根际有益细菌促进党参种子萌发的方法
【专利摘要】本发明涉及一种采用根际有益细菌促进党参子种子萌发的处理方法。本发明利用根际促生微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)一种菌株菌液浸泡党参种子，显著提高了党参种子发芽势和发芽率，从而提高党参种子活力和出苗率，克服了生产上党参种子小，发芽势和发芽率低，出苗不整齐的问题，以减少党参补苗及反复发芽造成的人力、物力等经济损失。同时，枯草芽孢杆菌具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，改善植株生长发育。本发明种子处理方法简单，可广泛应用于党参的栽培，具有重要的社会、经济和生态经济价值。
【专利说明】根际有益细菌促进党参种子萌发的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物学和植物生理学领域，涉及利用根际有益细菌枯草芽孢杆菌 GB03菌株提高党参种子发芽势和发芽率，从而促进党参种子萌发的方法，保证种子播种后田间出苗健壮、整体一致。
【背景技术】
[0002]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，它能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，改善植株生长发育，增加植物对盐胁迫等逆境的抵御能力，从而提高植物的抗病性。
[0003]近年来，党参在治疗冠心病、高血脂症、低血压病等面取得了新的进展，使其用量速增(马雪梅和吴朝峰2009)，但因党参种子小，寿命短，直播育苗时发芽率低，栽培时播种量大，成本高，达不到生产要求。据调查，国内每年党参的需求量远远超过生产，从党参作为商品在市场上交易以来，党参的生产和销售就经常出现大起大落的现象，价格波动也很大。目前，全国党参野生资源蕴藏量约为1.58万吨，但是资源分散、产量呈现逐年下降的趋势，所能提供的商品数量极其有限，党参市场供求矛盾极为突出(刘德军等2001)。从中药党参资源调查结果表明，目前市场上的党参主产于山西、甘肃、陕西、四川和湖北等省，主要为栽培品，少量为野生，甘肃除了原产地外，近几十年大面积发展党参种植，同时扩大了素花党参的生产规模，成为中药党参最大的产区(张向东等2013)。
[0004]目前，随着中药现代化的实施以及中国在世界经济中的地位越来越高，中药材的生产和出口均稳步的增长，据估计2007年我国党参的出口已经超过了 0.3万吨，作为中药制药原料，党参的用量也显著增长。近年来，党参的市场价格多次抬升，而且由于全国党参总产量明显下降，使其价格大幅度上调。党参药材供不应求已经成为中药生产中的一大难题，因此，改善党参生产土壤质量，调控活性成分及代谢产物积累，提高党参质量已经成为中药材种植业的首选，也是党参生产中亟待解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法。是利用根际有益细菌枯草芽孢杆菌GB03促进党参种子的萌发，该方法操作简单，成本低，高效，无毒并对环境友好无害。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为:
[0007](1)党参种子消毒处理:籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡8-lOs后，使用5%次氯酸钠浸泡10-12min，用灭菌的蒸馏水冲洗7_8次，于2_4°C冰箱过夜；
[0008](2)枯草芽孢杆菌GB03菌液制备:先配制溶菌肉汤LB液体培养基:按照氯化钠、 胰蛋白胨和酵母粉的比例为1:2:1配制，溶剂为蒸馏水；调pH到7.2，高温为115-132°C灭菌，待冷却温度为20-35°C后，每IOOmL的LB液体培养基加入50-100 μ L的枯草芽孢杆菌GB03菌液，在转速为180-250r/min下，温度为25_30°C的恒温培养摇床上培养过夜后，测定菌液浓度为OD6tltl为0.8-1.0时，取出备用；
[0009](3)种子菌液处理:将步骤(1)处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中5min-20min，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。
[0010]本发明的有益效果:本发明可显著提高党参种子发芽势和发芽率，从而提高党参种子活力和出苗率，保持较整齐的发芽率，克服了生产上党参种子小，发芽势和发芽率低，出苗不整齐的问题，以减少生产上党参补苗及反复发芽造成的人力、物力等经济损失。同时，枯草芽孢杆菌具有对人畜无毒无害、不污染环境、非致病性和抗逆性强等特点，能够产生多种生长激素类物质和丰富的抗菌物质，促进植物生长，改善植株生长发育。本发明种子处理方法简单，可广泛应用于党参的栽培，具有重要的社会、经济和生态经济价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:萌发3天后党参种子发芽情况比较。图中四个小图分别表示对照、有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟、10分钟和20分钟；
[0012]图2:萌发3天后党参种子萌发幼苗根系发育情况比较。左上图为有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟，左右图为对照；下图为放大的党参萌发种子；
[0013]图3:GB03菌液浸泡对党参种子发芽势的影响。图中四个柱子分别表示对照、有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟、10分钟和20分钟的党参种子发芽势；
[0014]图4:GB03菌液浸泡对党参种子发芽率的影响。图中四个柱子分别表示对照、有益细菌菌液浸泡党参种子5分钟、10分钟和20分钟的党参种子发芽率。`【具体实施方式】
[0015]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。所述【技术领域】的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
[0016]实施例1:一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为:
[0017](I)党参种子消毒处理:籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡8s后,使用5%次氯酸钠浸泡IOmin,用灭菌的蒸懼水冲洗7_8次,于4°C冰箱过夜；
[0018](2)枯草芽孢杆菌GB03菌液制备:
[0019]先配制LB液体培养基:按照氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，用标准型PH计(PB-10，北京赛多利斯)调pH到6.8，使用立式压力蒸汽灭菌锅(LDZX-50KBS,上海申安)高温118-125°C灭菌待冷却后，每IOOmL的LB液体培养基加入50μ L的GB03菌液，在转速为180r/min下，温度为28°C的恒温培养摇床(THZ-300，上海一恒科技)上培养过夜后，使用核酸检测仪(NanoDix)P 1000，德国)测定菌液浓度为0D600 =0.9时取出备用，菌液为现配现用。
[0020](3)种子菌液处理:将步骤(1)处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中5min，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。
[0021]实施例2: —种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为:[0022](1)党参种子消毒处理:籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡9s后,使用5%次氯酸钠浸泡Ilmin,用灭菌的蒸懼水冲洗7_8次,于2°C冰箱过夜；
[0023](2)枯草芽孢杆菌GB03菌液制备:
[0024]先配制溶菌肉汤LB液体培养基:按照氯化钠、胰蛋白胨和酵母粉的比例为1:2:1 配制，溶剂为蒸馏水JMpH到7.2，高温为115-118°c灭菌，待冷却温度为20°C后，每IOOmL 的LB液体培养基加入80 ii L的枯草芽孢杆菌GB03菌液，在转速为180_250r/min下，温度为25°C的恒温培养摇床上培养过夜后，测定菌液浓度为OD6tltl为0.8-1.0时，取出备用。
[0025](3)种子菌液处理:将步骤(1)处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中 lOmin，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。
[0026]实施例3: —种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其主要特点在于步骤为:
[0027](I)党参种子消毒处理:籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡IOs后,使用5%次氯酸钠浸泡12min,用灭菌的蒸懼水冲洗7_8次,于4°C冰箱过夜；
[0028](2)枯草芽孢杆菌GB03菌液制备:
[0029]先配制溶菌肉汤LB液体培养基:按照氯化钠、胰蛋白胨和酵母粉的比例为1:2:1 配制，溶剂为蒸馏水JMpH到7.2，高温为125-132°c灭菌，待冷却温度为35°C后，每IOOmL 的LB液体培养基加入100 u L的枯草芽孢杆菌GB03菌液，在转速为180_250r/min下，温度为30°C的恒温培养摇床上培养过夜后，测定菌液浓度为OD6tltl为0.8-1.0时，取出备用；
[0030](3)种子菌液处理:将步骤(1)处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中 20min，然后将菌液倒出，处理完成的种子进行播种。
[0031]实验例:根际有益细菌促进党参种子萌发的方法
[0032]I材料与方法
[0033]1.1 材料
[0034]党参种子于2011年10月采自甘肃岷县中药材技术指导站药园，经甘肃中医学院王引权教授鉴定为桔梗科党参属植物党参Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.,种子保存于实验室4°C冰箱。枯草芽孢杆菌GB03菌株由美国德克萨斯州理工大学Paul W.Par6教授实验室提供，保存于-80°C冰箱。75%酒精、次氯酸钠、氯化钠均为标准试剂。酵母粉、胰蛋白胨和琼脂粉为英国进口试剂。
[0035]1.2实验方法
[0036]1.2.1种子处理
[0037]挑选籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，于超净工作台用75%的酒精、5%次氯酸钠中分别浸泡IOs和IOmin后，用灭菌的蒸馏水冲洗7-8次，于4°C冰箱过夜。
[0038]1.2.2枯草芽胞杆菌GB03菌液的制备
[0039]配制LB液体培养基:按照氯化钠5g/L、胰蛋白胨10g/L和酵母粉5g/L的比例配制，用标准型PH计(PB-10，北京赛多利斯)调pH到7.2，使用立式压力蒸汽灭菌锅 (LDZX-50KBS,上海申安)高温灭菌待冷却后，每IOOmL的LB液体培养基加入100 y L的GB03 菌液，在转速为180r/min下，温度为28°C的恒温培养摇床(THZ-300，上海一恒科技)上培养过夜后，使用核酸蛋白检测仪(NanoDix)P 1000，德国)测定菌液浓度为0D_ = 0.9时取出备用，菌液为现配现用。
[0040]1.2.3菌液浸泡种子萌发的实验[0041]在灭菌的离心管中加入培养好的GB03菌液，然后将消毒好的党参种子浸泡在菌液中(无菌水作对照)，计时5min、10min和20min后,迅速取出种子,平铺在已灭菌铺有两层滤纸的培养皿中，铺种之前，在滤纸上滴入等量无菌水，至滤纸表面形成水膜为止，取出的种子均匀的铺在滤纸上，每皿100粒，置于25°C黑暗条件培养，每天统计观察发芽情况，培养IOd后统计发芽率，计算发芽势。
[0042]1.3数据处理及统计分析方法
[0043]实验中以胚根突破种皮，露白视为萌发，每天观察党参种子并记录当天萌发的种子数量，发芽率(GP) = (Gt/T)X100%，S* Gt为发芽终了全部发芽的种子数，T为种子的总数；发芽势是指在种子发芽过程中日发芽种子数达到最高峰时，党参发芽势确定为发芽第3d，发芽的种子数占供测样品种子数的百分率。发芽势是判断田间出苗率的指标(杨晓杰等2003;赵兰枝等2004)。每处理设置至少6个重复，图表中的数值为平均值土 SE ;采用Excel 2003和SPSS 13.0分别进行数据处理和统计分析，用One-way ANOVA检验各处理间差异的显著水平。
[0044]2结果与分析
[0045]发芽势是衡量种子萌发能力的重要标准，发芽势高的种子，生命力强，在大田的播种发芽率较高，播种后幼苗出土正常。由图1可以看出，萌发实验第3天枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液侵泡5min、IOmin和20min后的党参种子萌发数量较多；从图2可以看出侵泡5分钟的党参萌发种子胚根上根毛明显多于对照。由图3可以看出，GB03菌液浸泡党参种子5min、10min和20min后，较对照均显著(P〈0.05)提高了党参种子发芽势，提高幅度分别为2.1倍、1.9倍和1.5倍，其中5min效果最佳，对发芽势的提高能力最强。从图4可以看出，GB03菌液浸泡党参种子5min、IOmin和20min后，较对照对党参种子的发芽率均有提高，其中5min、IOmin浸泡提高党参种子发芽率8.0%和2.0%，20min显著(P〈0.05)提高发芽率
11.6%(P〈0.05)。本实验结果`表明，菌液浸泡党参种子5min对种子萌发的促进效果最佳，尤其是对发芽势的提高最为显著。
[0046]3 讨论
[0047]发芽势为发芽初期比较集中的发芽率，它决定着出苗的整齐程度，发芽势高，则出苗整齐，苗生长一致，反之，苗参差不齐，在发芽率相同时，发芽势高的种子生命力强，在场地的播种发芽率较高，播种后幼苗出土正常，所以，发芽势是计算播种量的因子之一。
[0048]本研究结果发现，枯草芽孢杆菌菌液GB03浸泡显著提高了党参种子发芽势，从而提高了党参种子活力。
[0049]综上所述，枯草芽孢杆菌菌株GB03菌液浸泡显著提高了党参种子发芽势，对发芽势的促进作用较发芽率更为明显，从而提高了党参种子活力和出苗率，保持较整齐的发芽率，克服了生产上党参种子小，发芽率低的问题，从而减少生产上党参补苗及反复发芽造成的人力等经济损失。研究GB03对种子萌发的调控，可以更好为其在实际生产中的应用提供理论依据与技术指导。
[0050]4 小结
[0051](I)枯草芽孢杆菌GB03菌液浸泡党参种子5min、IOmin和20min后,较对照均显著(P〈0.05)的提高了党参种子的发芽势，提高幅度分别为211.8%、192.5%和145.8%，其中5min效果最佳。[0052](2)枯草芽孢杆菌GB03菌液浸泡党参种子5min、IOmin和20min后，较对照对党参种子的发芽率均有提高，其中5min、IOmin浸泡提高党参种子发芽率为8.0%和2.0%，20min 显著(P〈0.05)提高了发芽率为11.6%。
[0053]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明`的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种根际有益细菌促进党参种子萌发的方法，其特征包括以下步骤: (1)党参种子消毒处理:籽粒饱满无缺损、均匀一致的党参种子，用75%的酒精浸泡8-10s后，使用5%次氯酸钠浸泡10-12min，用灭菌的蒸馏水冲洗7-8次，于2-4°C冰箱过夜； (2)枯草芽孢杆菌GB03菌液制备:配制溶菌肉汤LB液体培养基:按照氯化钠、胰蛋白胨和酵母粉的比例为1:2:1配制，溶剂为蒸馏水JfpH到7.2，高温为115-132°C灭菌，待冷却温度为20-35°C后，每IOOmL的LB液体培养基加入50-100 μ L的枯草芽孢杆菌GB03菌液，在转速为180-250r/min下，温度为25_30°C的恒温培养摇床上培养过夜后，测定菌液浓度为OD6tltl为0.8-1.0时，取出备用； (3)种子菌液处理:将步骤(1)处理完成种子浸泡于枯草芽孢杆菌GB03菌液中5min-20min，然后将菌液倒出`，处理完成的种子进行播种。
【文档编号】A01G7/06GK103548593SQ201310517934
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】张金林, 吴永娜, 王锁民, 吕昕培, 李静, 韩庆庆, 包爱科 申请人:兰州大学