防治水稻病害的生物杀菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种防治水稻病害的生物杀菌剂，该生物杀菌剂的活性成分为肉桂精油。具体而言：该生物杀菌剂由肉桂精油、表面活性剂、助乳化剂和水组成；所述每kg生物杀菌剂中，含有0.75～75000mg的肉桂精油、1.75～175000mg的表面活性剂和0.75～75000mg的助乳化剂；余量为水。本发明的生物杀菌剂主要用于防治白叶枯病菌害。
【专利说明】防治水稻病害的生物杀菌剂
【技术领域】
[0001]本发明属于水稻病害防治【技术领域】，具体地说涉及生物防治领域中一种水稻病害的生物杀菌剂。
【背景技术】
[0002]近几年我国稻谷总产量处于稳定增长态势，我国作为水稻产量第一的大国，对水稻的病害防治尤为重要。水稻病害有很多，其中白叶枯病害在水稻生长的每个时期都可能发生。水稻白叶枯病十九世纪末首先在日本发现，目前已成为亚洲稻区的重要病害。我国华东、华中、华南稻区发生严重，西北、西南、华北和东北部分稻区也有分布，西藏也有发现。
[0003]目前只能通过施用农药防治该病害，但残留农药会对人体造成急、慢性中毒，导致癌症、畸形、突变等危害。近年来，多种天然植物提取物被用来进行果蔬病害的防治研究。植物精油是具有芳香气味的油状液体，通常是从植物的花、芽、种子、叶、枝条、树皮、果实和根获得，且被认为是一类GRAS (generally recognized as safe)物质。对病原菌具有多种抑制机制，因此病原菌不易对植物精油产生抗性。但植物精油在水中的溶解度极低，几乎不溶于水，常温下存放也不稳定，在空气中易氧化，能随水蒸气挥发。因此，提高植物精油的溶解度和稳定性，使其更有效的发挥抑菌作用具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种防治水稻病害(特别是白叶枯病)的生物杀菌剂。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供一种防治水稻病害的生物杀菌剂，该生物杀菌剂的活性成分为肉桂精油。
[0006]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的改进:该生物杀菌剂由肉桂精油、表面活性剂、助乳化剂和水组成；
[0007]每kg生物杀菌剂中，含有0.75~75000mg的肉桂精油、1.75_175000mg的表面活性剂、0.75~75000mg的助乳化剂；余量为水(例如为蒸馏水)。
[0008]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的进一步改进:每kg生物杀菌剂中，含有7.5~750mg的肉桂精油、17.5~3500mg的表面活性剂、7.5~750mg的助乳化剂。更佳为:每kg生物杀菌剂中，含有15~750mg的肉桂精油、70~3500mg的表面活性剂、15~750mg的助乳化剂。
[0009]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的进一步改进:肉桂精油与助乳化剂的质量比为1:1。
[0010]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的进一步改进:表面活性剂为茶皂素，助乳化剂为丙酸。
[0011]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的进一步改进:表面活性剂(茶皂素)与肉桂精油的质量比为4~5:1。[0012]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的进一步改进:每kg生物杀菌剂中，含有0.75g的肉桂精油、3.5g的茶皂素和0.75g的丙酸；余量为水。
[0013]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的进一步改进:每kg生物杀菌剂中，含有75mg的肉桂精油、350mg的茶皂素和75mg的丙酸；余量为水。
[0014]作为本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂的进一步改进:水稻病害为白叶枯病菌病害。
[0015]微乳液是一种由一定配比的油、表面活性剂、助表面活性剂和水自发形成的各向同性、外观透明或半透明、热力学稳定的分散体系，离心或长期放置不易发生相分离。而且研究表明，应用微乳化技术可以提高精油的溶解度，增强其对病原菌的抑制作用。
[0016]经实验证明，本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂能有效地抑制水稻白叶枯病菌，且随着使用浓度的增加，效果增强。该精油对人畜无致病性，能安全地用于水稻病害的生物防治。
[0017]在发明过程中，发明人以肉桂精油、茶皂素等为原料，经过研究配制成一种防治水稻病害的生物杀菌剂肉桂精油微乳液；该肉桂精油微乳液特别适用于抑制水稻白叶枯病菌。
[0018]在发明过程中，发明人选用了如图1所述的三元相图，具体如下:
[0019]正三角形上的三个顶点分别代表着100%含量的水相、油相和表面活性剂相，三边分别代表水相-油相、油相-表面活性剂相、表面活性剂相-水相的二元体系，两个组分的相对含量由该点至边线的端点的距离来确定，如A点所示为:油相30%、表面活性剂相70%。边线上任意一 点与顶点连线表示底边上的两组分的配比保持不变的体系，如图中的AB，沿从A到B (随着水相的滴加)，体系中的油相与表面活性剂相的比例始终是3:7。三角形内任意一点表示三元体系，总组成由从该点出发与三角形三个顶点的连线与对边的交点来确定，如图C点的组成为油相:水相:表面活性剂相=7:2:3。(由线BC与边Oilphase-Surfactant phase的交点可得油相:表面活性剂相=7:3,由线C-Oil phase与边Aqueous phase-Surf actant phase的交点可得水相:表面活性剂相=2:3)。
[0020]备注说明:上述油相是由助乳化剂和肉桂精油按照组成1:1的质量比组成。
[0021]本发明的防治水稻病害的生物杀菌剂实际使用时；将所述生物杀菌剂喷洒在稻田中，每亩的用量为有效成分肉桂精油为0.015-0.75g ;一般每隔5天喷洒一次。
[0022]本发明所得的防治水稻病害的生物杀菌剂为微乳液，其是一种澄清透明的溶液，长时间放置不会分层，能表明肉桂精油已经被溶解。而将肉桂精油直接滴到水里搅拌后形成的是乳状液，放置后会分层，油层漂在上面，所以溶解度低而且挥发性强。本发明在肉桂精油中添加了表面活性剂和助乳化剂然后与水混合，所形成的微乳液能克服肉桂精油单独与水混合所形成的乳状液的上述缺陷。
[0023]对本发明所得的防治水稻病害的生物杀菌剂进行如下稳定性考察:
[0024](I)离心稳定性:
[0025]采用恒温试验法考察，取制备好的0/W肉桂精油微乳液(即，本发明所得的防治水稻病害的生物杀菌剂)适量于1.5mL离心管中，于高速离心机中以6000g离心30min，观察是否相变。结果:没有相变。
[0026](2)化学稳定性:[0027]定量称取制备好的0/W肉桂精油微乳液于试管中，缓慢滴加4mol/L的NaCl溶液，并震荡均匀，直至微乳液变浑浊，记录加入NaCl溶液的质量。结果:可以无限添加，也不会变浑浊。
[0028](3)温度稳定性:
[0029]分装并密封制备好的0/W肉桂精油微乳，将其置于75°C恒温水浴槽内lOmin，观察是否发生相变。结果:不会发生相变。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。[0031]图1为典型的三元相图。
[0032]图2为不同浓度微乳液对白叶枯病菌的体外平板抑制的效果对比图；
[0033]小写的a\b\c代表的是各浓度之间产生的效果的差异性是否显著，如果柱子上标注的都是同样的字母，说明这两种浓度下的抑菌效果是一样的，没有差异性；
[0034]图3为不同浓度微乳液对白叶枯病菌的体外摇瓶抑制的效果对比图；
[0035]图4为不同浓度微乳液对白叶枯病害的防治效果图。
[0036]图5为对比例所述的微乳液对白叶枯病害的防治效果图。
【具体实施方式】
[0037]实施例1、肉桂精油微乳液(防治水稻病害的生物杀菌剂)的配制:
[0038]一、配制原液:
[0039]I)、茶皂素溶液的配制:将100g茶皂素溶解在IOOmL蒸馏水中，配制质量分数为50%的茶阜素溶液。
[0040]2)、将茶皂素溶液、肉桂精油、丙酸和蒸馏水相混合，得原液；所述每kg原液中含有75g的肉桂精油、350g的茶皂素(SP)、75g的丙酸；余量为水(蒸馏水)。
[0041]上述原液可存放于25°C培养箱。上述原液对应图2中的I。
[0042]二、配制成以下各种防治水稻病害的生物杀菌剂:
[0043]I)稀释10倍的微乳液(I(T1C):吸取0.5g原液于4.5g的蒸馏水，摇匀；得防治水稻病害的生物杀菌剂II。
[0044]每kg的上述生物杀菌剂II中，含有7.5g的肉桂精油、35g的茶皂素(SP)、7.5g的丙酸；余量为水(蒸馏水)。
[0045]2)、稀释100倍的微乳液(10_2C):吸取0.05g原液于4.95g的蒸馏水，摇匀。得防治水稻病害的生物杀菌剂III。
[0046]每kg的上述生物杀菌剂III中，含有0.75g的肉桂精油、3.5g的茶皂素(SP)、0.75g的丙酸；余量为水(蒸馏水)。
[0047]3)、稀释1000倍的微乳液(10_3C):吸取0.005g原液于4.995g的蒸馏水，摇匀。得防治水稻病害的生物杀菌剂IV。
[0048]每kg的上述生物杀菌剂IV中，含有75mg的肉桂精油、350mg的茶阜素(SP)、75mg的丙酸；余量为水(蒸馏水)。
[0049]4)、稀释5000倍的微乳液(5 X KT3C):吸取0.0OIg原液于4.999g的蒸馏水，摇匀。得防治水稻病害的生物杀菌剂V。
[0050]每kg的上述生物杀菌剂V中，含有15mg的肉桂精油、70mg的茶阜素(SP)、15mg的丙酸；余量为水(蒸馏水)。.[0051]5)、稀释10000倍的微乳液(10_4C):吸取0.0005g原液于4.9995g的蒸馏水，摇匀。得防治水稻病害的生物杀菌剂VI。
[0052]每kg的上述生物杀菌剂VI中，含有7.5mg的肉桂精油、35mg的茶阜素(SP)、7.5mg的丙酸；余量为水(蒸馏水)。
[0053]备注说明:上述生物杀菌剂II~生物杀菌剂VI对应图2~图4中的II~VI。
[0054]将上述防治水稻病害的生物杀菌剂分别进行如下实验:
[0055]一、肉桂精油微乳液对白叶枯病菌的体外平板抑制
[0056](I)活化白叶枯病菌。
[0057](2)将融化的PDA培养基倒入培养皿中，制备24个平板。4个一组共分6组。
`[0058](3)挑取白叶枯病菌于无菌水中混匀，测其OD值约为0.5。
[0059](4)吸取100 μ L步骤(3)所得菌液到制备好的平板中，用涂布棒将菌液涂匀涂开。
[0060](5)用镊子夹取牛津杯置于平板中心(牛津杯不宜插入培养基太深也不宜太浅)。
[0061](6)每组各吸取200 μ L肉桂精油微乳液于牛津杯中，分别放到3个平板中，作为处理；吸取200μ L无菌水于牛津杯中，放在另外的I个平板中，作为对照。
[0062](7)在28°C培养箱中培养2天。
[0063](8)测量抑菌圈直径。
[0064]所得结果如图2所示。
[0065]根据图2，我们得知:在微乳液I (即原液)和II (即生物杀菌剂II)的作用下，平板出现抑菌圈，其直径分别约为90_和32_ ;在其它浓度微乳液作用下，不出现抑菌圈，与空白对照一致；说明微乳原液I和II能显著抑制白叶枯病菌的生长，而其它浓度微乳液在平板中对白叶枯病菌的生长没有抑制作用。
[0066]二、肉桂精油微乳液对白叶枯病菌的体外摇瓶抑制
[0067]( I)活化白叶枯病原菌；
[0068](2)试管中加入马铃薯葡萄糖液体培养基，在高压灭菌锅中灭菌待用。
[0069](3)挑取白叶枯病菌于无菌水中混匀，测其OD值约为0.5。
[0070](4)在超净工作台上，将白叶枯菌液加入所有试管中，其中仅加入无菌水的试管作为对照组，加入微乳液的试管作为实验组。
[0071]具体为:每个试管加入白叶枯菌液0.1mL ;再分别对应加入0.5mL生物杀菌剂I1、生物杀菌剂II1、生物杀菌剂IV、生物杀菌剂V、生物杀菌剂VI ;最后每个试管加入培养液(步骤(2)所得)补足5mL。
[0072](5)在28°C摇床上培养。
[0073](6)测 OD 值。
[0074]所得结果如图3所示。
[0075]根据图3，我们得知:对照组白叶枯菌液OD值最大，在微乳液I1-1V作用下，菌液OD值为0，在微乳液VI作用下，OD值仅次于对照；说明微乳液I1- V能够完全或几乎完全抑制白叶枯病菌的生长，微乳液VI能部分抑制其生长。[0076]三、肉桂精油微乳液对白叶枯病害的体内防治
[0077](I)菌液制备:挑取白叶枯病菌于无菌水中混匀，测其OD值约为0.5。
[0078](2)将水稻分为6组，每组10株，分别为I个对照组和5个实验组。挑选新生的已经展开的叶片备用。
[0079](3)将剪刀浸入制备好的菌液，在挑选好的叶片上侧剪一个斜口，每次剪之前要重新浸菌液。
[0080]以此作为对照组。
[0081](4)取步骤(3)所得的已经侧剪的一组叶片，用移液枪吸取20 μ L不同浓度的肉桂精油微乳液(即，生物杀菌剂I1、生物杀菌剂II1、生物杀菌剂IV、生物杀菌剂V、生物杀菌剂VI)涂于斜口，作为实验组。
[0082](5)隔日观察水稻叶片白叶枯病害的发生状况。
[0083]所得结果如图4所示。
[0084]根据图4，我们得知:采用微乳液III~V做生物杀菌剂均能够显著抑制水稻白叶枯病害的发生，其中微乳液III的抑制效果最好。而对于微乳液II，其水稻叶片病斑直径反而比对照还大的原因是，精油浓度过高对水稻病害的发生有促进作用。
[0085]对比例1-1、一种防治水稻病害的生物杀菌剂，仅仅将茶皂素改成吐温-80，其余等同于生物杀菌剂III。
[0086]对比例1-2、一种防治水稻病害的生物杀菌剂，仅仅将茶皂素改成吐温-20，其余等同于生物杀菌剂III。
[0087]对比例2-1、一种防治水稻病害的生物杀菌剂，仅仅将丙酸改成无水乙醇，其余等同于生物杀菌剂III。
[0088]对比例2-2、一种防治水稻病害的生物杀菌剂，仅仅将丙酸改成甘油，其余等同于生物杀菌剂III。
[0089]对比例3-1、一种防治水稻病害的生物杀菌剂，仅仅将丙酸的含量由0.75g改成0.5g，其余等同于生物杀菌剂III。
[0090]对比例3-2、一种防治水稻病害的生物杀菌剂，仅仅将丙酸的含量由0.75g改成lg，其余等同于生物杀菌剂III。
[0091]对比例4、取消茶皂素的使用，
[0092]即，每kg的上述生物杀菌剂中，含有0.75g的肉桂精油、0.75g的丙酸；余量为水(蒸馏水)。.[0093]对比例5、取消丙酸的使用，
[0094]每kg的生物杀菌剂中，含有0.75g的肉桂精油、3.5g的茶皂素(SP);余量为水(蒸馏水)。.[0095]对比例6、同时取消茶皂素和丙酸的使用，
[0096]即，每kg的生物杀菌剂中，含有0.75g的肉桂精油；余量为水(蒸馏水)。.[0097]将上述所有对比例按照上述“肉桂精油微乳液对白叶枯病害的体内防治效果”进行实验，所得结果如图5所示。
[0098]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均 应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是:所述生物杀菌剂的活性成分为肉桂精油。
2.根据权利要求1所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是:所述生物杀菌剂由肉桂精油、表面活性剂、助乳化剂和水组成； 所述每kg生物杀菌剂中，含有0.75~75000mg的肉桂精油、1.75~175000mg的表面活性剂和0.75~75000mg的助乳化剂；余量为水。
3.根据权利要求2所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是: 所述每kg生物杀菌剂中，含有7.5~750mg的肉桂精油、17.5~3500mg的表面活性剂、7.5~750mg的助乳化剂。
4.根据权利要求3所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是:所述肉桂精油与助乳化剂的质量比为1:1。
5.根据权利要求4所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是:所述表面活性剂为茶皂素，助乳化剂为丙酸。
6.根据权利要求5所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是:所述表面活性剂与肉桂精油的质量比为4~5:1。
7.根据权利要求6所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是: 所述每kg生物杀菌剂中，含有0.75g的肉桂精油、3.5g的茶阜素和0.75g的丙酸；余量为水。
8.根据权利要求6所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是: 所述每kg生物杀菌剂中，含有75mg的肉桂精油、350mg的茶阜素和75mg的丙酸；余量为水。
9.根据权利要求1~8任一所述的防治水稻病害的生物杀菌剂，其特征是:所述水稻病害为白叶枯病菌病害。
【文档编号】A01P3/00GK103598225SQ201310629080
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】刘霞, 解秀平, 方伟文, 王璐琳, 徐玉莲 申请人:浙江师范大学