专利名称：一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法
技术领域：
本发明涉及铁皮石斛的组培技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛组织培养ー步成苗的方法。
背景技术：
铁皮石斛，被誉为“中华九大仙草之首”，为兰科多年生草本植物。生于山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐高温、干燥，不耐寒。铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名，具有益胃生津，滋阴清热等药用价值。铁皮石斛种子微小，自然萌发率和繁殖率低，生产上的种苗均来自组织培养。目前，铁皮石斛的组培育苗主要通过原球茎诱导、幼苗分化与壮苗培养3个阶段来实现，培养 时间较长、成本较高。因此，如何缩短培养时间、提高培养效率、降低培养成本已成为促进铁皮石斛产业加速发展的当务之急。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种铁皮石斛组织培养ー步成苗的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的一种铁皮石斛组织培养ー步成苗的方法，包括以下步骤
(1)制备成苗培养基以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加0.Img的6-苄氨基嘌呤、0. 3mg的a -萘こ酸、2. Og的活性炭、3. 5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节PH值至6. 0，得成苗培养基；均匀地将成苗培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕后加盖；培养容器加盖后，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为121°C下灭菌20分钟，灭菌后取出培养容器，冷却后备用；
(2)铁皮石斛果实灭菌将铁皮石斛果实放入水中清洗干净；在无菌条件下，将铁皮石斛果实在体积百分比浓度为75%的こ醇溶液中浸泡I分钟，取出用无菌水清洗若干遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10分钟，再用无菌水清洗若干適，吸干水分后放入无菌培养皿中备用；
(3)接种解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在成苗培养基表面，盖紧盖子；
(4)培养将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为温度25°C，光照时间每天12小时，光照强度1500 20001x，培养时间约为3个月，得到0. 5-1. 0 cm的幼苗；
(5)转接首先配置壮苗培养基每升B5培养基中添加0.5mg的6-苄氨基嘌呤、I. Omg的a -萘こ酸、3. Og的活性炭、3. Og的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节PH值至6. 0，得状苗培养基；然后将幼苗转接至壮苗培养基，继续培养，直至苗高5-6cm时，移栽至大棚。本发明的有益效果是本发明通过合理掌控两种激素用量及相互间的配比，以及其他辅料的添加，促进铁皮石斛种子一歩成苗，而不必经过原球茎阶段，缩短培养时间2个月左右，降低了经济成本。转接结果也表明，一歩成苗培养成的组培苗长势旺盛，符合生产所需，可作为铁皮石斛生产种苗的重要来源。
具体实施例方式本发明铁皮石斛组织培养ー步成苗的方法，包括以下步骤
I.成苗培养基准备
(I)配制以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加0. Im g的6-苄氨基嘌呤、0. 3mg的a -萘こ酸、2. Og的活性炭，3. 5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6. 0，得成苗培养基。(2)分装均匀地将培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕，加盖。(3)灭菌培养容器加盖后，及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为121°C下灭菌20分钟，灭菌后及时取出培养容器，冷却后备用。2.外植体灭菌
先清洗将外植体铁皮石斛果实放入清水中，加少许洗洁精，清洗果实表面，后用流水冲洗干净。灭菌事先将镊子和烧杯灭菌，在无菌条件下，用镊子将果实在体积百分比浓度为75 %的こ醇溶液中浸泡I分钟，取出用无菌水清洗2遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10分钟，再用无菌水清洗6遍，吸干水分，放入无菌培养皿中备用。3.接种
用无菌解剖刀解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在培养基表面，立刻盖紧盖子。4.培养
将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为■ 温度25°C，光照时间每天12小时，光照强度1500 20001x，培养时间约为3个月，得到0. 5-1. 0 cm的幼苗；培养期间要勤检查，发现污染及时移除。5.转接
配置壮苗培养基每升B5培养基中添加0. 5mg的6-苄氨基嘌呤、I. Omg的a -萘こ酸、3. Og的活性炭、3. Og的琼脂和30g的蔗糖。加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节PH值至6. 0，得状苗培养基。将高0.5-1. 0 cm的幼苗转接至壮苗培养基，继续培养，直至苗高5-6 cm时，移栽至大棚。
权利要求
1.一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)制备成苗培养基以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加O.Img的6-苄氨基嘌呤、O. 3mg的α -萘乙酸、2. Og的活性炭、3. 5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节PH值至6. 0，得成苗培养基；均匀地将成苗培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕后加盖；培养容器加盖后，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为121°C下灭菌20分钟，灭菌后取出培养容器，冷却后备用； (2)铁皮石斛果实灭菌将铁皮石斛果实放入水中清洗干净；在无菌条件下，将铁皮石斛果实在体积百分比浓度为75%的乙醇溶液中浸泡I分钟，取出用无菌水清洗若干遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10分钟，再用无菌水清洗若干遍，吸干水分后放入无菌培养皿中备用； (3)接种解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在成苗培养基表面，盖紧盖子； (4)培养将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为温度25°C，光照时间每天12小时，光照强度1500 20001x，培养时间约为3个月，得到O. 5-1. O cm的幼苗； (5)转接首先配置壮苗培养基每升B5培养基中添加O.5mg的6-苄氨基嘌呤、I. Omg的α -萘乙酸、3. Og的活性炭、3. Og的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节PH值至6. 0，得状苗培养基；然后将幼苗转接至壮苗培养基，继续培养，直至苗高5-6cm时，移栽至大棚。
全文摘要
本发明公开了一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，该方法通过合理调配培养基中两种激素的比例和剂量，同时加入活性炭等辅料，使得铁皮石斛种子直接发育成幼苗，将幼苗转接到壮苗培养基之后，成活率达99.5%以上。本发明可将铁皮石斛组织培养的成苗时间缩短2个月，显著提高培养效率，降低经济成本，可作为铁皮石斛组培苗生产的重要方法。
文档编号A01H4/00GK102845308SQ20121036891
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者沈晓霞, 沈宇峰, 王志安 申请人:浙江省中药研究所有限公司