随后进行光照培养，光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗。30d后统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数，从而获得最佳的叶片再生体系。1.2.3试管苗生根培养将继代培养的无菌苗植株距顶端2.5 3.0cm左右切下，随机接种于含有不同盐浓度(各处理盐浓度组合见表4)、不同IBA浓度和不同活性碳浓度组合(各IBA浓度和活性碳浓度组合见表5)的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)中进行光照培养(光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗)，记录起始生根时间，60d后统计生根率和生根数并观察苗的生长状况，从而筛选出最适宜的的生根培养基。1.2.4 炼苗提前3d将瓶内生根试管苗打开瓶盖进行过渡，洗净根部培养基，随机移栽于不同炼苗基质(各基质组合见图1)，在保持湿度100%的育苗大棚中培养20d，然后在湿度80%、透光度70%的室外条件下过渡3d，再逐步通风换气，7d后完全揭去棚膜，2周后统计成活率。每套基质的栽植量不少于50株。各试验的重复次数不少于3次，统计成活率，以完成炼苗。2结果与分析2.1继代培养的优化将获得的无菌苗切成单芽茎段转接到不同激素浓度的培养基上进行继代培养基优化。表I的结果表明，ZT的增殖效果明显优于6-BA和TDZ。在ZT中，不定芽的发生率与培养基中的ZT有密切的关系。当ZT质量浓度为0.5mg/L时，培养IOd左右在茎基部产生黄绿色的愈伤组织，节处出现丛生芽，28d后增殖率达到5.02倍，且主要为主枝芽，丛生芽粗壮，生长势头好，呈鲜嫩状。当ZT质量浓度升高到lmg/L时，开始生长和分化的时间与0.5mg/L时相差不大，其增殖率稍有所增加。当ZT质量浓度等于和高于2mg/L时，再生苗开始生长和分化现象提前，多数分化出来的新梢枝上出现2次枝，增殖率达到10倍左右，由于侧枝芽多使苗长势较弱易出现玻璃化苗现象。WPM与其它激素组合效果均差于WPM+ZT组合。使用6-BA时，外植体不萌芽生长，生长停滞。使用TDZ时，IOd后在外植体基部形成少量愈伤，虽然能萌芽，但萌芽率低且生长缓慢。因此，从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本等方面进行综合考虑，继代培养基以WPM+0.5mg/L ZT为最佳。表I不同激素浓度对蓝莓芽增殖的影响
权利要求
1.一种适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于， a、选材:植物材料为智博生物科技公司种植园种植的南高丛蓝莓品种奥尼尔，外植体材料选用当年生幼嫩枝； b、初代培养获得无菌苗:以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片。用洗衣粉水溶液洗净灰尘等污物后，自来水冲洗。转到超净工作台上，先后用75%酒精和0.1%升汞对外植体分别进行50s与IOmin的表面灭菌，接着用无菌水冲洗4次，2分钟/次，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分，将灭菌后的嫩枝切段形成l-2cm长的单芽茎段，然后放置在初代培养基中培养，诱导侧芽萌发； C、继代培养的优化:待单芽茎段的茎段腋芽伸长后，将茎段腋芽切下转接于含有不同浓度激素组合的改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉的增殖培养基(pH = 5.2)中进行光照培养，光照培养条件为:温度25+2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗；改良WPM培养基的改良方法是:以Ca (NO3) 2.4H20、KNO3代替原WPM培养基中的CaCl2、K2SO4 ； d、叶片再生体系的建立:将继代培养2个月的无菌苗植株叶片切下，按垂直叶片主脉尚叶尖纟而的1/3处切下叶片分成叶尖纟而和叶柄将叶尖叶柄％5和全叶这二部分均背面朝下分开放置接种于不同盐浓度和不同ZT浓度的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)的培养瓶内，每瓶各10片左右，每个处理组重复12瓶。先进行20d的暗培养，暗培养的温度为25±2°C,随后进行光照培养,光照培养条件为:温度25±2°C,光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，30d后统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数，从而获得最佳的叶片再生体系； e、试管苗生根培养:将继代培养的无菌苗植株距顶端2.5 3.0cm左右切下，随机接种于含有不同盐浓度、不同IBA浓度和不同活性碳浓度组合的改良WPS培养基+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉(pH = 5.2)的培养瓶中进行光照培养，光照培养条件为:温度25±2°C，光强2500Lx，光周期16h光照/8h黑暗，记录起始生根时间，60d后统计生根率和生根数并观察苗的生长状况，从而筛选出 最适宜的生根培养基； f、炼苗:提前3d将瓶内生根试管苗打开瓶盖进行过渡，洗净根部培养基，随机移栽于不同炼苗基质，在保持湿度100%的育苗大棚中培养20d，然后在湿度80%、透光度70%的室外条件下过渡3d，再逐步通风换气，7d后完全揭去棚膜，2周后统计成活率，每种基质的栽植量不少于50株，各试验的重复次数不少于3次，统计成活率，以完成炼苗。
2.根据权利要求1所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，步骤b中初代培养基为改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉+1.0mg/L ZT，其pH = 5.2。
3.根据权利要求1所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，步骤c中，待单芽茎段的茎段腋芽伸长后，将茎段腋芽切下转接于含有不同浓度ZT、6-BA或TDZ的改良WPM培养基+20g/L蔗糖+8.8g/L日产琼脂粉的增殖培养基(pH = 5.2)中进行光照培养。
4.根据权利要求3所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，步骤c中，不定芽的发生率与培养基中的ZT浓度有密切的关系；当ZT质量浓度为0.5mg/L时，培养IOd左右在茎基部产生黄绿色的愈伤组织，节处出现丛生芽，28d后增殖率达到5.02倍，且主要为主枝芽，丛生芽粗壮，生长势头好，呈鲜嫩状；当ZT质量浓度升高到lmg/L时，开始生长和分化的时间与0.5mg/L时相差不大，其增殖率稍有所增加；当ZT质量浓度等于和高于2mg/L时，再生苗开始生长和分化现象提前，多数分化出来的新梢枝上出现2次枝，增殖率达到10倍左右，由于侧枝芽多使苗长势较弱易出现玻璃化苗现象；使用6-BA时，外植体不萌芽生长，生长停滞。使用TDZ时，IOd后在外植体基部形成少量愈伤，虽然能萌芽，但萌芽率低且生长缓慢；从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本等方面进行综合考虑，继代培养基以WPM+0.5mg/L ZT 为最佳。
5.根据权利要求1所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于， 在步骤d中，在不同盐浓度的培养瓶中统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数，高盐浓度不利于叶片的再生，其诱导再生苗率为0-2.7% ;将大量元素浓度减少一半，能明显促进叶片的再生，叶片诱导再生苗率提高至23.1-70.9% ;在叶片不同部位中，叶尖端的再生苗诱导率最低，叶柄端居中，全叶的诱导率最高。
6.根据权利要求1所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，在步骤d中，在不同浓度ZT或TDZ的培养瓶中统计叶片出芽率及每个叶片相应形成的苗数；TDZ不能诱导叶片形成再生苗，叶片培养IOd后在切口处形成愈伤组织，随着培养时间的延长，愈伤组织慢慢褐化，未见再生苗形成；ZT对叶片再生苗诱导效果明显优于TDZ，不定芽的发生率与培养基中的ZT有密切的关系，ZT对叶片再生苗诱导存在明显的浓度效应，叶尖端在0.5mg/LZT时诱导率为0%，随着ZT浓度的升高诱导率逐渐增加，在5mg/L ZT时的诱导率达到32.3%;叶柄端和全叶的诱导率均随ZT质量浓度的升高逐渐增加，在2.0mg/L ZT时诱导率均达到最高，叶柄端和全叶的再生苗诱导率分别为54.3%和71.4%,5mg/L ZT时的诱导率却均下降；不同部位叶片的再生苗诱导率存在明显差异，叶尖端的诱导率最低，叶柄端的居中，全叶的诱导率最高；低浓度ZT主要诱导形成单生苗，而高浓度ZT有利于簇生苗的形成；叶尖端叶片诱导的重生苗主要形成于切口处，叶柄端和全叶诱导的再生苗主要形成于叶柄一侧；选用全叶进行叶片再生苗诱导，其再生苗诱导的最佳ZT质量浓度为2.0mg/L。
7.根据权利要求1所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，在步骤e中，不同盐浓度对单个芽苗的生根诱导存在重要影响，高盐浓度不利于芽苗生根，开始生根时间长且生根率仅为30%;当大量元素减半时，约14d后开始生根和生根率为75%;当大量元素减少到原来的1/4时，开始生根 时间提前为7天左右且生根率高达100%，苗长势强；大量元素减少到原来的1/8时，虽然开始生根时间和生根率与大量元素减少到原来的1/4的相似，然而由于营养物质的缺乏，苗长势弱，适当降低盐浓度有利于生根且不影响苗的生长，奥尼尔试管苗瓶内生根的生根培养基的盐浓度选用大量元素减少到原来的1/4。
8.根据权利要求1所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，在步骤e中，活性炭对培养瓶内生根具有重要影响，当培养基中无活性炭时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后在其上生根，由于根茎之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势很差；培养基中添加活性炭后，茎基部很少或不长愈伤组织而直接从茎上生根，从而有利于苗的生长；活性炭对生根存在浓度效应，随着活性炭浓度的升高，生根率愈高、生根数愈多且根愈长，苗长势愈好；当活性炭为0.05%时，生根率为58% -75%，每株生根数1-3条，根长l-3cm，苗生长较慢；当活性炭提高至0.2 %时，生根率提高20 %左右，每株生根数达4条以上，根长4-6cm，苗生长快；IBA对奥尼尔生根也具有浓度效应，高浓度IBA更有利于生根，活性炭与IBA两者之间存在协同效应，两者浓度均高时，生根率及苗长势都愈好。在0.2%活性炭、0.6mg/L和0.8mg/L IBA的有效生根率均达到100%，但是后者起始生根的时间和根长均比前者早和长，后者7天左右可见茎基部有根形成，45天左右长出4-6条根，根长达6cm左右，苗高9cm以上，叶色碧绿叶片大，苗生长健壮，奥尼尔瓶内生根培养基中最佳的活性炭浓度和IBA浓度分别为0.2%和0.8mg/L，有效生根率高达100%。
9.根据权利要求1所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，步骤f中:炼苗基质选择草炭:河沙=1:1 ;或者草炭:园土 = 1:1 ;或者草炭:石英砂=2 3: I ；或者草炭:珍珠岩=I 2:1 ;或者纯水苔藓。
10.根据权利要求8所述的适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，其特征在于，步骤f中:生根试管苗在五种不同炼苗基质中生长，其中纯水苔藓的效果最好，成活率高达100%，苗木的生长量达3cm以上，新增叶片6-8枚；效果其次的是2 3:1的草炭与石英砂组合，其成活率为84%，苗木的生长量较高；1: I的草炭与河沙基质的成活率仅为50%，但成活苗的质量却很高，表现为生长墩实、植株健壮、生长量与“草炭+石英砂”相当；草炭+园土基质与草炭+珍珠岩基质的 效果居中。
全文摘要
一种适宜南高丛蓝莓高效快繁技术，采用以下步骤获得优良的培种苗a、选材；b、初代培养获得无菌苗；c、继代培养的优化；d、叶片再生体系的建立；e、试管苗生根培养。本发明以奥尼尔幼嫩茎段为试验材料，对增殖培养基、叶片再生体系、生根培养基、炼苗基质进行了优化。将最佳的增殖培养、叶片再生和生根培养相结合，加上有效的幼苗成活基质，可高效、快速、持续获得优良的奥尼尔组培种苗。
文档编号A01H4/00GK103222425SQ20131005503
公开日2013年7月31日 申请日期2013年2月21日 优先权日2013年2月21日
发明者邱义兰, 刘如石 申请人:邱义兰