一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法
【专利摘要】本发明属于生物【技术领域】，具体涉及到一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法。具体包括：将各个阶段的激素浓度调整为最适浓度，然后将铁皮石斛种子在种子培养基中培养形成原球茎并进一步形成小芽，接着把铁皮石斛小芽转接于继代培养基中培养成具有2～3片真叶并带有1～2条幼根的小苗，再小苗转移到一步成苗培养基中培养成具有2～3条根、4片叶片、株高≥2.5cm、茎粗≥0.2cm的商品组培苗，最后将商品组培苗移栽至大棚内苗床上的基质中并培养至可采收。通过实施本发明，种子萌发时间短及萌发率高，芽苗生产快、污染低、变异少，商品组培苗粗壮、叶面展开、根系发达；从而实现铁皮石斛种苗快速无毒繁育的目的。
【专利说明】 一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及到一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛，为兰科第二大属草本植物。野生的铁皮石斛常附生于有苔藓植物的石灰岩石上或树上，并靠吸收附主的水分和养分来生长。
[0003]铁皮石斛具有独特的药用价值，现代医学研究表明:铁皮石斛的有效成分分为石斛多糖、石斛碱等，能显著有效提高人体的免疫功能。铁皮石斛是我国最珍贵的中药材之一，其应用历史悠久，在《神农本草经》中列为上品。铁皮石斛与天山雪莲、三两重人参，一百二十年首乌、花甲之茯苓、苁蓉、深山灵芝、海底珍珠、冬虫夏草等九种名贵且罕见的中药齐名，被尊列为“中华九大仙草”之首，素有“药中黄金”之美称。
[0004]野生的铁皮石斛一般生长在100?3000米高度的海拔之间，大多是长在亚热带、湿度较大且附生有苔藓的环境。铁皮石斛对生长环境要求苛刻，自然状态下生长缓慢，繁殖率低，加之长期无节制的采挖，野生的铁皮石斛资源已濒临绝种，已被国家列为重点保护的野生药材品种。因此，通过人工栽培铁皮石斛，对保护野生资源、生态环境、保证药用资源的可持续利用都有重大意义。
[0005]从20世纪70年代以来，我国就对铁皮石斛的组织培养育苗和人工栽培研究做了大量的工作，目前已取得初步成效。
[0006]在传统组培【技术领域】中，通常采用的是脱毒组培技术，该技术的实施步骤为:种子—消毒一初代培养一壮苗培养一生根培养接种一培养一商品组培种苗。其工作原理为细胞全能性。
[0007]传统组培技术普遍存在组培周期长、含大量病毒、变异率高、种苗生长细长等缺陷。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就是克服现有技术的不足而提供全新的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法。具体包括:将各个阶段的激素浓度调整为最适浓度，然后将铁皮石斛种子在种子培养基中培养形成原球茎并进一步形成小芽，接着把铁皮石斛小芽转接于继代培养基中培养成具有2?3片真叶并带有I?2条幼根的小苗，再小苗转移到一步成苗培养基中培养成具有2?3条根、4片叶片、株高彡2.5cm、茎粗彡0.2cm的商品组培苗，最后将商品组培苗移栽至大棚内苗床上的基质中并培养至可采收。通过实施本发明，种子萌发时间短及萌发率高，芽苗生产快、污染低、变异少，商品组培苗粗壮、叶面展开、根系发达；从而实现铁皮石斛种苗快速无毒繁育的目的。
[0009]本发明是通过以下技术方案来实现的:
[0010]1、一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，技术方案中该方法包括以下步骤:
[0011](I)将铁皮石斛蒴果顶部用刀片切割一小部分，用清水清洗一遍表面，放置于组培瓶中，然后在无菌操作台中用酒精浸泡30s，接着用氯化汞水溶液浸泡lOmin，再用无菌水反复漂洗3?5次，即可完成消毒步骤；
[0012](2)将步骤⑴得到铁皮石斛种子在无菌环境中将其放置于无菌的铝片上，用手术刀切开，将其播种于种子培养基中，在25±3°C、湿度< 60 %、光照强度1000Lux-1500Lux、光照时间为8h/d的培养室中培养，培养2个月后种子萌发形成原球茎并进一步形成小芽；其中，上述的种子培养基组成为:+6_卡基嘌呤0.2mg/L?0.25mg/L+萘乙酸 0.05mg/L ?0.lmg/L+ 白糖 20g/L+ 土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ；
[0013](3)将步骤⑵得到的铁皮石斛小芽转接于继代培养基中，在25±3°C、湿度彡60%、光照强度3000Lux-3500Lux、光照时间为llh/d的培养室中培养，3个月后小芽变成具有2?3片真叶并带有I?2条幼根的小苗；其中，上述中继代培养基组成为:N6+6-卡基嘌呤 2mg/L ?2.5mg/L+ 萘乙酸 0.5mg/L ?lmg/L+ 白糖 20g/L+土豆 200g/L+ 琼脂 5.1g/L ；
[0014](4)将步骤(3)中得到的小苗转移到一步成苗培养基中，在25±3°C、湿度彡60%、光照强度3000LuX-3500LuX、光照时间为12h/d的培养室中培养，4个月后小苗变成具有2?3条根、4片叶片、株高彡2.5cm、茎粗彡0.2cm的商品组培苗；其中，上述中一步成苗培养基组成为:改良的N6+6-卡基嘌呤0.5mg/L?lmg/L+萘乙酸lmg/L?1.5mg/L+白糖20g/L+ 土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ；
[0015](5)将步骤(4)得到的生根苗从组培瓶内取出用清水清洗取出培养基后，用高锰酸钾泡根5min后，摊开晾干至根部发白，然后移栽至布置在大棚内苗床上的栽培基质中，培养20?24个月后即可采收。
[0016]2、所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，技术方案中所述的酒精体积浓度为75%。
[0017]3、所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，技术方案中所述的氯化钙水溶液浓度为0.1 %。
[0018]4、所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，技术方案中所述的高锰酸钾浓度为0.3%。
[0019]5、所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，技术方案中所述苗床基质组成为:松树皮+花生壳按体积3:1比例进行混合；其中，松树皮直径为I?1.5cm,花生壳直径为0.8?1cm。
[0020]本发明既有如下优点:
[0021]1、本发明所提出各个阶段的激素浓度调整为最适浓度，培养基的制备方法科学合理。
[0022]2、通过实施本发明，种子萌发时间短及萌发率高。
[0023]3、通过实施本发明，芽苗生产快、污染低、变异少。
[0024]4、通过实施本发明，商品组培苗粗壮、叶面展开、根系发达。
[0025]5、通过实施本发明，有效的克服传统组培技术中普遍存在组培周期长、含大量病毒、变异率高、种苗生长细长等缺陷，并实现铁皮石斛种苗快速无毒繁育的目的。
[0026]6、通过实施本发明，更有利于铁皮石斛工厂化、规模化、集约化地繁殖生产。
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例对本发明的方法进一步说明。
[0028]一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，【具体实施方式】如下:
[0029]1、将铁皮石斛蒴果顶部用刀片切割一小部分，用清水清洗一遍表面，放置于组培瓶中，然后在无菌操作台中用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，接着用浓度为0.1%的氯化汞水溶液浸泡lOmin，再用无菌水反复漂洗3?5次，即可完成消毒步骤。
[0030]2、配制种子培养基:
[0031](I)种子培养基组成为:+6_卡基嘌呤0.2mg/L?0.25mg/L+萘乙酸0.05mg/L?
0.lmg/L+ 白糖 20g/L+ 土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ；
[0032](2)将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，并按常规方法进行灭菌，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。
[0033]3、将铁皮石斛种子在无菌环境中将其放置于无菌的铝片上，用手术刀切开，将其播种于种子培养基中，在25±3°C、湿度彡60%、光照强度1000Lux-1500Lux、光照时间为8h/d的培养室中培养，培养2个月后种子萌发形成原球茎并进一步形成小芽。
[0034]4、配制继代培养基:
[0035](I)继代培养基组成为:N6+6_卡基嘌呤2mg/L?2.5mg/L+萘乙酸0.5mg/L?lmg/L+ 白糖 20g/L+ 土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ；
[0036](2)将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，并按常规方法进行灭菌，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。
[0037]5、将铁皮石斛小芽转接于继代培养基中，在25±3°C、湿度彡60 %、光照强度3000Lux-3500Lux、光照时间为I lh/d的培养室中培养，3个月后小芽变成具有2?3片真叶并带有I?2条幼根的小苗。
[0038]6、配制一步成苗培养基:
[0039](I) 一步成苗培养基组成为:改良的N6+6-卡基嘌呤0.5mg/L?lmg/L+萘乙酸lmg/L ?1.5mg/L+ 白糖 20g/L+ 土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ；
[0040](2)将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，并按常规方法进行灭菌，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用。
[0041]7、将小苗转移到一步成苗培养基中，在25±3°C、湿度彡60%、光照强度3000Lux-3500Lux、光照时间为12h/d的培养室中培养，4个月后小苗变成具有2?3条根、4片叶片、株高彡2.5cm、茎粗彡0.2cm的商品组培苗。
[0042]8、配制栽培基质:
[0043](I)基质组成为:松树皮+花生壳按体积3: I比例进行混合；其中，松树皮直径为I?1.5cm,花生壳直径为0.8?Icm ；
[0044](2)将上述基质按比例混合均匀后，再拌入适量的水分，使混合料的湿度达到50?60 %，接着将混合料进行发酵。
[0045]9、将商品组培苗从组培瓶内取出用清水清洗取出培养基后，用浓度为0.3%的高锰酸钾泡根5min后，摊开晾干至根部发白，然后移栽至布置在大棚内苗床上的栽培基质中，培养20?24个月后即可采收。
【权利要求】
1.一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，其特征在于该方法包括以下步骤: (1)将铁皮石斛蒴果顶部用刀片切割一小部分，用清水清洗一遍表面，放置于组培瓶中，然后在无菌操作台中用酒精浸泡30s，接着用氯化汞水溶液浸泡lOmin，再用无菌水反复漂洗3?5次，即可完成消毒步骤； (2)将步骤(I)得到铁皮石斛种子在无菌环境中将其放置于无菌的铝片上，用手术刀切开，将其播种于种子培养基中，在25±3°C、湿度彡60%、光照强度1000Lux-1500Lux、光照时间为8h/d的培养室中培养，培养2个月后种子萌发形成原球茎并进一步形成小芽；其中，上述的种子培养基组成为:+6-卡基嘌呤0.2mg/L?0.25mg/L+萘乙酸0.05mg/L?0.lmg/L+ 白糖 20g/L+ 土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ； (3)将步骤⑵得到的铁皮石斛小芽转接于继代培养基中，在25±3°C、湿度彡60%、光照强度3000LuX-3500LuX、光照时间为llh/d的培养室中培养，3个月后小芽变成具有2?3片真叶并带有I?2条幼根的小苗；其中，上述中继代培养基组成为:N6+6-卡基嘌呤2mg/L ?2.5mg/L+ 萘乙酸 0.5mg/L ?lmg/L+ 白糖 20g/L+ 土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ； (4)将步骤(3)中得到的小苗转移到一步成苗培养基中，在25±3°C、湿度彡60%、光照强度3000LuX-3500LuX、光照时间为12h/d的培养室中培养，4个月后小苗变成具有2?3条根、4片叶片、株高彡2.5cm、茎粗彡0.2cm的商品组培苗；其中，上述中一步成苗培养基组成为:改良的N6+6-卡基嘌呤0.5mg/L?lmg/L+萘乙酸lmg/L?1.5mg/L+白糖20g/L+土豆 200g/L+ 琼脂 5.lg/L ； (5)将步骤(4)得到的生根苗从组培瓶内取出用清水清洗取出培养基后，用高锰酸钾泡根5min后，摊开晾干至根部发白，然后移栽至大棚内苗床上的基质中，培养20?24个月后即可采收。
2.根据权利要求1所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的酒精体积浓度为75%。
3.根据权利要求1所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的氯化钙水溶液浓度为0.1 %。
4.根据权利要求1所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，其特征在于，步骤(5)所述的高锰酸钾浓度为0.3%。
5.根据权利要求1所述的一种高效快速繁殖铁皮石斛组培苗的方法，其特征在于，步骤(5)所述苗床基质组成为:松树皮+花生壳按体积3: I比例进行混合；其中，松树皮直径为I?1.5cm,花生壳直径为0.8?1cm。
【文档编号】A01H4/00GK104160955SQ201310185361
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2013年5月20日 优先权日:2013年5月20日
【发明者】潘俊宇, 潘素芬, 翟全琼, 张雄森, 黄云辉, 梁燊 申请人:广西俊宇原生本草生物科技有限公司