一种诱导水稻防卫反应的蛋白、其编码基因、制备方法和用途
【专利摘要】本发明提供一种能够诱导水稻防卫反应的植物免疫活性物质的编码基因，所述编码基因具有如SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。本发明还提供一种用于诱导水稻防卫反应的蛋白，所述蛋白具有如SEQ?ID?NO.7所示的氨基酸序列。本发明发现SEQ?ID?NO.1基因序列表达产生的蛋白能够明显引起水稻免疫反应，是一种新型的水稻免疫活性物质，其在水稻病害防治上将会有巨大的应用潜力，进而产生巨大的经济效益和社会效益。
【专利说明】一种诱导水稻防卫反应的蛋白、其编码基因、制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种能够诱导水稻防卫反应的蛋白及其编码基因。具体而言，本发明涉及细菌源免疫活性物质，其能够引起水稻免疫反应。
【背景技术】
[0002]水稻是我国主要粮食作物之一，种植面积约占全国耕地面积的1/4，年产量将近占全国粮食总产的1/2。水稻病害的危害一直严重影响水稻的生产，如不进行有效地防治，年均损失产量300亿公斤，即使在现行防治条件下，年均损失可能达200亿公斤。因此，研究和防治水稻病害具有十分重要的意义。
[0003]水稻病害的种类很多，全世界有近百种，其中白叶枯病发生面积大、流行性强、危害严重，是水稻上的“三大重要病害”之一。因为白叶枯发病后病灶位于水稻维管束中，所以白叶枯的防治还是比较困难。近期的研究结果表明，在水稻中转化微生物源基因后，该转基因水稻植株能够表现出对相关病害的抗性，证明了水稻能够在外来抗原性物质激发下产生相关抗病性。
[0004]随着近年农业高附加值的生产需求以及市场对有机食品的旺盛需求,市场亟需能够有效防止农作物病害又无农药残留的农防产品。因此开发具有免疫活性的生物活性蛋白，对于保障粮食生产以及改善民生质量是一种无可取代的方式。
【发明内容】
[0005]因此，本发明的目的是提供一种能够诱导水稻防卫反应的细菌源免疫活性物质的基因及其蛋白。
[0006]用于实现上述目的的技术方案如下:
[0007]—方面，本发明提供了一种植物免疫活性物质的编码基因，所述编码基因具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。或者,所述编码基因具有如SEQID N0.2所示的核苷酸序列。
[0008]优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
[0009]本发明提供的上述编码基因可以来源于燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae (已于2013年12月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号CGMCCN0.8661;进一步鉴定为燕麦嗜酸菌 Acidovorax avenae subsp.Avenae (Aaa))的基因组DNA，是本发明提供的新型水稻免疫活性物质的基因。特别地，本文将核苷酸序列如SEQIDN0.1的编码基因命名为“fliC”。
[0010]另一方面，本发明提供了一种用于诱导水稻防卫反应的蛋白，所述蛋白具有如SEQID N0.7所示的氨基酸序列； [0011]优选地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。[0012]本发明提供的上述蛋白可以由具有如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的编码基因编码得到。根据本发明的【具体实施方式】，氨基酸序列如SEQ ID顯.7所示的蛋白具有511^的分子量，本文将其命名为蛋白“FliC”。
[0013]又一方面，本发明提供上述蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤:
[0014](I)获取其编码基因；
[0015](2)使用步骤(1)得到的编码基因构建蛋白表达载体，并将其转化大肠杆菌；
[0016](3)诱导步骤(2)得到的经转化的大肠杆菌表达所述蛋白。
[0017]优选地,所述步骤(1)包括:
[0018]以燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae (CGMCC N0.8661)的基因组DNA为模板,米用PCR方法扩增所述蛋白的编码基因。
[0019]其中，可以以上游引物SEQ ID N0.5、下游引物SEQ ID N0.6直接从燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae CGMCC N0.8661的基因组DNA扩增得到如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其为蛋白FliC的编码基因。
[0020]或者，根据本发明的具体实施方案，可以以上游引物SEQ ID N0.3、下游引物SEQID N0.4从燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)的基因组DNA扩增得到如SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，其包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。将这一核苷酸序列与载体PMD-18T构建重组质粒作为模板，再以上游引物SEQ ID N0.5、下游引物SEQID N0.6扩增该重组质粒，得到如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0021]再或者，可以以上游引物SEQ ID N0.3、下游引物SEQ ID N0.4从燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)的基因组DNA扩增得到如 SEQ ID N0.2 所示的核苷酸序列，将其直接用于步骤(2)构建蛋白表达载体。
[0022]优选地,所述步骤(2)包括:
[0023]使用限制性内切酶BamH I和Hind III分别双酶切步骤(1)得到的编码基因与载体pET-28a，之后以T4连接酶连接得到的片段，从而构建重组蛋白表达质粒，然后将其转化到感受态大肠杆菌菌株中。根据本发明的具体实施方案，大肠杆菌菌株为BL21 (DE3)。
[0024]优选地,所述步骤(3 )包括:
[0025]以0.5mM的IPTG，诱导培养步骤(2)得到的经转化的大肠杆菌BL21，得到51kD的蛋白；优选地，所述诱导培养的条件为10°c，转速150rpm。
[0026]再一方面，实验证明，本发明提供的蛋白能够引起植物、特别是水稻的免疫反应。因此，本发明还提供所述编码基因或蛋白在制备植物免疫制剂中的用途。优选地，所述免疫制剂为水稻免疫制剂。
[0027]具体而言，获取本发明特定基因及蛋白的方法包括以下步骤:
[0028](I)获取燕麦嗜酸菌 Acidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)序列为 SEQ IDN0.1的鞭毛蛋白基因；
[0029](2)以步骤(1)获取的基因构建免疫活性蛋白表达载体。
[0030]优选地，上述方法还包括以下步骤:
[0031](3)将步骤(2)构建的免疫活性蛋白表达载体转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态中进行诱导表达。
[0032]在上述方法中，优选地，步骤(1)包括以下步骤:[0033]以燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)基因组 DNA 为模板,米用PCR方法扩增核苷酸序列为SEQ ID N0.2的基因序列构建至T载体pMD_18T中，得到的重组质粒命名为pMD-18T-fliC ;其中，上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.4 ；
[0034]将SEQ ID N0.2的基因序列与基因组序列已完全测序的燕麦嗜酸菌同一亚种内菌株Acidovorax avenae subsp.avenae ATCC19860进行基因的比对分析,确定核昔酸序列为SEQ ID N0.1 的基因。
[0035]之后，在步骤(2)中，以pMD-18T_fliC为模板，上游引物的核苷酸序列为SEQ IDN0.5，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID N0.6，PCR扩增SEQ ID N0.1的基因序列，将其克隆到原核表达载体pET-28a中，得到的重组表达载体命名为pET-28a-fliC。
[0036]然后，在步骤(3)中，经IPTG诱导培养步骤(2)转化得到的大肠杆菌，得到蛋白序列为SEQ ID N0.7、大小约为5IKD的蛋白。
[0037]本发明利用燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae CGMCC N0.8661与同一亚种内菌株燕麦嗜酸菌 Acidovorax avenae subsp.avenae ATCC19860 鞭毛蛋白(GenBank 中，其 mRNA 序列 Locus:YP_004236748, CDS 序列为 1，479bp, Gene ID: 10309252，全基因序列Locus:NC_015138,基因注释为 “flagellin domain-containing protein”)基因具有较高同源性这一特点，设计简并引物，克隆得到大的基因片段，并经比对确定了一种新型水稻免疫活性物质的基因，命名为fliC，又进而得到其编码的蛋白即燕麦嗜酸菌的鞭毛蛋白FliC。实验证明，将该燕麦嗜酸菌的鞭毛蛋白原核表达并纯化浓缩后，处理水稻叶片，检测到水稻上产生了 H2O2，这表明蛋白激发了水稻内在的免疫反应。
[0038]植物的免疫反应 对阻止病原物的入侵有一定的作用。FliC具有突出的生物学功能特性，能够诱导水稻产生过敏反应(hypersensitive response, HR),即引起水稻的免疫反应。这一特性为开发一种新型的水稻免疫活性物质和广谱性植物免疫诱导制剂提供了基础，并且通过确定燕麦嗜酸菌鞭毛蛋白的活性功能域，可以制成一种植物免疫制剂，用于增强植物的抗病性。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0040]图1显示利用保守序列扩增包含fliC全长基因的SEQ ID N0.2序列的克隆。其中图1A是SEQ ID N0.2的克隆图谱；图1B是PCR扩增SEQ ID N0.2的电泳结果图，其中M为 marker(lkb ladder)(天根 code:MD113)。
[0041]图2显示fliC全长SEQ ID N0.1表达载体的构建。其中，图2A是pET_28a-fIiC表达载体的克隆图谱；图2B是PCR扩增f IiC全长序列的电泳结果图，其中M为marker (lkbladder);图2C是表达载体pET_28a-fliC双酶切验证电泳结果图，其中M为marker (lkbladder)。
[0042]图3显示FliC蛋白的原核表达情况。图3A是FliC蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，M 为蛋白 marker (94KD)(天根 code:MP102);图 3B 是 FliC 蛋白的 Western blot 验证，M 为蛋白 marker (245KD)(天根 code:MP206)。
[0043]图4显示FliC蛋白处理水稻叶片情况。PBS是溶解FliC蛋白的缓冲液。【具体实施方式】
[0044]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0045]以下各实施例中，所使用的各种试验材料、试剂、载体等，均可通过商业途径获得；所涉及的各种试验操作方法，包括RNA的提取、cDNA的制备、克隆或表达载体的构建、酶切、连接、菌株转化、筛选等等，均为本领域内常规的试验手段。
[0046]实施例1
[0047]利用同源比对的方法设计简并引物扩增燕麦嗜酸菌鞭毛基因。
[0048]1、克隆燕麦嗜酸菌 Acidovorax avenae CGMCC N0.8661 (Aaa)鞭毛蛋白基因
[0049]根据燕麦嗜酸菌亚种之间鞭毛蛋白基因的同源性，我们根据基因组全部测序的燕麦嗜酸菌其他亚种Acidovorax avenae subsp.avenae ATCC19860设计扩增Aaa鞭毛蛋白基因(fliC)全长的引物，以Aaa全基因组DNA为模板，用高保真酶扩增PCR。然后将扩增片段连接到载体pMD-18T(TaKaRa code:D101A)上(连接反应参照pMD18_T vector试剂盒说明书)，得到的重组质粒命名为pMD-18T-fliC。测序得到了大小为2，328bp的基因片段，为SEQ ID N0.2。重组质粒构建过程见图1。
[0050]引物序列:
[0051]上游引物(SEQID N0.3):5’-GCTGGGAACAAACATTACTGCC-3’ ；
[0052]下游引物(SEQID N0.4):5’-GGTTCTGCACCTGCACGTTG-3’。
[0053]2、构建FLIC表达载体
[0054]利用特异性引物扩增fliC基因，以pMD-18T-fliC为模板，引物分别加上限制性酶切位点，序列如下:
[0055]上游引物SEQ ID N0.5:
[0056]5’-CGGGATCCATGGCATCCACCATCAACAC-3’ ；
[0057]下游引物SEQ ID N0.6:
[0058]5’-CCAAGCTTTCAACGCAGCAGGGACAACA-3’ 。
[0059]测序得到了大小为1，479bp的基因片段，为SEQ ID N0.1。
[0060]分别用特定限制性酶BamH I (TaKaRa code:D1010A)和 Hind III (TaKaRacode:D1060A)酶切该基因片段和表达载体pET_28a，然后用T4连接酶(TaKaRacode:D2050)连接，构建成蛋白表达载体，命名为pET_28a_fliC (连接反应参照T4DNA连接酶说明书)。将该表达载体转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选、验证序列信息正确的阳性克隆，即为fliC表达载体。构建过程见图2。
[0061]3、FLIC蛋白表达
[0062]将重组表达质粒pET-28a_f Iic转至表达菌株BL21 (DE3)中，经终浓度为0.5mM的IPTG在10°C，转速为150rpm的条件下，诱导培养24h，得到了大小约为51kD的融合蛋白，可溶性检测发现蛋白在上清中有表达。蛋白电泳和Western Blot具体过程:将纯化的蛋白进行SDS-PAGE蛋白 电泳，通过半干式转移到PVDF膜上，加入5%的脱脂牛奶作为包被液封闭非特异性位点，在室温下平稳摇动2h，加入小鼠单克隆抗体一抗Ant1-His (1:1000)，在4°C下过夜，弃一抗加辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠二抗IgG-HRP (1:5000)(北京天根生化科技有限公司)，在室温下平稳摇动2h，弃二抗，加入Super ECL Plus超敏发光显色液，通过化学发光成像仪观察结果。结果见图3。[0063]实施例2[0064]原核表达纯化的蛋白处理水稻，检测防卫反应的发生[0065]用溶于PBS的浓度约为0.3mg/ml的纯化FliC注射2周大小的水稻叶片。24h后，剪取处理部位的叶片，用DAB (3，3’ - 二氨基联苯胺)染色处理，再用酒精脱色，之后在显微镜下拍照。从图4中可以看出，检测到水稻上产生了 H2O2，这表明蛋白能诱导水稻产生过敏性反应激发了水稻内在的免疫反应。
【权利要求】
1.一种植物免疫活性物质的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有如SEQID N0.2所示的核苷酸序列； 优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示。
3.一种用于诱导水稻防卫反应的蛋白，其特征在于，所述蛋白具有如SEQ ID N0.7所示的氨基酸序列； 优选地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
4.根据权利要求3所述的蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: (1)获取根据权利要求1或2所述的编码基因； (2)使用步骤(1)得到的编码基因构建蛋白表达载体，并将其转化大肠杆菌； (3)诱导步骤(2)得到的经转化的大肠杆菌表达所述蛋白。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括: 以燕麦嗜酸菌Acidovorax avenae CGMCC N0.8661的基因组DNA为模板,米用PCR方法扩增根据权利要求1或2所述的编码基因。
6.根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)包括: 使用限制性内切酶BamH I和Hind III分别双酶切步骤(1)得到的编码基因与载体pET-28a，之后以T4连接酶连接得到的片段，从而构建重组蛋白表达质粒，然后将其转化到感受态大肠杆囷囷株中。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)包括: 以0.5mM的IPTG诱导培养步骤(2)得到的经转化的大肠杆菌BL21，得到51kD的蛋白； 优选地，所述诱导培养的条件为10°C，转速150rpm。
8.根据权利要求1或2所述的编码基因或者根据权利要求3所述蛋白在制备植物免疫制剂中的用途。
【文档编号】A01P1/00GK103789323SQ201410010747
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】陈华民, 刘莹, 田芳, 于清, 何晨阳 申请人:中国农业科学院植物保护研究所