一种由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的培养基及组培方法
【专利摘要】本发明涉及一种由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的培养基系列及组培方法。所述培养基系列包括萌发培养基A、增殖诱导培养基B、分化培养基C、壮苗培养基D或E、和生根培养基F，本发明组培方法，首先将种子在萌发培养基中培养，种子萌发形成原球茎后，在原球茎增殖诱导培养基中诱导产生愈伤组织，愈伤组织进一步形成类原球茎；类原球茎经过分化形成小苗；将小苗移至壮苗培养基中，小苗长成大苗后；大苗在生根培养基中经过培养成为至少有3-4条发达健壮根系，株高达到6-8cm的铁皮石斛成苗。本发明可以缩短铁皮石斛的培育时间，不仅操作简单，且不受时间地点的限制，类原球茎的不断分裂增殖可以保证周年生产，便于大规模工业化生产应用。
【专利说明】一种由铁皮石斛类原球莖快速繁殖成苗的培养基及组培方法
【技术领域】[0001]本发明属于植物生物【技术领域】，涉及一种药用植物种苗的繁殖方法，具体来说涉及一种铁皮石斛快速繁殖的组培方法。
【背景技术】
[0002]铁皮石斛又称黑节草，是一种珍稀的药用植物和名贵的室内观赏植物。属国家一级保护的贵重濒危药材，历代医学经典均奉其为“药中之上品”。明代李时珍的《本草纲目》中记载:石斛除痹下气、补内脏虚劳赢瘦，强阴益精。久服，厚肠胃，补内绝不足。来胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年。道教医学经典《道藏》中，铁皮石斛名列中华“九大仙草”之首。铁皮石斛的药用部分是新鲜或干燥茎，现代医学研究表明:铁皮石斛能显著提高机体免疫功能，抗衰老，抗疲劳，耐缺氧，具有辅助抑制肿瘤等功效。
[0003]铁皮石斛种子细如粉尘，一个蒴果内所含种子达100万粒之多。由于缺乏胚乳，种子需与真菌共生才能萌发，自然条件下萌发率非常低(不足5%)。铁皮石斛自然繁殖力极低，常规繁殖又较困难，且多年来对铁皮石斛的采集量远大于其生长量，野生铁皮石斛自然繁殖已濒临绝迹。为发展人工栽培满足市场需求，药用石斛中的一些珍贵品种已成为目前组织快繁研究的重点。
[0004]目前关于铁皮石斛的组织培养研究已经有相关报道，但是组织培养所需的成本过高和试管成苗周期长的问题是制约铁皮石斛产业化大生产的瓶颈。因此亟需一种能快速繁殖铁皮石斛的组织培养体系，为推广人工培植技术和大规模工厂化育苗奠定理论与实践基础。
【发明内容】
[0005]针对目前铁皮石斛的组织培养成本较高，从无菌撒种到获得成苗的过程较长的问题，本发明的目的在于设计一种能快速繁殖铁皮石斛且能够周年生产的组织培养体系，为工厂化育苗提供技术支撑。
[0006]本发明所述的一种由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的专用培养基系列，包括萌发培养基A、增殖诱导培养基B、分化培养基C、壮苗培养基D或E、和生根培养基F，各培养基各组分在IL培养基中的含量分别为:
[0007](I)培养基 A =NH4NO3:1600_2000mg、KNO3:1800_2300mg、MgSO4.7H20:330_380mg、KH2PO4: 150_180mg、CaCl2: 330_360mg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg、ZnSO4.7H20:8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20:0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素 0.08-0.15mg、甘氨酸 1.7-2.5mg、琼脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g。
[0008](2)培养基 B: (NH4)2S04:460-480mg、KNO3:2800_2850mg、MgSO4.7H20:175_185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA: 37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_节氨基嘌呤0.2-1.0mg、土豆80_150g、琼脂6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
[0009](3)培养基 C: (NH4)2S04:460-480mg、KNO3:2800_2850mg、MgSO4.7H20:175_185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA: 37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_节氨基嘌呤0.1-0.5mg、土豆80_150g、琼脂6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
[0010](4)培养基D:l-5g花宝二号、0.1-0.8g水解酪蛋白、萘乙酸0.1-0.5mg、6_苄氨基嘌呤 0.1-0.5mg、土豆 80-150g、琼脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g。
[0011](5)培养基 E: (NH4)2SO4:128-135mg、KNO3:1800_2500mg、MgSO4.7H20:250_300mg、NaH2PO4.H20: 130_160mg、CaCl2: 150-17Omg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3:2.3-3.0mg、MnSO4.4H20: 9.5-11.0mg、ZnSO4.7H20: 1.6-2.2mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、烟酸 0.9-1.6mg、盐酸吡哆醇 1.0-1.8mg、盐酸硫胺素9.6-10.5mg、萘乙酸0.3-0.8mg、6_节氨基嘌呤0.4-1.0mg、土豆80_150g、琼脂
6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
[0012](6)培养基 F:NH4N03:800-8 30mg、KN03:9 50-1000mg、MgSO4.7H20:175-190mg、KH2PO4: 60_85mg、CaCl2: 160_250mg、K1:0.6 5-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg、ZnSO4.7H20: 8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素0.08-0.15mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.8mg、吲哚乙酸0.2-1.0mg、活性炭0.5-1.5mg、香蕉 100-150g、琼脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g。
[0013]上述铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的专用培养基系列配方，该配方配制过程如下(IL培养基):
[0014](I)量取约500ml水放入热水锅中并加热；
[0015](2)称取 6.5-7.5g 琼脂粉；
[0016](3)待水温达到80°C时加入琼脂粉，搅拌均匀，加热至沸腾；
[0017](4)加入每种培养基所需要的药品；
[0018](5)配制培养基B、C、D、E、F时称取80_150g 土豆或香蕉，将其切成小块并用榨汁机榨汁；
[0019](6)将榨好的土豆汁或香蕉汁过滤至热水锅中；
[0020](7)配制培养基F时加入活性炭0.5-1.5mg ；
[0021](8)加入白砂糖 20_30g ;
[0022](9)待药品和白砂糖全部溶解后加水定容至IL并搅拌均匀；[0023](10)用 pH 试纸调 pH 值为 5.8-6.2 ；
[0024](11)分装，将配制好的培养基倒入组培瓶，倒入量视组培瓶容量大小而定，一般为容器的1/5左右；
[0025](12)高压蒸汽灭菌，121°C，1.5Mpa，20min ；
[0026](13)灭完菌的培养基放入接种室内静置，让其降温后凝固。
[0027]本发明还公开了使用上述培养基系列由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的组培方法，其步骤如下:
[0028](I)铁皮石斛种子的无菌萌发
[0029]将成熟的种子用自来水冲洗干净以后放入超净工作台中，在超净工作台的无菌条件下，将种子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸钠溶液中浸泡20min，再用无菌水漂洗3次，每次lmin。将处理好的种子用解剖刀在一端切开一小口，用镊子夹住种子的另一端将粉末状胚均匀播撒于培养基A中。将组培瓶置于温度为25°C，无光照的环境下进行培养并每天对其培养环境臭氧灭菌lh。大约30天左右，种子萌发，此时将组培瓶置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养，每天对其培养环境臭氧灭菌lh。45天左右，萌发的种子形成原球茎。
[0030]( 2 )铁皮石斛原球茎的增殖
[0031]在超净工作台上用勺子将种子萌发形成的原球茎均匀的转入到培养基B上。将组培瓶置于温度为25°C，光照 20001χ，每日光照12h的环境下进行培养并每天对其培养环境臭氧灭菌lh。可观察到组培瓶中的原球茎长出淡黄色愈伤组织，45天左右愈伤组织不断分裂增殖形成类原球茎(如图2所示)。
[0032](3)铁皮石斛类原球茎的分化
[0033]在超净工作台上用勺子将类原球茎挑出并均匀的转入到培养基C上。将组培瓶置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养并每天对其培养环境臭氧灭菌lh。60-90天左右可以观察到组培瓶中的类原球茎经过分化形成高约l_2cm的小苗(如图3所示)。
[0034](4)铁皮石斛小苗的壮苗
[0035]在超净工作台上用镊子小心的夹出类原球茎分化形成的小苗放置在事先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入培养基D中。将组培瓶置于温度为25°C,光照20001x,每日光照12h的环境下进行培养并每天对其培养环境臭氧灭菌lh。60-90天左右可以观察到组培瓶中的小苗经过壮苗形成整齐度基本一致高约3-4cm的大苗(如图4所示)。
[0036](5)铁皮石斛大苗的生根
[0037]在超净工作台上用镊子小心的夹出铁皮石斛大苗放置在事先消毒过的大培养皿上，将大苗一根一根的挑出并插入培养基F中。将组培瓶置于温度为25°C,光照20001x,每日光照12h的环境下进行培养并每天对其培养环境臭氧灭菌lh。60-90天左右可以观察到组培瓶中的大苗长势良好，整齐度相当，叶片大而厚，呈长椭圆形，叶色深绿，每棵苗至少有3-4条发达健壮的根系,株高达到6-8cm (如图5所示)。
[0038](6)铁皮石斛组培苗的炼苗与移栽
[0039]将组培瓶里的成苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在90%以上。[0040]为了在生产过程中保证获得更多的种苗同时为了能够实现周年生产，步骤(2)可以重复进行，类原球茎在继代培养过程中可以不断分裂增殖产生新的类原球茎。
[0041]步骤(4)中，为了在生产过程中获得更多的种苗，可以选择将步骤(3)中类原球茎分化形成的小苗插入培养基E中。该培养基可以显著促进小苗丛生芽的产生，从而获得更多的大苗。
[0042]上述的一种由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的组培方法，设计目标明确，提高了铁皮石斛克隆苗的增殖率和移栽成活率。本发明的方法不仅缩短了铁皮石斛的培养周期，而且操作简单，能不受时间地点的限制周年生产，对发展铁皮石斛产业具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0043]图1是组培流程图。
[0044]图2是铁皮石斛类原球茎照片。
[0045]图3是铁皮石斛苗(壮苗前)照片。
[0046]图4是铁皮石斛苗(壮苗后)照片。
[0047]图5是铁皮石斛成苗照片。
【具体实施方式】
[0048]以下通过实验例来进一步说明本发明。
[0049]实验一:
[0050]1、配制培养基么、8、(:、03、卩。
[0051]2、选取野生铁皮石斛成熟种子，将种子用自来水冲洗干净以后放入超净工作台中，在超净工作台的无菌条件下，将种子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸钠溶液中浸泡20min，再用无菌水漂洗3次，每次lmin。将处理好的种子用解剖刀切开一小口，用镊子将粉末状的种粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:330mg、KH2PO4: 150mg λ CaCl2:330mg、K1: 0.65mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA:37.0mg、FeS04.7Η20:27.5mg、肌醇 80mg、烟酸 0.2mg、盐酸吡哆醇 0.2mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、琼脂6.5g、白砂糖30g的培养基A中。置于温度为25O,无光照的环境下进行培养。一段时间后，种子萌发，此时将培养基置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。70天左右，萌发的种子形成原球茎。
[0052]3、将种子萌发形成的原球莖在无菌条件下转入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.0mg、ZnS04.7H20:1.3mg,Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、烟酸 0.2mg、盐酸吡卩多醇0.2mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、6_节氨基嘌呤0.6mg、土豆80g、琼脂6.5g、白砂糖30g的增殖培养基B中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。20天左右观察到组培瓶中的原球茎产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织不断分裂增殖， 70天左右原球茎成倍增殖为类原球茎。
[0053]4、将由原球茎愈伤组织形成的类原球茎在无菌条件下转入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4.4Η20:4.0mg、ZnS04.7Η20:1.3mg,Na2-EDTA:37.0mg、FeSO4.7Η20:27.5mg、烟酸 0.2mg、盐酸吡卩多醇0.2mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.lmg、6_节氨基嘌呤0.1mg>土豆80g、琼脂6.5g、白砂糖30g的分化培养基C中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。90天左右观察到组培瓶中的类原球茎经过分化形成高约l-2cm的小苗。
[0054]5、将分化的小苗在无菌条件下转入含2g花宝二号、0.2g水解酪蛋白、萘乙酸
0.lmg、6-节氨基嘌呤0.lmg、土豆80g、琼脂6.5g、白砂糖20g的壮苗培养基D中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。90天左右观察到组培瓶中的小苗经过壮苗形成整齐度基本一致高约3-4cm的大苗。
[0055]6、将经过壮苗形成的大苗在无菌条件下转入到含NH4NO3:800mg、KNO3:950mg> MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:60mg、CaCl2:160mg、K1:0.65mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA:37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、烟酸 0.2mg、盐酸批卩多醇0.2mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、吲哚乙酸0.2mg、活性炭0.5mg、香蕉100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的生根培养基F中。置于温度为25O,光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。90天左右观察到组培瓶中的大苗长势良好，整齐度相当，叶片大而厚，呈长椭圆形，叶色深绿，每棵苗至少有3-4条发达健壮的根系，株高达到 6_8cm。
[0056]7、将组培瓶里的成苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在90%以上。
[0057]实验二:
[0058]1、配制培养基么、8、(:、03、卩。
[0059]2、选取人工培育的铁皮石斛成熟种子，将种子用自来水冲洗干净以后放入超净工作台中，在超净工作台的无菌条件下，将种子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸钠溶液中浸泡20min，再用无菌水漂洗3次，每次lmin。将处理好的种子用解剖刀切开一小口，用镊子将粉末状的种粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:330mg、KH2PO4: 150mg λ CaCl2:330mg、K1: 0.65mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA:37.0mg、FeS04.7Η20:27.5mg、肌醇 80mg、烟酸 0.2mg、盐酸吡哆醇 0.2mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、琼脂6.5g、白砂糖30g的培养基A中。置于温度为25O,无光照的环境下进行培养。一段时间后，种子萌发，此时将培养基置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。70天左右，萌发的种子形成原球茎。
[0060]3、将种子萌发形成的原球莖在无菌条件下转入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.0mg、ZnS04.7H20:1.3mg,Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、烟酸 0.2mg、盐酸吡卩多醇0.2mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、6_节氨基嘌呤0.6mg、土豆80g、琼脂6.5g、白砂糖30g的增殖培养基B中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。20天左右观察到组培瓶中的原球茎产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织不断分裂增殖，70天左右原球茎成倍增殖为类原球茎。[0061]4、将由原球茎愈伤组织形成的类原球茎在无菌条件下转入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.65mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.0mg、ZnS04.7H20:1.3mg,Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、烟酸 0.2mg、盐酸吡卩多醇0.2mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.lmg、6_节氨基嘌呤0.lmg、土豆80g、琼脂6.5g、白砂糖30g的分化培养基C中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。90天左右观察到组培瓶中的类原球茎经过分化形成高约l-2cm的小苗。
[0062]5、将分化的小苗在无菌条件下转入含(NH4)2SO4:120mg、KNO3:1800mg、MgSO4.7H20: 23Omg、NaH2PO4.H20: 15Omg、CaCl2: 15Omg、K1: 0.65mg、H3BO3: 2.3mg、MnSO4.4H20:9.5mg、ZnSO4.7H20:1.6mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2 *6H20:0.015mg,Na2-EDTA: 37.0Omg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、烟酸 0.9mg、盐酸批口多醇1.0mg、盐酸硫胺素9.6mg、萘乙酸0.5mg、6_节氨基嘌呤0.lmg、土豆80g、琼脂6.5g、白砂糖30g的壮苗培养基E中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。90天左右观察到组培瓶中的小苗经过壮苗形成整齐度基本一致高约3-4cm的大苗，且每株大苗至少产生2-3个丛生芽分化出来的苗。
[0063]6、将经过壮苗形成的大苗在无菌条件下转入到含NH4NO3:800mg、KNO3:950mg> MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:60mg、CaCl2:160mg、K1:0.65mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、烟酸 0.2mg、盐酸批口多醇0.2mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、吲哚乙酸0.2mg、活性炭0.5mg、香蕉100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的生根培养基培养基E中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。900天左右观察到组培瓶中的大苗长势良好，整齐度相当，叶片大而厚，呈长椭圆形，叶色深绿，每棵苗至少有3-4条发达健壮的根系，株高达至Ij 6_8cm。
[0064]7、将组培瓶里的成苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在90%以上。
[0065]实验三:
[0066]1、配制培养基么、8、(:、03、卩。
[0067]2、选取人工培养的铁皮石斛成熟种子，将种子用自来水冲洗干净以后放入超净工作台中，在超净工作台的无菌条件下，将种子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸钠溶液中浸泡20min，再用无菌水漂洗3次，每次lmin。将处理好的种子用解剖刀切开一小口，用镊子将粉末状的种粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:370mg、KH2PO4: 180mg、CaCl2: 330mg> K1: 0.85mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 lOOmg、烟酸 0.5mg、盐酸吡哆醇 0.5mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.8mg、琼脂6.5g、白砂糖30g的培养基A中。置于温度为25°C,无光照的环境下进行培养。一段时间后，种子萌发，此时将培养基置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。50天左右，萌发的种子形成原球茎。
[0068]3、将种子萌发形成的原球莖在无菌条件下转入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、烟酸 0.5mg、盐酸吡卩多醇0.5mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_节氨基嘌呤0.6mg、土豆100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的增殖培养基B中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。15天左右观察到组培瓶中的原球茎产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织不断分裂增殖，60天左右原球茎成倍增殖为类原球茎。
[0069]4、将由原球茎愈伤组织形成的类原球茎在无菌条件下转入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、烟酸 0.5mg、盐酸吡卩多醇0.5mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_节氨基嘌呤0.2mg、土豆100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的分化培养基C中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。60天左右观察到组培瓶中的类原球茎经过分化形成高约l-2cm的小苗。
[0070]5、将分化的小苗在无菌条件下转入含3g花宝二号、0.4g水解酪蛋白、萘乙酸0.2mg、6-苄氨基嘌呤0.2mg、土豆100g、琼脂6.5g、白砂糖20g的壮苗培养基D中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。70天左右观察到组培瓶中的小苗经过壮苗形成整齐度基本一致高约3-4cm的大苗。
[0071]6、将经过壮苗形成的大苗在无菌条件下转入到含NH4N03:815mg、KNO3:950mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:85mg、CaCl2:165mg、K1: 0.85mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025-mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 100mg、烟酸 0.5mg、盐酸吡卩多醇0.5mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.4mg、吲哚乙酸0.4mg、活性炭0.5mg、香蕉100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的生根培养基F中。置于温度为25°C,光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。60天左右观察到组培瓶中的大苗长势良好，整齐度相当，叶片大而厚，呈长椭圆形，叶色深绿，每棵苗至少有3-4条发达健壮的根系，株高达到 6_8cm。`
[0072]7、将组培瓶里的成苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在90%以上。
[0073]实验四:
[0074]1、配制培养基八、8、(:、03、卩。
[0075]2、选取野生铁皮石斛成熟种子，将种子用自来水冲洗干净以后放入超净工作台中，在超净工作台的无菌条件下，将种子依次放到75%的酒精溶液中浸泡lmin，4%的次氯酸钠溶液中浸泡20min，再用无菌水漂洗3次，每次lmin。将处理好的种子用解剖刀切开一小口，用镊子将粉末状的种粒播撒于含 NH4NO3:1600mg、KNO3:1800mg,MgSO4.7H20:370mg、KH2PO4: 180mg、CaCl2: 330mg> K1: 0.85mg、H3BO3: 6.0mg、MnSO4.4 H2 0:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 100mg、烟酸 0.5mg、盐酸吡哆醇 0.5mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.8mg、琼脂6.5g、白砂糖30g的培养基A中。置于温度为25°C,无光照的环境下进行培养。一段时间后，种子萌发，此时将培养基置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。50天左右，萌发的种子形成原球茎。
[0076]3、将种子萌发形成的原球莖在无菌条件下转入含(NH4) 2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、烟酸 0.5mg、盐酸吡卩多醇0.5mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_节氨基嘌呤0.6mg、土豆100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的增殖培养基B中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。15天左右观察到组培瓶中的原球茎产生淡黄色愈伤组织，愈伤组织不断分裂增殖，60天左右原球茎成倍增殖为类原球茎。
[0077]4、将由原球茎愈伤组织形成的类原球茎在无菌条件下转入含(NH4)2S04:460mg、KNO3:2800mg、MgSO4.7H20:180mg、KH2PO4:400mg、CaCl2:125mg、K1: 0.80mg、H3BO3:1.6mg、MnSO4 *4H20:4.3mg、ZnS04.7H20:1.6mg,Na2-EDTA: 37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、烟酸 0.5mg、盐酸吡卩多醇0.5mg、盐酸硫胺素0.8mg、甘氨酸1.8mg、萘乙酸0.2mg、6_节氨基嘌呤0.2mg、土豆100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的分化培养基C中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。60天左右观察到组培瓶中的类原球茎经过分化形成高约l-2cm的小苗。
[0078]5、将分化的小苗在无菌条件下转入含(NH4)2SO4:130mg、KN03:2 5 00mg、MgSO4.7H20: 25Omg、NaH2PO4.H20: 15Omg、CaCl2: 15Omg、K1: 0.65mg、H3BO3: 2.8mg、MnSO4.4H20:9.5mg、ZnSO4.7H20:1.8mg、Na2MoO4.2H20:0.25mg、CuSO4.5H20:0.025mg、CoCl2.6H20:0.025mg、Na2-EDTA:37.3mg、FeSO4.7H20:27.8mg、肌醇 100mg、烟酸 1.0mg、盐酸批卩多醇1.0mg、盐酸硫胺素9.6mg、萘乙酸0.5mg、6_节氨基嘌呤0.5mg、土豆100g、琼脂
6.5g、白砂糖30g的壮苗培养基E中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。70天左右观`察到组培瓶中的小苗经过壮苗形成整齐度基本一致高约3-4cm的大苗，且每株大苗至少产生2-3个丛生芽分化出来的苗。
[0079]6、将经过壮苗形成的大苗在无菌条件下转入到含NH4NO3:800mg、KNO3:950mg> MgSO4.7H20:175mg、KH2PO4:60mg、CaCl2:160mg、K1:0.65mg、H3BO3:6.0mg、MnSO4.4H20:22.0mg、ZnSO4.7H20:8.5mg、Na2MoO4.2H20:0.18mg、CuSO4.5H20:0.015mg、CoCl2.6H20:0.015mg、Na2-EDTA: 37.0mg、FeSO4.7H20:27.5mg、肌醇 80mg、烟酸 0.2mg、盐酸批口多醇0.2mg、盐酸硫胺素0.08mg、甘氨酸1.7mg、萘乙酸0.2mg、吲哚乙酸0.2mg、活性炭
0.5mg、香蕉100g、琼脂6.5g、白砂糖30g的生根培养基培养基F中。置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养。70天左右观察到组培瓶中的大苗长势良好，整齐度相当，叶片大而厚，呈长椭圆形，叶色深绿，每棵苗至少有3-4条发达健壮的根系，株高达到6_8cm。
[0080]7、将组培瓶里的成苗在自然光下炼苗一周后取出瓶苗并洗净根部培养基，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在90%以上。
【权利要求】
1.一种由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的专用培养基系列，其特征在于该培养基系列包括萌发培养基A、增殖诱导培养基B、分化培养基C、壮苗培养基D或E、和生根培养基F，所述各培养基中组分以IL培养基计，含量分别为: a.培养基A =NH4NO3:1600_2000mg、KNO3:1800_2300mg、MgSO4.7H20:330_380mg、KH2PO4: 150_180mg、CaCl2: 330_360mg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg> ZnSO4.7H20: 8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素 0.08-0.15mg、甘氨酸 1.7-2.5mg、琼脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g ；
b.培养基B:(NH4)2S04:460-480mg、KN03:28 00-28 50mg、MgSO4.7H20:175-185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_节氨基嘌呤0.2-1.0mg、土豆80_150g、琼脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g ；
c.培养基C: (NH4) 2S04:460-480mg、KNO3:2800_2850mg、MgSO4.7H20:175_185mg、KH2PO4: 400-450mg、CaCl2: 12 5_140mg、K1:0.65-0.8 5mg、H3BO3: 1.6-1.9mg、MnSO4.4 H2 0:4.0-4.5mg、ZnSO4.7 H2 0:1.3-1.5mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4 *7H20:27.5-28.5mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素 0.8-1.0mg、甘氨酸1.7-2.5mg、萘乙酸0.1-0.5mg、6_节氨基嘌呤0.1-0.5mg、土豆80_150g、琼脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g ； d.培养基D:l-5g花宝二号、0.1-0.Sg水解酪蛋白、萘乙酸0.1-0.5mg、6-苄氨基嘌呤.0.1-0.5mg、土豆 80-150g、琼脂 6.5-7.5g、白砂糖 20_30g ；
e.培养基E: (NH4)2SO4:128-135mg、KNO3:1800_2500mg、MgSO4.7H20:250_300mg、NaH2PO4.H20: 130_160mg、CaCl2: 150-17Omg、K1:0.65-0.85mg、H3BO3:2.3-3.0mg、MnSO4.4H20: 9.5-11.0mg、ZnSO4.7H20: 1.6-2.2mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、烟酸 0.9-1.6mg、盐酸吡哆醇 1.0-1.8mg、盐酸硫胺素9.6-10.5mg、萘乙酸0.3-0.8mg、6_节氨基嘌呤0.4-1.0mg、土豆80_150g、琼脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g ； f.培养基F:NH4N03:800-830mg、KN03:950-1000mg、MgSO4.7H20:175-190mg、KH2PO4: 60_85mg、CaCl2: 160_250mg、K1:0.6 5-0.85mg、H3BO3: 6.0-6.6mg、MnSO4.4H20:22.0-25.0mg、ZnSO4.7H20: 8.5-9.0mg、Na2MoO4.2H20: 0.18-0.25mg、CuSO4.5H20:0.015-0.025mg、CoCl2.6H20:0.015-0.025mg、Na2-EDTA:37.0-38.0mg、FeSO4.7H20:27.5-28.5mg、肌醇 80_150mg、烟酸 0.2-0.6mg、盐酸吡哆醇 0.2-0.5mg、盐酸硫胺素 0.08-0.15mg、甘氨酸 1.7-2.5mg、 萘乙酸0.1-0.8mg、吲哚乙酸0.2-1.0mg、活性炭0.5-1.5mg、香蕉100_150g、琼脂.6.5-7.5g、白砂糖 20-30g。
2.—种权利要求1所述培养基系列的配制方法，其特征在于配制过程以IL培养基计，步骤如下: a.量取约500ml水放入热水锅中并加热； b.称取6.5-7.5g琼脂粉； c.待水温 达到80°C时加入琼脂粉，搅拌均匀，加热至沸腾； d.加入权 利要求1中各培养基所述药品； e.称取80-150g土豆或香蕉，将其切成小块并用榨汁机榨汁； f.将榨好的土豆汁或香蕉汁过滤至热水锅中； g.加入活性炭0.5-1.5mg ； h.加入白砂糖20-30g;i.待药品和白砂糖全部溶解后加水定容至IL并搅拌均匀； j.用pH试纸调pH值为5.8-6.2 ； k.分装，将配制好的培养基倒入组培瓶，倒入量视组培瓶容量大小而定，一般为容器的1/5左右；1.高压蒸汽灭菌，121°C, 1.5Mpa, 20min ; m.灭完菌的培养基放入接种室内静置，让其降温后凝固； 在配制培养基A、B、C、D、E、F时步骤d所加入的药品分别对应为权利要求1所述的培养基么、8、(:、03、？时中的成分； 在配制培养基B、C、D、E、F时要进行步骤e、f ; 在配制培养基F时要进行步骤g。
3.一种使用权利要求1所述培养基系列由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的组培方法，其特征包括以下的步骤: (1)铁皮石斛种子的无菌萌发 a.在超净工作台上将铁皮石斛种子依次用酒精浸泡lmin，次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水漂洗3次，每次Imin ； b.将彻底消毒并漂洗后的种子取出，从种子的一端将其切开，切开后，将粉末状胚均匀的播撒到培养基A上； c.置于温度为25°C，无光照的环境下进行培养； d.每天对其培养环境臭氧灭菌Ih； e.30天左右种子萌发之后，将组培瓶置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养，每天对其培养环境臭氧灭菌Ih ； f.45天左右，萌发的种子形成原球茎； (2)铁皮石斛原球茎的增殖 a.在超净工作台上用勺子将种子萌发形成的原球茎均匀的转入到培养基B上； b.置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养； c.每天对其培养环境臭氧灭菌Ih； d.原球茎长出淡黄色愈伤组织，45天左右，愈伤组织不断分裂增殖成类原球茎； (3)铁皮石斛类原球茎的分化 a.在超净工作台上用勺子将类原球茎挑出并均匀的转入到培养基C上； b.置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养；C.每天对其培养环境臭氧灭菌Ih ； d.60-90天左右，类原球茎分化成小苗； (4)铁皮石斛小苗的壮苗 a.在超净工作台上用镊子小心的夹出类原球茎分化形成的小苗放置在事先消毒过的大培养皿上，并把小苗插入培养基D或E中； b.置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养； c.每天对其培养环境臭氧灭菌Ih； d.60-90天左右，小苗成长为长势良好的铁皮石斛大苗； (5)铁皮石斛大苗的生根 a.在超净工作台上用镊子小心的夹出铁皮石斛大苗放置在事先消毒过的大培养皿上; b.将大苗一根一根的挑出并插入培养基F中； c.置于温度为25°C，光照20001x，每日光照12h的环境下进行培养； d.每天对其 培养环境臭氧灭菌Ih； e.60-90天左右，大苗成长为完整的铁皮石斛组培苗； (6)铁皮石斛组培苗的炼苗与移栽 a.将组培瓶里的成苗放置在自然光下炼苗一周； b.将瓶苗取出并洗净根部培养基后，移栽至泥炭土和苔藓体积比为1:1的混合基质中，成活率在90%以上。
4.根据权利要求3所述的由铁皮石斛类原球茎快速繁殖成苗的组培方法，其特征在于所述步骤(1)所述的铁皮石斛种子采集的是野生铁皮石斛或者人工培育的铁皮石斛。
【文档编号】A01H4/00GK103688860SQ201310699964
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】丁小余, 郑瑞, 牛志韬 申请人:南京师范大学