玉米cipk21基因在提高植物抗逆性中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的应用，所述玉米CIPK21基因的核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示。将含有玉米CIPK21基因的表达载体转入农杆菌GV3101中，然后用蘸花浸染的方法转化植物，筛选转基因植株。本发明的ZmCIPK21基因通过调控下游相关基因参与植物耐盐碱过程，对于培育高产的转基因农作物具有重要意义。
【专利说明】玉米ClPK21基因在提高植物抗逆性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中 的应用。
【背景技术】
[0002] 盐碱胁迫是影响农作物生产的重要因素。植物在含有高浓度盐离子的土壤中，通 过水分运输，会导致植物组织中离子积累。过多的可溶性离子包括钠离子、钾离子等会影响 植物正常发育。另外，高浓度的盐导致的离子胁迫还会引起渗透胁迫，进而严重影响植物产 量。植物可以通过多种方式平衡盐离子吸收，包括限制摄入、增加钠离子排泄、将盐离子区 室化到液泡，以及控制钠离子从根到地上部分的长途运输，从而减弱地上部分细胞质中钠 含量。
[0003] 研究表明，在非生物逆境胁迫信号的转导中，钙离子是最重要的第二信使之一。植 物受到干旱、冷害、盐胁迫时，胞内Ca 2+浓度会迅速升高，并能够调控许多胁迫诱导基因的 表达。因此，现在普遍认为Ca2+作为第二信使将胁迫信号传输到调控通路的下游，Ca 2+信 使的传递是通过钙结合蛋白介导的。目前，在植物中已鉴定出许多Ca2+结合蛋白（calcium sensors)。主要有三类：興调素（calmodulin, CaM)及興调素相关蛋白（CaM-related proteins) ;|丐依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPK);类似于动物?丐 调憐酸酶B亚基的蛋白（calcineurinB-likeproteins，CBLs)。Ca 2+结合蛋白-CBL，是最 近几年才发现的，目前只发现存在于高等植物中。与CaM-样，它只含有Ca2+结合域，不 含有激酶区。CBL与CaM不同的是，它调控一类特殊的蛋白激酶，称为CBL互作蛋白激酶 (CBL-interacting protein kinases, CIPKs)。CIPK 在 N 端含有丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 区，并通过其特有的C末端区域（C-terminal region)与CBL互作。CBL和CIPK只存在于 植物中，在模式植物拟南芥的研究中发现大部分CIPK基因受到非生物胁迫诱导，它们可能 在盐碱、干旱、冷胁迫中起重要作用。
[0004] 由于CIPK基因是近几年才发现的，因此对于CIPK基因的研究目前还十分有限。目 前为止，通过基因组数据的分析已经发现在拟南芥上有10个CBL基因，26个CIPK基因，在 水稻上有10个CBL基因，30个CIPK基因，但仅对个别基因的功能进行研究，对于不同CBL、 CIPK基因所调控的不同信号途径也仅限于初步了解。美国加州大学朱健康教授研究组利 用在盐胁迫下筛选拟南芥突变体的方法，鉴定了几个S0S(Salt Overly Sensitive)基因，其 中S0S2是一个CIPK基因（也称为AtCIPK24)，而S0S 3为一个CBL基因（也称为AtCBL4)。 S〇S2和sos3突变体对盐胁迫极为敏感，说明sos2和sos3基因在拟南芥对盐胁迫的抗性中 起重要作用。当植物受到高盐胁迫时，引起胞内Ca 2+浓度升高，S0S3首先感受到Ca2+所传导 的胁迫信号，然后特异性地激活S0S2, S0S2进一步作用于Na+/H+反转运子（即S0S1)，S0S1 将胞内多余的Na+转运到胞外，达到抵抗Na+对植物细胞毒害作用。这一调控通路是在目前 的抗逆研究领域中了解的比较清楚的调控途径。美国Luan Sheng教授研究组在1999年克 隆了拟南芥AtCBLl基因，并通过酵母双杂交方法，克隆了与AtCBLl互作的AtCIPKl基因。 2003年，他们对拟南芥的CIPK家族成员之一，AtCIPK3基因的功能进行了研究，发现CIPK3 基因在3-7天的幼苗期有较高表达，在成株期表达量很低。有趣的是，AtCIPK3基因在ΑΒΑ、 冷害、高盐、干旱、机械伤害等诱导下高水平的表达。但是AtCIPK3的突变体在各种逆境的 胁迫下，并没有明显的表型变化。然而，在AtCIPK3的突变体上，对许多明显受ΑΒΑ和各种 胁迫调控的基因表达的研究中却发现，一些信号调控途径已经发生改变，但是干旱诱导的 基因表达并没有受到影响，说明AtCIPK3是有选择地来调控植物在ΑΒΑ和各种胁迫下的调 控途径。对于AtCIPK3继续研究所得的另一个重要发现是，AtCIPK3可能是在各种胁迫下 依赖ΑΒΑ调控途径和不依赖ΑΒΑ调控途径调节的关键枢纽（cross-talk node)。Chikano等 (2001)研究发现另外一个拟南芥CIPK家族成员之一 AtSR2(即AtCIPK14)参与到糖的调控 途径中，AtCIPK14的突变体对葡萄糖（Glc)非常敏感，但是对各种渗透胁迫却没有任何反 应，暗示AtCIPK14可能特异性地参与糖的调控体系中。
[0005] 因此，目前对于植物CIPK基因的研究逐渐成为近年来的热点领域，目前，这方面 的研究工作主要基于模式植物拟南芥进行的。对于重要作物（如水稻、玉米、小麦等）的此 类基因的研究还较少，特别是有关玉米CIPK基因的功能研究尚未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供的玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的应 用，其中玉米CIPK21基因的核苷酸序列为 ：
[0008] i) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或
[0009] ii) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
[0010] iii)在严格条件下与Seq ID No. 1所示序列杂交的核苷酸序列；
[0011] 所述严格条件为在含0. 1%SDS的0. 1XSSPE或含0. 1%SDS的0. 1XSSC溶液中， 在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0012] 前述的应用，优选将含有玉米CIPK21基因的表达载体转入农杆菌GV3101中，然后 用蘸花浸染的方法转化植物，筛选转基因植株。所述植物包括但不限于拟南芥等。
[0013] 优选地，将玉米CIPK21基因与顺式作用元件连接，克隆至表达载体（例如，植物双 元表达载体）上，并转化植株。
[0014] 本发明中涉及的抗逆性是指对盐碱胁迫的抗性。
[0015] 本发明还提供用于扩增玉米CIPK21基因的特异性PCR引物对，包括正向引物 F5' -ATGCGGATGGGCAAGTACGAGATG-3' 和反向引物 R5' -TTAAAAGCTACTATTATATCTACC-3'。
[0016] 本发明还提供能够高效表达玉米中具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（ZmCIPK21)的 转基因植株，该植株表现为对盐胁迫的抗性。
[0017] 转基因植株的构建方法具体如下：
[0018] 1、依据目的基因的序列，设计引物，从玉米cDNA扩增ZmCIPK21基因序列，与 Gateway入门载体pGWC-T连接，对pGWC-ZmCIPK进行测序确定所获得的序列与目的片段一 致。
[0019] 2、以pGWC-ZmCIPK为入门载体，pEarlyGatelOO为表达载体，进行LR反应，然后转 化DH5 α感受态细胞，获得重组克隆，经过PCR检测后，对单克隆进行测序，对测序正确的克 隆提取质粒，将其命名为pEarlyGatel00-ZmCIPK21。
[0020] 3、将制备的载体转化农杆菌GV3101菌株。
[0021] 4、转化拟南芥，获得纯合的转化阳性苗株系。
[0022] 5、将转基因株系分别在含有0福、125禮、15〇1111似(：1的]^固体培养基上培养，获得 耐盐喊的转基因材料。
[0023] 本发明提供的玉米CIPK21基因（ZmCIPK21)，其cDNA全长为1347个碱基，含一个 完整的开放阅读框。该基因中的激酶结构域为自第311至第567bp，共256个碱基。本发明 的ZmCIPK21基因通过调控下游相关基因参与植物耐盐碱过程，对于培育高产的转基因农 作物具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1中重组表达载体PEarlyGatel00-ZmCIPK21的构建流程示 意图。
[0025] 图2为本发明实施例3中ZmCIPK21转基因拟南芥株系目的基因的PCR检测；其 中，+ :阳性对照（以ZmCIPK21重组表达载体为PCR模板）:阴性对照（以野生型拟南芥 DNA为PCR模板）；1、2、5、6、7、8、9、11、12、13、19 :ZmCIPK21不同转基因株系的扩增结果。
[0026] 图3为本发明实施例4中转基因拟南芥与野生型植株在含有不同浓度NaCl的培 养基上生长情况比较。转35S: :ZmCIPK21基因拟南芥种子点播在含有150mMNaCl的MS培 养基上，4°C春化3d后，置于22°C培养，10d后观察生长状况转基因株系在150mM NaCl的平 板上生长明显受到抑制，转基因株系0E-1、0E-5、0E-12长势明显优于WT，NaCl对幼苗根长 也有明显抑制作用。
[0027] 图4为本发明实施例5中转35S: :ZmCIPK21拟南芥能够互补拟南芥cipkl突变体 对盐敏感表型。转35S: :ZmCIPK21基因拟南芥种子点播在含有NaCl的MS培养基上，4°C春 化3d后，置于22°C培养，10d后观察生长状况转基因株系在125mM和150mM NaCl的平板上 生长明显受到抑制，互补株系（COM)长势明显优于cipkl突变体。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0029] 实施例1含有ZmCIPK21蛋白激酶基因的表达载体的构建
[0030] 1、依据已知目的基因的序列，设计引物（正向引物 F5' -ATGCGGATGGGCAAGTACGAGATG-3' 和反向引物 R5' -TTAAAAGCTACTATTATATCTACC-3'），从 玉米cDNA扩增ZmCIPK21基因序列，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段。
[0031] 2、将回收的片段与pGWC-T载体连接，然后转化DH5a感受态细胞，获得阳性单克 隆，进行测序，经过序列比对，获得与原序列一致的单克隆，摇菌并提取该单克隆质粒，将其 命名为 pGWC-ZmCIPK21。
[0032] 3、以pGWC_ZmCIPK21为入门载体，以pEarlyGatelOO质粒为表达载体，经过LR反 应，然后转化DH5 α感受态细胞，获得重组克隆，经过PCR检测后，对单克隆进行测序，对测 序正确的克隆提取质粒，将其命名为pEarlyGatel00-ZmCIPK21。
[0033] 重组表达载体PEarlyGatel00-ZmCIPK21的构建流程示意图如图1所示。
[0034] 实施例2含有ZmCIPK21蛋白激酶基因的转化及转基因植株的筛选
[0035] 1、将构建好的ZmCIPK12重组表达载体转入农杆菌GV3101。
[0036] 2、用蘸花浸染（floral dipping)的方法转化野生型拟南芥。
[0037] 3、将转化后得到的?；代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长 约两周后，用0. 5%。的PPT(phosphinothricin)喷洒L代拟南芥筛选转化植株。
[0038] 4、由于所用的转化超表达载体pEarlyGatelOO带有抗PPT (phosphinothricin)的 Bar基因，它在转化时能随目的基因一起转入植物体，所以在喷施PPT(phosphinothricin) 后大部分未转化植株死亡，而转化植株仍然能够正常生长。转化植株按照不同株系分别收 获!\代种子。
[0039] 5、收获各转基因株系T2代种子后，用0. 5%的NaCIO对种子进行消毒处理。然后 点种于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培养基平板中（每个转基因株系需要约 45粒种子），以野生型拟南芥作为阴性对照。
[0040] 6、春化3天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野 生型在含〇· 5 %。PPT (phosphinothricin)的MS培养基中无法存活；T2代杂合体转 基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合，因此会有一部分无 PPT (phosphinothricin)抗性种子出现；只有Τ2代为纯合体转基因株系的种子能全部在含 卡那霉素的MS培养基中存活。
[0041] 实施例3含有ZmCIPK21转基因植株的核酸检测
[0042] 1、以提取的阳性转化植株的总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增，阳性植株能够 扩增出1. 35kb的条带，而假阳性植株则无 PCR扩增产物。野生型植株不能扩增出目的条带。 (图2)
[0043] 2、收获各转基因株系T2代种子后，用0. 5%的NaCIO对种子进行消毒处理。然后 点种于含有0.5%。PPT (phosphinothricin)的MS培养基平板中（每个转基因株系需要约 45粒种子），以野生型拟南芥作为阴性对照。
[0044] 3、春化3天后置于22°C光照培养箱中生长，一周后观察幼苗生长情况。野生型在 含 0.5%。（v/v)PPT(phosphinothricin)的 MS 培养基中无法存活。
[0045] 4、T2代杂合体转基因株系由于在产生子代的过程中会发生基因分离与自由组合， 因此会有一部分无卡那霉素抗性的种子出现；只有1~ 2代为纯合体转基因株系的种子能全部 在含卡那霉素的MS培养基中存活。
[0046] 实施例4含有ZmCIPK21转基因植株与野生型植株抗逆性比较
[0047] 将ZmCIPK21转基因拟南芥株系分别点播在含有0mM、125mM、150mMNaCl的MS平板 上，4°C春化3天后，置于22°C，16小时光/8小时黑暗的培养箱中，5天后观察表型并进行分 析。从图3所示结果中可以看出，相对野生型而言，野生型在高盐胁迫下叶子萎蔫发黄程度 严重，而两者在正常MS培养基中表型则无明显差别。
[0048] 实施例5用ZmCIPK21转化拟南芥cipkl高盐敏感突变体可提高突变体耐盐性
[0049] 1、将构建好的ZmCIPK12重组表达载体转入农杆菌GV3101，用蘸花浸染的方法转 化拟南芥对高盐敏感的cipkl突变体。
[0050] 2、将转化后得到的?；代种子春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长 约两周后，用0. 5%。的PPT(phosphinothricin)喷洒L代拟南芥筛选转化植株。能够存活 的植株即为代植株。
[0051] 3、按照不同株系分别收获种子。用ΡΡΤ筛选，统计存活株数，取符合3:1分离的株 系，即为单拷贝的1~ 2代植株。
[0052] 4、将存活的植株移到小花盆中，每个株系移12株，继续按照单株收获得到^种 子，并在含有ΡΡΤ的MS培养基上筛选，如果能够完全存活则为纯合体株系，收获种子则为转 基因互补株系（COM)。
[0053] 将转ZmCIPK21基因互补株系及突变体株系分别点播在含有OmM、150mM NaCl的MS 平板上，4°C春化3天后，置于22°C，16小时光/8小时黑暗的培养箱中，5天后观察表型并进 行分析。从图4所示结果中可以看出，相对突变体株系而言，突变体在高盐胁迫下叶子萎蔫 表现出盐敏感性，而互补株系及过表达野生型Col株系表现出明显耐盐性。
[0054] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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[0002] 20 25 30 Ala lie Lys lie Leu Asp Arg Gin Arg lie Leu Ala Met Lys lie His 35 40 45 Asp Gin lie Lys Arg Glu lie Ala Thr Leu Lys Leu Leu Lys His Pro 50 55 60 Asn Val Val Arg Leu Tyr Glu Yal Ser Ala Ser Lys Thr Lys lie Tyr 65 70 75 80 Met Val Leu Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Asp Lys lie Ala 85 90 95 Leu Lys Gly Lys Leu Thr Glu Lys Glu Gly Arg Lys Leu Phe Gin Gin 100 105 110 Leu lie Asp Ala Val Gly Tyr Cys His Glu Lys Gly Val Tyr His Arg 115 120 125 Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Val Asp Ala Lys Gly Asn lie Lys 130 135 140 Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu Pro Gin Asn Gin Gin Lys Asp 145 150 155 160 Gly Leu Leu His Thr Thr Cys Gly Ser Pro Asn Tyr lie Ala Pro Glu 165 170 175 Val Leu Le'u Asn Lys Gly Tyr Asp Gly Ser lie Ser Asp Val Trp Ser 180 185 190 Cys Gly Val He Leu Tyr Val Met Leu Thr Gly Asn Leu Pro Phe Asp 195 200 205 Asp Gin Asn Val Val Val Leu Tyr Gin Lys lie Leu Lys Gly Asn Ala 210 215 220 His lie Pro Lys Trp Leu Ser Gin Gly Ala Gin Asp lie Leu Arg Lys 225 230 235 240 He Leu Asp Pro Asn Pro Val Thr Arg lie Asp Val Asp Gly lie Arg 245 250 255 Ala His Asp Trp Phe Lys Gin Gly Tyr Ala Pro Ala Met Pro Phe Ser 260 265 270 Asp Asp Glu Glu Asp He Ser Met Asp Glu Asp Ser Leu Asn lie Thr 275 280 285 Glu His Asn Asp lie Gin Asp Lys lie Ala lie Asn Gin lie Asn Ala 290 295 300 Phe Gin Leu lie Gly Met Ser Ser Cys Len Asp Leu Ser Gly Phe Phe 305 310 315 320 Glu i,ys Glu Asp Val Ser Glu Arg [,vs Tie Arg Phe Ala Ser Asn Tyr 325 330 335 Scr Pro Ala Tyr Leu Phe Glu Lys lie Glu Scr lie Val Arg Lys Met 34Q 345 350 Gly Phe Gin Val His Lys Ser Asn Gly Lys Leu Lys Val lie Gin Asp 355 360 365 Cys Lys Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gly Gin Glu Ser Leu Leu lie Ser
[0003] 370 375 380 Ala Glu Val Phe Glu lie Asn Glu Tyr Leu Tyr Val Val Glu Leu Lys 385 390 395 400 Lys Ser Ser Gly Asp Cys Ser Leu Tyr Arg Lys Leu Cys Glu Thr Leu 405 410 415 Ser Glu Asp Leu Gly Thr Cys Lys Ser Gin Gin Phe Leu Lys Gin Asp 420 425 430 Ser lie Arg Gin Asp lie Gly Arg Tyr Asn Ser Ser Phe 435 440 445 <210> 3 <211> 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 3 atgcggatgg gcaagtacga gatg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 4 ttaaaagcta ctattatatc tacc 24
【权利要求】
1. 玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述玉米CIPK21基因的 核苷酸序列为： i) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或 ii) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核苷酸序列；或 iii) 在严格条件下与Seq ID No. 1所示序列杂交的核苷酸序列； 所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0. 1 X SSPE或含0. 1 % SDS的0. 1 X SSC溶液中，在 65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将含有玉米CIPK21基因的表达载体转入 农杆菌GV3101中，然后用蘸花浸染的方法转化植物，筛选转基因植株。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抗逆性是指对盐碱胁迫的抗性。
4. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括但不限于拟南芥。
5. 用于扩增玉米CIPK21基因的特异性PCR引物对，其特征在于，包括正向引物 F5' -ATGCGGATGGGCAAGTACGAGATG-3' 和反向引物 R5' -TTAAAAGCTACTATTATATCTACC-3'。
【文档编号】A01H5/00GK104059929SQ201410175703
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年4月28日 优先权日:2014年4月28日
【发明者】郑军, 陈勋基, 黄全生, 王国英 申请人:中国农业科学院作物科学研究所