一种微生物针式育种栽培一体化方法
一种微生物针式育种栽培一体化方法
【专利摘要】一种微生物针式育种栽培一体化方法的技术属于微生物的人工培养【技术领域】，所要解决的技术问题是：微生物母种（如保藏母种、扩繁母种和生产母种）培养过程所必需的接种及杀菌消毒的一体化问题。其技术方案要点是：创造针孔搅拌器来实现操作环节的整合例如粉碎注射器内培养的固体母种，使注射器能直接抽取与注入；组织可控电热器、柔性密封装置等进行高温变压排气消杀，并用环保物质如双氧水、黄蜡保洁；建立Ｖ液排＝Ｖ气排＝Ｖ气回的母种包装——注射器——目标包装——通气导管——母种包装的内部循环，降低母种与外部微生物发生接触的可能性。其主要用途是：用于一个人单独完成的操作过程，使微生物能够在与外部空气中微生物无接触的可控条件下，进行高效育种、接种和培养。
【专利说明】一种微生物针式育种栽培一体化方法
【技术领域】
[0001]微生物的人工培养方法。整合微生物培养的育种、栽培及其接种环节。
【背景技术】
[0002]液体微生物母种一般比固体微生物母种容易接种，在分散均匀和生长速度等方面有优势，液体微生物母种的栽培技术更受欢迎，但固体母种和液体母种都需要搅拌以及转移。同时当前常用的液体微生物母种育种技术存在问题，例如摇床制种所需时间长、容易造成菌龄不同而降低品质；发酵罐制种容易造成制种过程中微生物母种的严重退化；吹氧制种细节较多存在安全隐患等。更重要的是，由于液体微生物母种的育种和接种栽培之间存在其他环节，这些环节需要更多投资(例如酒精、无菌工作台），而且容易被杂菌感染(例如接种勺、移液器等消毒不彻底)。因为育种和接种栽培之间的环节没有充分整合，使得微生物母种与不可控物质(如杂菌）接触的机会较多，从而造成液体微生物母种的稀释以及消毒操作等的不易控制，在非实验室特别是农村环境中不易确保微生物培养所必需的卫生条件。上述情况还造成微生物人工培养至少要两人配合才能顺利进行等问题。但是这些问题可以通过育种和栽培的一体化得到解决，只要整合繁琐环节，相应地由这些环节产生的问题也就能得到解决。通过应用微生物针式育种和栽培一体化方法的针孔搅拌器和内循环装置等，能够优化操作、减少投资和节约时间。从而实现以较低成本的一体化方法及装置顶替当前相对复杂的方法及其硬件，例如省去当前液体微生物母种育种的高压灭菌设备、接种箱、接种勺或移液器等。可见现有技术存在育种与栽培环节缺少整合、不易为非专业人员所掌握等问题，对所需规模不大的微生物实验及食用菌生产等造成技术障碍。总之，现有的微生物人工培养技术在育种和栽培方面存在可以整合的环节，而正是这些环节不易操作，增加污染和成本，不利于提高人工培养效率，不利于增加经济效益。
【发明内容】
[0003]解决的技术问题是应用针孔搅拌器实现微生物育种和栽培的一体化，包括三个主要部分：一是准备针孔搅拌器；二是应用注射器或连续注射器优化微生物母种(如保藏母种、扩繁母种和生产母种）的制备或接种；三是建立密闭内循环完成一体化操作。为改进微生物的人工培养，使其更容易操作和掌握，本发明的关键是解决由微生物育种或栽培过程所必需的接种及其保洁问题。
[0004]本发明采用如下技术方案：准备针孔搅拌器如图I所示①电钻是根据搅拌对象所需选用的，必须自带固定装置如螺套及周边装置；②钻尾螺套是指电钻用来安装钻头的尾部及螺套，但不用钻头而用曲钢针工作；③曲钢针是指为达到搅拌要求而弯曲成一定弧度和一定长度的低碳钢针，弧度在90 - 180度之间能够通过针尖插入进行搅拌；④针尾是曲钢针的变形后的尾部，形变必须保证通过螺套固定到电钻在搅拌时曲钢针不松动，成多边形或圆弧形。准备针孔搅拌器必须按搅拌要求选择相应硬度、弧度和长度的曲钢针，必须把曲钢针固定在电钻上之后再进行消杀以达到卫生要求。[0005]应用注射器优化微生物母种的制备：把无菌注射器应用到培育微生物母种，进行微生物母种的注射器培养，配之以粗针、针孔搅拌器，使母种能直接注入到液体微生物母种培养器皿。①根据微生物母种的不同配置相应的培养基和条件，把注射器内母种和培养基的总体积控制在注射器容积的5% - 50%之间放平注射器，调节其推进器，使液面低于针管出口，保洁密封后连同注射器在所需温度、光照和磁场等条件下培养固体母种注射器内培育的母种成熟后，用针孔搅拌器搅拌注射器内母种直接通过无菌粗针针头注入到微生物母种培养器皿。如果注射器内培养的是液体微生物母种，那么直接用注射器注入到培养器皿。如果是试管或其他器皿培育的固体母种，那么也用针孔搅拌器搅拌粉碎以达到通过粗针针头由注射器无菌抽出培育或转移。与此同时，准备液体微生物母种培养器皿及其柔性密封装置，确保在外形、酸碱度、温度和压力等方面达到操作要求，并根据微生物母种的不同需要配置相应的培养基、环境条件、针头和导管等。①按照液体微生物母种培养器皿的开口大小以及液体微生物母种培养对温度、酸碱度等的要求，配好相应的柔性密封装置，确保在与培养基一起高温消毒时不产生其他物质危害液体微生物母种，并且塞紧培养器皿配合可控电热器进行高温变压排气消杀；②使用相应的导管把内径够大的粗针针头连接到连续注射器，保证液体微生物母种培养器皿内的成熟液体生产母种能够通过连续注射器直接输出；③从柔性密封装置上插入连续注射器的粗针针头，保证通过针头能够随时输出培养器皿内液体微生物母种，从而能确保做到不接触外部空气而直接取样或接种等。在抽取母种时，调节好注射器或连续注射器输入端的粗针针头，使液体微生物母种能够尽量全部输出。
[0006]建立密闭内循环进行一体化消杀及接种：在用无菌导管接好连续注射器和液体微生物母种培养器皿后，直接通过连续注射器输出端针头插穿微生物栽培包装接种。①在上述微生物母种培养器皿加入所需培养基等作高温变压排气灭菌时，使高温蒸汽通过导管从连续注射器及其针头排出，一起达到高温灭菌消毒目标，确保液体微生物母种从培养器皿到由针头插穿栽培包装而注入到培养基的通道畅通，不受杂菌污染。②在通过用连续注射器把液体微生物母种接种到培养基时，对针头和预插入处进行彻底消杀。同时用另一根通气导管两端配上针头连接好液体微生物母种培养器皿，使其另一端通过针头插穿微生物培养基的栽培包装进行通气，保证回流气体无污染。①在上述加入相应所需物质使用无明火方便控温的可控电热器进行高温变压排气灭菌时，调节好针头、导管和微生物母种培养器皿保证使部分高温蒸汽通过这根导管从针头排出，调节气通量一起做排气消毒，确保液体微生物母种注入到培养基包装所挤出气体的回流通道畅通，不受杂菌污染。②在用连续注射器把液体微生物母种接种到培养基时，对这根导管的针头和预插入处进行彻底消毒杀菌。最后注意按照不同微生物栽培所需要的最佳液体微生物母种或培养基的比例，调好连续注射器的每次注射量，形成内部循环：微生物母种培养器皿——连续注射器——栽培包装——通气导管——微生物母种培养器皿。此时，V液排=V气排=V气回，没有与外部空气产生交换，从而实现最大限度保证微生物母种不受空气中的杂菌污染。接种好一次后，要先拔出栽培包装上的连续注射器针头，头朝上放好，然后再拔出通气导管针头，准备下一次接种，要先插入通气导管针头到培养基包装，再插入连续注射器针头到培养基包装接种。如果接下来一段时间不用，必须依次清洁，连同导管保洁后放好冷藏以备下次使用。
[0007]这种微生物针式育种栽培一体化方法具备如下优点：所需器材仅需注射器、微生物母种培养器皿和相应的柔性密封装置、导管、针头以及连续注射器、可控电热器等简易、实惠仪器。本发明的有益效果与现有技术比较主要包括：使微生物母种从育种到栽培过程中与外部空气的直接接触次数减少到O次，并且使每次接种简化到仅需要2次插拔针头。同时，通过整合工艺而节约了相关环节上的辅料例如酒精和消杀熏剂等，减少了操作难度、时间和人力物力。正确使用本方法，整个微生物人工培养过程可以由一个人单独完成。普通食用菌专业户只要买到培育好的母种，就能在与外部空气中杂菌无接触的条件下高效育种、接种和培养。上述发明能优化微生物的人工培养特别是食用菌如冬虫夏草真菌的培养，只要微生物育种无污染，就能够保证扩繁和接种等无污染，有利于避免后续环节的问题特别是因为接种感染杂菌而浪费。总之，这种微生物育种栽培一体化方法能够提高微生物培养效率和质量，更好地降本增效。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]【专利附图】
【附图说明】如下：图I.针孔搅拌器①电钻是带固定装置如螺套及周边装置的手持式电钻；②钻尾螺套是指电钻用来安装钻头的尾部及螺套曲钢针是弧度、长度和粗细不等的一套低碳钢针；④针尾是曲钢针的变形后的尾部，通过螺套固定到电钻。图2.搅拌示意图①搅拌注射器是针孔搅拌器从注射器出口插入曲钢针，通过搅拌粉碎母种以便从粗针针头输出；②搅拌培养基是针孔搅拌器插入较长的曲钢针到培养器皿，通过搅拌培养基等以达到溶解度、均匀度或颗粒度等要求；③搅拌母种是针孔搅拌器插入母种密封包装如试管，通过搅拌运动使固体母种或液态母种达到粉碎、接种等要求。这些搅拌运动可以通过控制曲钢针例如插入的长度、方向等，达到调节圆弧形旋转的大小或位置等目的。图3. —体化装置图①针孔搅拌器如图I.所示，解决一体化所需的搅拌或粉碎等问题；②注射器是一般医用级注射器，解决一体化所需的育种、注入或抽出等问题；③柔性密封是柔软的气密性封盖，方便针头钻孔、插入、抽出或旋转而不透气培养基器皿是耐高温高压的宽底容器，耐热急变直接接触电热器提供变压蒸汽；⑤可控电热器是有开关使用电能调温的发热仪器，功率大小与培养基器皿等相适应一般不少于200瓦；?连续注射器是连续进行抽出或注入的耐高温高压的注射器，通过手动、电动或气动完成工作；⑦通气导管是两端接有空心针头的耐高温高压的柔性管，长度、内径或位置等与气体回流相适应；⑧目标密封包装是接种或注入的目标包装 ，材质、气密性与插入针头相适应。
【具体实施方式】
[0009]【具体实施方式】以冬虫夏草真菌的培养为例说明，使用12V手持式电钻、玻璃注射器、耐高温玻璃抽滤瓶(具上嘴)、高弹性耐高温的强密封硅胶塞（即柔性密封装置)、耐氧化抑菌胶管、手动连续注射器、家用6升除锅盖电饭煲(即可控电热器)及相应的针头、培养基、无菌水和PP料培养盒等。本例需要准备长度15CM直径0. 1丽尾部卷成圆形的不锈钢曲钢针，加工磨尖并从近尖端三分之二处开使弧度逐渐弯曲成120度，需要培养冬虫夏草真菌固体母种、再扩繁成液体生产母种，接种到栽培包装。首先，培养冬虫夏草真菌固体母种，按照相应的育种条件使用无菌透明玻璃注射器通过粗针针头抽入母种及其培养基，进行育种。同时使用电饭煲顶替有明火的酒精灯进行快速高温变压消杀，电饭煲发热器起石棉网的作用，使玻璃注射器、耐高温玻璃抽滤瓶均匀受热。耐高温玻璃抽滤瓶经高温变压排气完成消杀后，依次封闭各条导管顶端，防止倒吸外部空气。培养基连续高温沸腾5分钟后，开始高温变压排气消杀，通过开关电饭煲电源完成加热一一高温高压——自动冲开胶管顶端排气——降温降压——封闭导管顶端——加热周期7次，每次3分钟，总时间约30分钟。当导管气通量接近于0时，才停止加热以防止倒吸外部空气，也防止内部气压过大而炸开柔性密封装置等。其次，扩繁成液体生产母种，需要12V手持式电钻接好上述曲钢针，从注射器出口插入搅拌粉碎固体母种，同时使培养基温度降到22摄氏度左右再培养冬虫夏草真菌液体生产母种。玻璃注射器育种的冬虫夏草真菌母种经粉碎后有推进器挤压，能从空心针头直接注入到玻璃抽滤瓶(即培养基器皿)培养液体生产母种。注意把上述培养基玻璃抽滤瓶正立，才能使用上述注射器直接插穿密封硅胶塞注入母种进行扩繁。要用同一个注射器吸入无菌水从第一次插入的通道注入，以充分排出注射器内的母种并调节培养基达到相应的要求，确保总体积小于培养器皿有效容积的50%。注意成熟液体生产母种的稀释，也需要使用上述玻璃注射器插穿密封硅胶塞注入无菌水或无菌营养液。最后，接种到栽培包装也需要使用上述针孔搅拌器、注射器处理生产母种或培养基，然后把玻璃抽滤瓶放倒横卧，从上支管连接连续注射器输出液体生产母种；也可以保持正立而从硅胶塞插入粗针针头再通过连续注射器输出。本例使用双氧水对针头和预插入处进行彻底消毒杀菌，所有保洁用黄蜡（医用蜂蜡）封口，针头要戴好针套，在使用时加热黄蜡使熔化挤出。在每次使用针头时都要使针尖朝上，先挤出少许液体以冲去针尖上可能附着的杂菌，再迅速插入完成育种栽培一体化操作。本例实践操作中是把通气导管与连续注射器固定在一起的，接种时不需要单独插入或抽出通气导管针头从而只要一次插拔就能完成一次接种。[0010]这种微生物针式育种栽培一体化方法不受上述实施说明的限制，其他任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种微生物针式育种栽培一体化方法，在微生物培养过程中，使用注射器、培养器皿和相应的柔性密封装置、导管、针头以及针孔搅拌器整合操作，其特征是：直接用消毒针头插穿柔性密封装置，形成内部循环，使微生物母种或培养基等不与外部微生物发生接触，实现一体化的杀菌消毒、输入或输出操作。
2.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是：以针头直接注入或抽出为目的，因此使用注射器培育微生物母种例如固体母种，并配之以大内径粗针针头及针孔搅拌器来处理。
3.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是根据V液排=V气排=V气回，使用不少于I根的通气导管通过针头连通母种培养器皿和目标包装的内部气体，形成内部循环，同时把通气 导管针头与连续注射器针头固定在一起方便操作。
4.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是按一体化杀菌消毒要求，使用通气导管连接培养器皿，在与培养器皿和相应的柔性密封装置、导管、针头以及连续注射器一起高温消毒时，调节各条导管的气通量进行高温变压排气消杀。
5.所谓气通量定义为在一个标准大气压下测得的单位时间通过截面的气体总量。
6.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是按一体化杀菌消毒要求，使用可控电热器进行高温变压排气灭菌，方法是调节可控电热器的温度使沸腾所产生的气压急剧变化一段时间，高低压交替周期不少于2个以达到内部循环的消杀目标。
7.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是按一体化杀菌消毒要求，同时调节可控电热器的温度和各条导管的气通量，进行高温变压排气灭菌，然后停止加热，在各导管气通量接近于O前封闭顶端，气通量小于3ml/s。
8.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是通过针孔搅拌器来整合操作达到均匀度、颗粒度等要求，针孔搅拌器由电钻提供动力，通过钻尾螺套固定变形的曲钢针针尾传递动力使曲钢针做圆弧形运动。
9.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是通过针孔搅拌器来整合操作达到技术要求，针孔搅拌器所用曲钢针是与要求相适应的一套直径、弧度、长度和硬度有别的低碳钢针，通过针尖插入目标并且调节搅拌效果，直径在0. 01毫米到3毫米之间，弧度在90度到180度之间，长度在I厘米到100厘米之间，硬度由含碳率表示在0. 0218%到0. 25%之间。
【文档编号】A01G1/04GK103688743SQ201310186723
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年5月18日 优先权日:2013年5月18日
【发明者】罗青 申请人:罗青
【专利摘要】一种微生物针式育种栽培一体化方法的技术属于微生物的人工培养【技术领域】，所要解决的技术问题是：微生物母种（如保藏母种、扩繁母种和生产母种）培养过程所必需的接种及杀菌消毒的一体化问题。其技术方案要点是：创造针孔搅拌器来实现操作环节的整合例如粉碎注射器内培养的固体母种，使注射器能直接抽取与注入；组织可控电热器、柔性密封装置等进行高温变压排气消杀，并用环保物质如双氧水、黄蜡保洁；建立Ｖ液排＝Ｖ气排＝Ｖ气回的母种包装——注射器——目标包装——通气导管——母种包装的内部循环，降低母种与外部微生物发生接触的可能性。其主要用途是：用于一个人单独完成的操作过程，使微生物能够在与外部空气中微生物无接触的可控条件下，进行高效育种、接种和培养。
【专利说明】一种微生物针式育种栽培一体化方法
【技术领域】
[0001]微生物的人工培养方法。整合微生物培养的育种、栽培及其接种环节。
【背景技术】
[0002]液体微生物母种一般比固体微生物母种容易接种，在分散均匀和生长速度等方面有优势，液体微生物母种的栽培技术更受欢迎，但固体母种和液体母种都需要搅拌以及转移。同时当前常用的液体微生物母种育种技术存在问题，例如摇床制种所需时间长、容易造成菌龄不同而降低品质；发酵罐制种容易造成制种过程中微生物母种的严重退化；吹氧制种细节较多存在安全隐患等。更重要的是，由于液体微生物母种的育种和接种栽培之间存在其他环节，这些环节需要更多投资(例如酒精、无菌工作台），而且容易被杂菌感染(例如接种勺、移液器等消毒不彻底)。因为育种和接种栽培之间的环节没有充分整合，使得微生物母种与不可控物质(如杂菌）接触的机会较多，从而造成液体微生物母种的稀释以及消毒操作等的不易控制，在非实验室特别是农村环境中不易确保微生物培养所必需的卫生条件。上述情况还造成微生物人工培养至少要两人配合才能顺利进行等问题。但是这些问题可以通过育种和栽培的一体化得到解决，只要整合繁琐环节，相应地由这些环节产生的问题也就能得到解决。通过应用微生物针式育种和栽培一体化方法的针孔搅拌器和内循环装置等，能够优化操作、减少投资和节约时间。从而实现以较低成本的一体化方法及装置顶替当前相对复杂的方法及其硬件，例如省去当前液体微生物母种育种的高压灭菌设备、接种箱、接种勺或移液器等。可见现有技术存在育种与栽培环节缺少整合、不易为非专业人员所掌握等问题，对所需规模不大的微生物实验及食用菌生产等造成技术障碍。总之，现有的微生物人工培养技术在育种和栽培方面存在可以整合的环节，而正是这些环节不易操作，增加污染和成本，不利于提高人工培养效率，不利于增加经济效益。
【发明内容】
[0003]解决的技术问题是应用针孔搅拌器实现微生物育种和栽培的一体化，包括三个主要部分：一是准备针孔搅拌器；二是应用注射器或连续注射器优化微生物母种(如保藏母种、扩繁母种和生产母种）的制备或接种；三是建立密闭内循环完成一体化操作。为改进微生物的人工培养，使其更容易操作和掌握，本发明的关键是解决由微生物育种或栽培过程所必需的接种及其保洁问题。
[0004]本发明采用如下技术方案：准备针孔搅拌器如图I所示①电钻是根据搅拌对象所需选用的，必须自带固定装置如螺套及周边装置；②钻尾螺套是指电钻用来安装钻头的尾部及螺套，但不用钻头而用曲钢针工作；③曲钢针是指为达到搅拌要求而弯曲成一定弧度和一定长度的低碳钢针，弧度在90 - 180度之间能够通过针尖插入进行搅拌；④针尾是曲钢针的变形后的尾部，形变必须保证通过螺套固定到电钻在搅拌时曲钢针不松动，成多边形或圆弧形。准备针孔搅拌器必须按搅拌要求选择相应硬度、弧度和长度的曲钢针，必须把曲钢针固定在电钻上之后再进行消杀以达到卫生要求。[0005]应用注射器优化微生物母种的制备：把无菌注射器应用到培育微生物母种，进行微生物母种的注射器培养，配之以粗针、针孔搅拌器，使母种能直接注入到液体微生物母种培养器皿。①根据微生物母种的不同配置相应的培养基和条件，把注射器内母种和培养基的总体积控制在注射器容积的5% - 50%之间放平注射器，调节其推进器，使液面低于针管出口，保洁密封后连同注射器在所需温度、光照和磁场等条件下培养固体母种注射器内培育的母种成熟后，用针孔搅拌器搅拌注射器内母种直接通过无菌粗针针头注入到微生物母种培养器皿。如果注射器内培养的是液体微生物母种，那么直接用注射器注入到培养器皿。如果是试管或其他器皿培育的固体母种，那么也用针孔搅拌器搅拌粉碎以达到通过粗针针头由注射器无菌抽出培育或转移。与此同时，准备液体微生物母种培养器皿及其柔性密封装置，确保在外形、酸碱度、温度和压力等方面达到操作要求，并根据微生物母种的不同需要配置相应的培养基、环境条件、针头和导管等。①按照液体微生物母种培养器皿的开口大小以及液体微生物母种培养对温度、酸碱度等的要求，配好相应的柔性密封装置，确保在与培养基一起高温消毒时不产生其他物质危害液体微生物母种，并且塞紧培养器皿配合可控电热器进行高温变压排气消杀；②使用相应的导管把内径够大的粗针针头连接到连续注射器，保证液体微生物母种培养器皿内的成熟液体生产母种能够通过连续注射器直接输出；③从柔性密封装置上插入连续注射器的粗针针头，保证通过针头能够随时输出培养器皿内液体微生物母种，从而能确保做到不接触外部空气而直接取样或接种等。在抽取母种时，调节好注射器或连续注射器输入端的粗针针头，使液体微生物母种能够尽量全部输出。
[0006]建立密闭内循环进行一体化消杀及接种：在用无菌导管接好连续注射器和液体微生物母种培养器皿后，直接通过连续注射器输出端针头插穿微生物栽培包装接种。①在上述微生物母种培养器皿加入所需培养基等作高温变压排气灭菌时，使高温蒸汽通过导管从连续注射器及其针头排出，一起达到高温灭菌消毒目标，确保液体微生物母种从培养器皿到由针头插穿栽培包装而注入到培养基的通道畅通，不受杂菌污染。②在通过用连续注射器把液体微生物母种接种到培养基时，对针头和预插入处进行彻底消杀。同时用另一根通气导管两端配上针头连接好液体微生物母种培养器皿，使其另一端通过针头插穿微生物培养基的栽培包装进行通气，保证回流气体无污染。①在上述加入相应所需物质使用无明火方便控温的可控电热器进行高温变压排气灭菌时，调节好针头、导管和微生物母种培养器皿保证使部分高温蒸汽通过这根导管从针头排出，调节气通量一起做排气消毒，确保液体微生物母种注入到培养基包装所挤出气体的回流通道畅通，不受杂菌污染。②在用连续注射器把液体微生物母种接种到培养基时，对这根导管的针头和预插入处进行彻底消毒杀菌。最后注意按照不同微生物栽培所需要的最佳液体微生物母种或培养基的比例，调好连续注射器的每次注射量，形成内部循环：微生物母种培养器皿——连续注射器——栽培包装——通气导管——微生物母种培养器皿。此时，V液排=V气排=V气回，没有与外部空气产生交换，从而实现最大限度保证微生物母种不受空气中的杂菌污染。接种好一次后，要先拔出栽培包装上的连续注射器针头，头朝上放好，然后再拔出通气导管针头，准备下一次接种，要先插入通气导管针头到培养基包装，再插入连续注射器针头到培养基包装接种。如果接下来一段时间不用，必须依次清洁，连同导管保洁后放好冷藏以备下次使用。
[0007]这种微生物针式育种栽培一体化方法具备如下优点：所需器材仅需注射器、微生物母种培养器皿和相应的柔性密封装置、导管、针头以及连续注射器、可控电热器等简易、实惠仪器。本发明的有益效果与现有技术比较主要包括：使微生物母种从育种到栽培过程中与外部空气的直接接触次数减少到O次，并且使每次接种简化到仅需要2次插拔针头。同时，通过整合工艺而节约了相关环节上的辅料例如酒精和消杀熏剂等，减少了操作难度、时间和人力物力。正确使用本方法，整个微生物人工培养过程可以由一个人单独完成。普通食用菌专业户只要买到培育好的母种，就能在与外部空气中杂菌无接触的条件下高效育种、接种和培养。上述发明能优化微生物的人工培养特别是食用菌如冬虫夏草真菌的培养，只要微生物育种无污染，就能够保证扩繁和接种等无污染，有利于避免后续环节的问题特别是因为接种感染杂菌而浪费。总之，这种微生物育种栽培一体化方法能够提高微生物培养效率和质量，更好地降本增效。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]【专利附图】
【附图说明】如下：图I.针孔搅拌器①电钻是带固定装置如螺套及周边装置的手持式电钻；②钻尾螺套是指电钻用来安装钻头的尾部及螺套曲钢针是弧度、长度和粗细不等的一套低碳钢针；④针尾是曲钢针的变形后的尾部，通过螺套固定到电钻。图2.搅拌示意图①搅拌注射器是针孔搅拌器从注射器出口插入曲钢针，通过搅拌粉碎母种以便从粗针针头输出；②搅拌培养基是针孔搅拌器插入较长的曲钢针到培养器皿，通过搅拌培养基等以达到溶解度、均匀度或颗粒度等要求；③搅拌母种是针孔搅拌器插入母种密封包装如试管，通过搅拌运动使固体母种或液态母种达到粉碎、接种等要求。这些搅拌运动可以通过控制曲钢针例如插入的长度、方向等，达到调节圆弧形旋转的大小或位置等目的。图3. —体化装置图①针孔搅拌器如图I.所示，解决一体化所需的搅拌或粉碎等问题；②注射器是一般医用级注射器，解决一体化所需的育种、注入或抽出等问题；③柔性密封是柔软的气密性封盖，方便针头钻孔、插入、抽出或旋转而不透气培养基器皿是耐高温高压的宽底容器，耐热急变直接接触电热器提供变压蒸汽；⑤可控电热器是有开关使用电能调温的发热仪器，功率大小与培养基器皿等相适应一般不少于200瓦；?连续注射器是连续进行抽出或注入的耐高温高压的注射器，通过手动、电动或气动完成工作；⑦通气导管是两端接有空心针头的耐高温高压的柔性管，长度、内径或位置等与气体回流相适应；⑧目标密封包装是接种或注入的目标包装 ，材质、气密性与插入针头相适应。
【具体实施方式】
[0009]【具体实施方式】以冬虫夏草真菌的培养为例说明，使用12V手持式电钻、玻璃注射器、耐高温玻璃抽滤瓶(具上嘴)、高弹性耐高温的强密封硅胶塞（即柔性密封装置)、耐氧化抑菌胶管、手动连续注射器、家用6升除锅盖电饭煲(即可控电热器)及相应的针头、培养基、无菌水和PP料培养盒等。本例需要准备长度15CM直径0. 1丽尾部卷成圆形的不锈钢曲钢针，加工磨尖并从近尖端三分之二处开使弧度逐渐弯曲成120度，需要培养冬虫夏草真菌固体母种、再扩繁成液体生产母种，接种到栽培包装。首先，培养冬虫夏草真菌固体母种，按照相应的育种条件使用无菌透明玻璃注射器通过粗针针头抽入母种及其培养基，进行育种。同时使用电饭煲顶替有明火的酒精灯进行快速高温变压消杀，电饭煲发热器起石棉网的作用，使玻璃注射器、耐高温玻璃抽滤瓶均匀受热。耐高温玻璃抽滤瓶经高温变压排气完成消杀后，依次封闭各条导管顶端，防止倒吸外部空气。培养基连续高温沸腾5分钟后，开始高温变压排气消杀，通过开关电饭煲电源完成加热一一高温高压——自动冲开胶管顶端排气——降温降压——封闭导管顶端——加热周期7次，每次3分钟，总时间约30分钟。当导管气通量接近于0时，才停止加热以防止倒吸外部空气，也防止内部气压过大而炸开柔性密封装置等。其次，扩繁成液体生产母种，需要12V手持式电钻接好上述曲钢针，从注射器出口插入搅拌粉碎固体母种，同时使培养基温度降到22摄氏度左右再培养冬虫夏草真菌液体生产母种。玻璃注射器育种的冬虫夏草真菌母种经粉碎后有推进器挤压，能从空心针头直接注入到玻璃抽滤瓶(即培养基器皿)培养液体生产母种。注意把上述培养基玻璃抽滤瓶正立，才能使用上述注射器直接插穿密封硅胶塞注入母种进行扩繁。要用同一个注射器吸入无菌水从第一次插入的通道注入，以充分排出注射器内的母种并调节培养基达到相应的要求，确保总体积小于培养器皿有效容积的50%。注意成熟液体生产母种的稀释，也需要使用上述玻璃注射器插穿密封硅胶塞注入无菌水或无菌营养液。最后，接种到栽培包装也需要使用上述针孔搅拌器、注射器处理生产母种或培养基，然后把玻璃抽滤瓶放倒横卧，从上支管连接连续注射器输出液体生产母种；也可以保持正立而从硅胶塞插入粗针针头再通过连续注射器输出。本例使用双氧水对针头和预插入处进行彻底消毒杀菌，所有保洁用黄蜡（医用蜂蜡）封口，针头要戴好针套，在使用时加热黄蜡使熔化挤出。在每次使用针头时都要使针尖朝上，先挤出少许液体以冲去针尖上可能附着的杂菌，再迅速插入完成育种栽培一体化操作。本例实践操作中是把通气导管与连续注射器固定在一起的，接种时不需要单独插入或抽出通气导管针头从而只要一次插拔就能完成一次接种。[0010]这种微生物针式育种栽培一体化方法不受上述实施说明的限制，其他任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种微生物针式育种栽培一体化方法，在微生物培养过程中，使用注射器、培养器皿和相应的柔性密封装置、导管、针头以及针孔搅拌器整合操作，其特征是：直接用消毒针头插穿柔性密封装置，形成内部循环，使微生物母种或培养基等不与外部微生物发生接触，实现一体化的杀菌消毒、输入或输出操作。
2.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是：以针头直接注入或抽出为目的，因此使用注射器培育微生物母种例如固体母种，并配之以大内径粗针针头及针孔搅拌器来处理。
3.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是根据V液排=V气排=V气回，使用不少于I根的通气导管通过针头连通母种培养器皿和目标包装的内部气体，形成内部循环，同时把通气 导管针头与连续注射器针头固定在一起方便操作。
4.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是按一体化杀菌消毒要求，使用通气导管连接培养器皿，在与培养器皿和相应的柔性密封装置、导管、针头以及连续注射器一起高温消毒时，调节各条导管的气通量进行高温变压排气消杀。
5.所谓气通量定义为在一个标准大气压下测得的单位时间通过截面的气体总量。
6.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是按一体化杀菌消毒要求，使用可控电热器进行高温变压排气灭菌，方法是调节可控电热器的温度使沸腾所产生的气压急剧变化一段时间，高低压交替周期不少于2个以达到内部循环的消杀目标。
7.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是按一体化杀菌消毒要求，同时调节可控电热器的温度和各条导管的气通量，进行高温变压排气灭菌，然后停止加热，在各导管气通量接近于O前封闭顶端，气通量小于3ml/s。
8.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是通过针孔搅拌器来整合操作达到均匀度、颗粒度等要求，针孔搅拌器由电钻提供动力，通过钻尾螺套固定变形的曲钢针针尾传递动力使曲钢针做圆弧形运动。
9.根据权利要求1所述微生物针式育种栽培一体化方法，其特征是通过针孔搅拌器来整合操作达到技术要求，针孔搅拌器所用曲钢针是与要求相适应的一套直径、弧度、长度和硬度有别的低碳钢针，通过针尖插入目标并且调节搅拌效果，直径在0. 01毫米到3毫米之间，弧度在90度到180度之间，长度在I厘米到100厘米之间，硬度由含碳率表示在0. 0218%到0. 25%之间。
【文档编号】A01G1/04GK103688743SQ201310186723
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年5月18日 优先权日:2013年5月18日
【发明者】罗青 申请人:罗青
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