专利名称：一种真菌发酵产物的制备方法及在水稻病害防治中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌发酵产物的制备方法，可用于水稻病害的防治，属于生物防治领域。
背景技术：
大型真菌不但种类繁多，而且是“创造系数”很高的生物类群。大型真菌中发现的天然产物结构多样，并且具有抗细菌、促进神经生长因子合成、酶抑制剂、抗真菌、细胞毒、 受体拮抗剂和抗氧化等多种生物活性。担子菌与人类的关系极为密切。在发现了一些种对抗肿瘤和预防冠心病方面有作用之后，受到了医药界的重视并引起极大的兴趣。担子菌产生的生理活性物质有多糖类、多肽和蛋白质、抗生素类、维生素类等，其中抗生素类包含聚乙炔类化合物，如田头菇素 (Agrocybin), H0CH2 · (C = C) 3 · C0NH2,来源于 Agrocybe cylindracea,对革兰氏阳性菌、 阴性菌及真菌有拮抗作用。微生物源农药包括农用抗生素和活体微生物两大类。其中农用抗生素是由抗生菌发酵所产生的具有农药功能的次生代谢物质，它是有明确分子结构的化学物质。农用抗生素无疑是农药中的一个重要组成。由于其源于生物，故越来越受到人们关注。目前，在害虫的生物防治方面，真菌是研究、生产和应用最多的生物类群之前。真菌类生物农药主要是生真菌，目前在世界上记载的约有100属，800多种，大部分是兼性或专性病原体。真菌杀虫剂的研究在我国有较长历史，对制剂的安全性、防治松毛虫和玉米螟等研究都做了大量工作， 但工业化生产技术至今未解决，因而始终没有正式商品问世。开发具有防治水稻稻瘟病、纹枯病和细菌性条斑病等重大病害的绿色农药，对保护稻田湿地功能和减少稻田由于化学农药使用造成的面源污染具有重要意义，也可促进生态农业和绿色农业的发展。基于以上背景，开展本发明的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种真菌发酵产物的制备方法及在水稻病害防治中的应用。本发明首先提供了一种真菌发酵产物的制备方法，所述制备方法包括
1)液体培养及发酵产物处理将真菌爿#%_7知sp.YB2005活化后进行液体深层发酵，液体深层发酵的培养基配方按重量比为马铃薯16-25%，葡萄糖1.5-2. 5%，蛋白胨
O.3-0. 7%，余量为水，pH 自然，O. lMpa、12rC灭菌 30min，置于 25 — 28°C, 180 — 230r/min 恒温摇床中培养7-12天；发酵结束后，用离心法将菌丝体与发酵液分离，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；
2)产物分离将I)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，经凝胶柱层析，甲醇为洗脱剂， 洗脱液用TLC-生物自显影法测定抗菌活性物质，合并具有活性的组分，将活性组分用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用不同梯度甲醇-水洗脱，洗脱液用TLC-生物自显影法活性追踪，收集活性组分，接着上硅胶柱，用石油醚-丙酮梯度洗脱，TLC-生物自显影法收集活性组分得到具有抗菌活性的产物即为真菌发酵产物；
所述于真菌sp. YB2005已于2012年3月12日保藏于中国典型培养物保藏
中心
，保藏编号 CCTCC NO :2012076。所述液体深层发酵的培养基配方按重量比为马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨
O.5%，余量为水。所述TLC-生物自显影法中，TLC采用氯仿甲醇体积比为为10 1的展开剂；具体操作为点样后在展开剂中展开，然后将薄层板反盖在混有水稻细条病病原菌的培养平板上，20分钟后，移走薄层板，将培养平板置于28°C培养，3天后观察抑菌情况。步骤2)中所述用不同梯度甲醇-水洗脱，其中甲醇所占体积比分别为10%、20%、 30%、40%、50%。步骤2)中所述硅胶柱采用石油醚-丙酮体积比分别为7:1、6:1、5:1的梯度洗脱。本发明还提供了所述的真菌发酵产物在水稻病害防治中的应用。其中所述水稻病害为水稻稻瘟病、水稻纹枯病或水稻细条病。本发明制备的真菌发酵产物对水稻细条病、水稻纹枯病和水稻稻瘟病有较好的防治效果，可以利用本发明所述的菌株sp. YB2005发酵制得,培养基原料来源广泛, 制备方法简单，容易实现工业化生产。
图I 化合物 8_hydroxy-2，4, 6-octatriynamide 的单晶 X-Ray 衍射图。图 2 化合物 8-hydroxy-2, 4, 6-octatriynamide 的 1H-NMR 图。图 3 化合物 8-hydroxy-2, 4, 6-octatriynamide 的 13C-NMR 图。图4化合物8-hydroxy_2，4, 6-octatriynamide抗水稻稻痕病效果；其中A为叶片离体营养液添加50ug/mL 8-hydroxy-2, 4，6-octatriynamide ；B为叶片离体营养液添加 50ug/mL DMSO作为溶剂对照，C为叶片离体营养液添加纯水为对照，箭头表示水稻稻瘟病病斑。图5为化合物8-hydroxy_2，4, 6-octatriynamide对水稻细条病病原菌的抑制作用；注1 — 9分别表示化合物浓度分别为250 μ g/mL、125 μ g/mL、62. 5 μ g/mL、31. 3 μ g/mL> 15. 6 μ g/mL、7. 81 μ g/mL、3. 91 μ g/mL> I. 95 μ g/ mL和 0.98 Ug/mL, 10表不供试菌+培养基为对照，11表示等量甲醇+供试菌+培养基为对照。图6化合物8-hydroxy_2，4, 6-octatriynamide对水稻纹枯病病原菌的抑制作用；注A为对照组水稻纹枯病菌丝在不加所述化合物8-hydroxy-2, 4，6-octatriynamide 的PDA固体培养基生长；B为实验组水稻纹枯病菌丝在加所述化合物 8-hydroxy-2, 4, 6-octatriynamide的PDA固体培养基的生长受到抑制。
具体实施例方式本发明提供的真菌发酵产物的的制备方法，其步骤为
I)液体培养及发酵产物处理将真菌sp. YB2005(于2012年3月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO =2012076) 斜面菌种先接种于装有150mL马铃薯液体培养基的三角瓶中活化，活化条件为转速230 r/ min，培养温度28°C，培养时间7天，再进行大批量的液体深层发酵，采用培养基配方为每升水中含马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5 g，pH自然，O. IMpa，121°C灭菌30min，置于 25 - 28°C, 180 - 230 r/min恒温摇床中培养。发酵7_12天后，用离心法将菌丝体与发酵液分离。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，所得萃取物用无水硫酸钠脱水，再用旋转蒸发仪于40°C条件下真空浓缩，得到有机粗提物浸膏。2)化合物分离将I)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，经凝胶柱层析，凝胶采用S印hadex LH-20，用量为上样量70 — 700倍，甲醇为洗脱剂，流速大约为10-15 s/drop, 每试管收集4 一 8 mL，用TLC-生物自显影法测定抗菌活性物质(赵江林等，TLC -生物自显影-MTT法检测滇重楼内生真菌中抗菌活性成分，天然产物研究与开发，2008年01期)(具体操作为将各试管样品在GF254硅胶薄层板上点样，在氯仿甲醇为10 1的展开剂中展开，吹干溶剂后，将该薄层板反盖在混有水稻细条病原细菌培养平板上，20分钟后，移走薄层板，将培养平板置28°C培养，3天后观察抑菌情况，根据抑菌情况合并活性物质)对各收集试管进行抑制水稻细条病病原菌活性实验，合并具有活性的组分。将活性组分用适量甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析(反相硅胶用RP18，用量为上样量40 — 800倍)，用不同梯度甲醇水洗脱剂洗脱，所述甲醇水梯度为10%、20%、30%、40%、50%，用TLC-生物自显影法活性追踪，收集活性组分，接着用硅胶柱层析，用石油醚-丙酮(7:1，6:1，5:1)梯度洗脱，TLC-生物自显影法收集活性组分得到化合物，进一步纯化得到纯品。对纯品进行单晶X-Ray (单晶X射线衍射)和NMR (核磁共振)分析，并进行生物活性测试。根据X-Ray衍射数据和NMR (核磁共振)数据,对化合物进行结构鉴定,可确定化合物的结构。本发明所述的化合物为三炔类化合物8-hydroxy-2, 4, 6-octatriynamide,分子式为C8H5NO2，结构式如下
根据化合物8-hydroxy-2, 4，6-octatriynamide的生物活性测定，发现对水稻稻瘟病、细条病菌和纹枯病均有防治效果，在水稻叶片离体营养液中加入化合物 8-hydroxy-2, 4, 6-octatriynamide,在化合物浓度为50ug/mL时可抑制水稻稻痕病的发生。在96孔细胞培养板上,化合物8-hydroxy-2, 4，6-octatriynamide对水稻细条病的最小抑制浓度为7. 81 ug/mL (实施例4)。当水稻纹枯病病原菌接种于含有O. 2mg/mL所述化合物8-hydroxy-2, 4, 6-octatriynamide的PDA培养基(培养基配方马铃薯200g,葡萄糖 20g，蛋白胨5 g，琼脂10 g，水lOOOmL，pH自然)平板上，水稻纹枯病病原菌的生长完全受到抑制，对照组纹枯病病原菌菌丝直径为8. Icm时，实验组的纹枯病病原菌直径仅为O. 8cm (实施例5)。 实施例I
用马铃薯葡萄糖培养基(每升水中含马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨5 g，pH自然，
NH权利要求
1.一种真菌发酵产物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括1)液体培养及发酵产物处理将真菌爿#%_7知sp.YB2005活化后进行液体深层发酵，液体深层发酵的培养基配方按重量比为马铃薯16-25%，葡萄糖1.5-2. 5%，蛋白胨O.3-0. 7%，余量为水，pH 自然，O. lMpa、12rC灭菌 30min，置于 25 — 28°C, 180 — 230r/min 恒温摇床中培养7-12天；发酵结束后，用离心法将菌丝体与发酵液分离，发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏；2)产物分离将I)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，经凝胶柱层析，甲醇为洗脱剂， 洗脱液用TLC-生物自显影法测定抗菌活性物质，合并具有活性的组分，将活性组分用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用不同梯度甲醇-水洗脱，洗脱液用TLC-生物自显影法活性追踪，收集活性组分，接着上硅胶柱，用石油醚-丙酮梯度洗脱，TLC-生物自显影法收集活性组分得到具有抗菌活性的产物即为真菌发酵产物；所述于真菌sp. YB2005已于2012年3月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO 2012076o
2.根据权利要求I所述的真菌发酵产物的制备方法，其特征在于所述液体深层发酵的培养基配方按重量比为马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨O. 5%，余量为水。
3.根据权利要求I所述的真菌发酵产物的制备方法，其特征在于所述TLC-生物自显影法中，TLC采用氯仿甲醇体积比为为10 1的展开剂；具体操作为点样后在展开剂中展开，然后将薄层板反盖在混有水稻细条病病原菌的培养平板上，20分钟后，移走薄层板，将培养平板置于28°C培养，3天后观察抑菌情况。
4.根据权利要求I所述的真菌发酵产物的制备方法，其特征在于步骤2)中所述用不同梯度甲醇-水洗脱，其中甲醇所占体积比分别为10%、20%、30%、40%、50%。
5.根据权利要求I所述的真菌发酵产物的制备方法，其特征在于步骤2)中所述硅胶柱采用石油醚-丙酮体积比分别为7:1、6:1、5:1的梯度洗脱。
6.如权利要求1-5中任一条所述的真菌发酵产物在水稻病害防治中的应用。
7.根据权利要求6所述的真菌发酵产物的应用，其特征在于所述水稻病害为水稻稻瘟病、水稻纹枯病或水稻细条病。
全文摘要
本发明涉及一种真菌发酵产物的制备方法及在水稻病害防治中的应用真菌发酵产物的制备方法，属于生物防治领域。本发明利用真菌Agrocybesp.YB2005进行液体培养及发酵产物处理，发酵产物的分离。本发明制备的真菌发酵产物对水稻细条病、水稻纹枯病和水稻稻瘟病有较好的防治效果，可以利用本发明所述的菌株Agrocybesp.YB2005发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单，容易实现工业化生产。
文档编号A01P3/00GK102604843SQ201210095319
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者刘艳如, 张建福, 朱永生, 沈月毛, 谢华安, 郑永标, 黄建忠 申请人:福建师范大学