一种用精胺快速繁殖甘蔗组培苗的方法
【专利摘要】一种用精胺快速繁殖甘蔗组培苗的方法，将甘蔗幼叶切片作外植体，接种到MS+Spm.1.5mg·L-1-3.0mg·L-1的改良型MS固体培养基中，调pH 5.8-6.0，连续培养10d-25d诱导并获得甘蔗愈伤组织团块；再转移到新鲜的同一种培养基继续培养15d后，将所得愈伤组织分切成小块再转接到新鲜的同一种培养基。继续培养20d至30d，将再生苗转移到新鲜的同一种培养基培养20d，得到株高5-6cm、根苗齐全的试管苗。本发明从外植体培养启动到完整再生植株的建成，只用1种培养基，显著简化了甘蔗组培苗的生产程序，同时摆脱了2,4-D诱导愈伤组织的毒害作用，使用的精胺价格低廉，更利于推广。
【专利说明】-种用精胺快速繁殖甘薦组培苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属植物生物技术的组织培养【技术领域】，尤其是一种用精胺快速繁殖甘藏组 培苗的方法。 技术背景
[0002] "组培苗"亦称"试管苗"、"无菌苗"和"克隆（Clone)苗"，是根据细胞的全能性理 论，利用外植体，在无菌和适宜的培养基及光温条件下，快速繁育获得的根、苗齐全的完整 再生植株。在同一时间段里，组培苗的扩繁速度可W数十倍、甚至数百倍于植物的自然繁殖 速度，而且无病无毒（Virus)，群体整齐，最适合作物良种的大规模产业化种植。组培苗生产 技术是现代化农业的支撑技术之一，是"试管农业"的重要组成部分。甘藏良种组培苗的生 产与推广，近20年使我国的甘藏种植业发生了翻天覆地的变化。建立甘藏组培苗生产技术 的研究报道亦从未间断。但是，其卡喉魄的关键仍然是发生在外植体诱导愈伤组织和胚状 体2个环节。一直W来，既有必须使用2, 4-D，又无法摆脱2, 4-D毒性的负面危害【甘藏组 织培养研究综述[J]广西热作科技黄惠芳1998,（2) :33-37】;【甘藏组织培养研究进展[J] 安徽农业科学杨柳等2007,35(12) ;3490-3492】。李松和许鸿源等虽用LFS(灵发素）建立 了高效优质生产甘藏组培苗的技术体系【一种用灵发素进行甘藏组织培养快速繁殖的方法 中国专利号化201010216192. 1】，但是，LFS在国内没有生产厂家，进口价格十分昂贵，难W 推广应用。精胺（Spermine,，Spm.)是一种广泛存在于高等植物界，纯天然的植物生长调节 物质【多胺是植物生长发育的调节物[J]植物生理学通讯潘瑞识1985化)63-68】，而且价格 便宜，方便推广。人们对其促进植物生长、延缓衰老、增强抗逆能力等生理活性的研究，已经 有不少报导。但是，还未能检索到精胺用于甘藏组培苗快速繁殖的研究资料。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种用精胺快速繁殖甘藏组培苗的方法
[0004] 本发明W如下技术方案解决上述技术问题：
[0005] -种用精胺快速繁殖甘藏组培苗的方法，包括如下步骤：
[000引1. W常规方法获得的甘藏幼叶切片作外植体，常规消毒，接种到 MS+Spm. 1. 5mg ? L-1-3. Omg ?。的改良型MS固体培养基中，调抑5. 8-6. 0。在常规培养条 件下连续培养l0d-25d诱导并获得甘藏愈伤组织团块。
[0007] 2.将上述愈伤组织团块小也地转移到新鲜的MS+Spml. 5mg ? L-1-3. Omg ? L-1培养 基，在常规培养条件下继续培养15d，陆续有形态各异胚状体发生。
[0008] 3.将上述已经分化出胚状体的愈伤组织团块分切成黄豆大小的小块（其胚状体 已有转绿更好）转接到新鲜的MS+Spm. 1. 5mg '。-3. Omg ?。培养基。每瓶接种5个小块。 每批接种10瓶W上，在常规培养条件下继续培养20d和30d，在此过程中，原有胚状体陆续 萌发成苗的同时，愈伤组织小块也会继续长大，并有新的胚状体形成和萌发成苗。
[0009] 4.将株高达2cm左右的再生苗，统一选出转移到新鲜的 MS+Spm. 1. 5mg ? L-1-3. Omg ? L-1培养基。每瓶15株。常规培养20d，便得到株高5-6cm，根 (root)苗（shoot)齐全的试管苗。
[0010] 5.按照常规炼苗，出瓶，洗苗分株，移栽至装有育苗基质的育苗杯或育苗床中，常 规管理，成活率>90%。
[0011] 本发明用精胺快速繁殖甘藏组培苗的突出优点是：
[0012] (1)完全不同于传统的方法，从外植体培养启动到完整再生植株的建成，只用1种 培养基MS+Spm. 1. 5mg ? L-1-3. Omg ? L-1即可完成，无需传统技术那样另配"继代培养基"和 "生根培养基"。也无需在培养基中添加NAA(蔡己酸）、IBA(剛巧了酸）等专用生根促进剂。 显著简化了甘藏组培苗的生产程序。
[0013] (2)完全摆脱了传统方法中，既必须用2, 4-D诱导愈伤组织，又不能避免其毒害作 用的无奈局面。
[0014] (3)也不同于用LR5建立起来的快速繁殖甘藏组培苗的新方法，精胺的价格相比 LR5十分低廉，更容易推广应用。
【具体实施方式】
[0015] W下通过实施案例对本发明的技术方案作进一步说明。
[0016] 本发明所述用精胺诱导甘藏组培苗的方法包括W下步骤：
[0017] 1.愈伤组织的获得；依常规方法取得甘藏幼叶切片作外植体，常规消毒后接种于 含有Spm. 1. 5mg ? L-1-3. Omg ? L-1的改良型MS固体培养基中，每批试验不少于10瓶，每瓶5 个切片。在常规培养条件下培养l〇d-25d。随机取3瓶统计出愈率、快速称量鲜重，记3瓶 平均值（见表1)。
[0018] 表1.不同浓度Spm.诱导甘藏幼叶形成愈伤组织的实施案例
[0019]
【权利要求】
1. 一种用精胺快速繁殖甘蔗组培苗的方法，其特征是包括如下步骤： (1)以常规方法获得的甘蔗幼叶切片作外植体，常规消毒，接种到 MS+Spm. 1. 5mg ? d. Omg ? I71的改良型MS固体培养基中，调pH5. 8-6. 0 ;在常规培养条件 下连续培养l〇d-25d诱导并获得甘蔗愈伤组织团块； ⑵将上述愈伤组织团块小心地转移到新鲜的MS+Spm. 1. 5mg Omg吨4培养基，在 常规培养条件下继续培养15d，陆续有形态各异胚状体发生； ⑶将上述已经分化出胚状体的愈伤组织团块分切成黄豆大小的小块转接到新鲜的 MS+Spm. 1. 5mg ? d. Omg ? I71培养基；每瓶接种5个小块；每批接种10瓶以上，在常规培 养条件下继续培养20d和30d，在此过程中，原有胚状体陆续萌发成苗的同时，愈伤组织小 块也会继续长大，并有新的胚状体形成和萌发成苗； ⑷将株高达2cm左右的再生苗统一选出转移到新鲜的MS+Spm. 1. 5mg ? d. Omg ? I71培养基；每瓶15株；常规培养20d，便得到株高5-6cm，根（root)苗（shoot)齐全的试管苗； (5)按照常规炼苗，出瓶，洗苗分株，移栽至装有育苗基质的育苗杯或育苗床中，常规管 理，成活率> 90%。
2. 如权利要求1所述的用精胺快速繁殖甘蔗组培苗的方法，其特征是改良型MS固体培 养基以MS+Spm. 2. 5mg ? I71为最适合于精胺快速繁殖甘蔗组培苗的培养基。
【文档编号】A01H4/00GK104396753SQ201410681991
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】许鸿源, 周凤珏, 蓝桃菊, 龚银花, 梁琼月, 许皓翔 申请人:广西大学