一种饲料添加剂产品的制作方法

一种饲料添加剂产品的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种饲料添加剂产品,属于饲料领域，其重量份数组成如下：水苏糖4-8，生姜1-4，女贞子提取物6-10，枯草芽孢杆菌菌粉15-25，植物乳杆菌菌粉10-25，灵芝菌固体发酵培养物8-15。所述饲料添加剂产品制备方法为：将上述各原料粉碎混合后通过造粒机制为颗粒，本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲养动物中的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料利用效率，增强动物的免疫力，提高饲养效益。
CGMCC NO9405
20140702
【专利说明】一种饲料添加剂产品

【技术领域】：
[0001] 本发明属于饲料领域，尤其涉及饲料添加剂。

【背景技术】：
[0002] 源自自然界的一些天然物质不仅具有良好的营养特性，同时还具有抗病毒、消炎、 抗氧化、调节机体免疫功能等作用，具有广阔的应用前景。
[0003] 生姜的主要成分是黄酮类化合物、酚类、内酯、香豆精类、醛酮，少量的铁、钙、硅、 锰、铅、镍、铝、铜、锌等微量元素及维生素 B族、维生素 A，以及多种氨基酸、酶、多糖类及丰 富的阿散酸等。生姜还是国内外专家公认的"天然抗生物质"，因为它不仅具有防御外来的 入侵者及感染病原菌扩散的作用，还具有抗病毒、消炎、抗氧化、调节机体免疫功能等作用。
[0004] 女贞子又称女贞实、冬青子、白蜡树子、鼠梓子。外果皮薄，中果皮较松软，易剥离， 内果皮木质，黄棕色，具纵棱，破开后种子通常为1粒，肾形，紫黑色，油性。无臭，味甘、微苦 涩。女贞子果实含齐墩果酸（OleanoliC acid)、甘露醇、葡萄糖、棕榈酸、硬脂酸、油酸及亚 麻酸。果皮含熊果酸（Ursolic acid)、齐墩果酸、乙酰齐墩果酸（Acetyloleanolic acid)。 种子含脂肪油14. 9%，油中棕榈酸与硬脂酸为19. 5%、油酸及亚麻酸等为80. 5%。女贞子 中尚含铜、锌、铁、猛等微量元素。
[0005] 女贞子补肝肾阴，乌须明目，现代医学研究认为女贞子可以抑制幽门螺杆菌的作 用可以治疗胃病，还具有抑制嘌呤异常代谢用于痛风和高尿酸血症的治疗。用于肝肾阴虚， 腰酸耳鸣，须发早白；眼目昏暗，视物昏暗；阴虚发热，胃病及痛风和和高尿酸血症。女贞子 是一味临床常用中草药，近几年已经开始研究其作为饲料添加剂在畜禽生产中的作用。
[0006] 灵芝[Ganoderema lucidum (Leyss ex Fr. ) karst]，又称灵芝草，属担子菌亚门、 多孔菌目、灵芝科、灵芝属。历代的医典把灵芝归位于"上上药"，其排位在人参之前。《神农 本草经》、《本草纲目》记载，灵芝可明目、补肝气、安神、益精、益心气、益脾气、益肺气、益肾 气、通九窍、耳聪、目明、利关节、利尿、养颜美容，是上好的滋补佳品。灵芝多糖能促进蛋白 质、核酸的合成，对血清、肝脏及骨髓细胞蛋白质或核酸的更新、合成有促进作用，它是灵 芝扶正固本的主要有效成分之一。灵芝多糖主要存在于灵芝真菌子实体、菌核、菌丝体或发 酵液中；存在于灵芝中的灵芝酸有止痛、镇静、抑制组织胺释放、解毒、保肝、毒杀肿瘤细胞 的功用，是灵芝的主要有效成分之一。
[0007] -种复合饲料添加剂产品，申请号为201210182772. 2,该专利公开了一种复合饲 料添加剂产品，组成如下：低聚果糖10-15%，大豆多肽10-20%，女贞子萃取物10-25%， 枯草芽孢杆菌冻干菌粉，灵芝菌固体发酵培养物；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)为 CGMCC 6012,上述比例为质量百分比；本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲养动物 中的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料利用效率，增强动物的免疫力，提 1?词养效益。
[0008] 如何有效开发以天然植物或真菌获得绿色饲料添加剂产品对饲料添加剂行业发 展具有重要意义。


【发明内容】
：
[0009] 本发明提供一种饲料添加剂产品；重量份数组成如下：
[0010] 水苏糖4-8,生姜1-4,女贞子提取物6-10,枯草芽孢杆菌菌粉15-25,植物乳杆菌 菌粉10-25,灵芝菌固体发酵培养物8-15。
[0011] 所述饲料添加剂产品制备方法为：将上述各原料粉碎混合后通过造粒机制为颗 粒。
[0012] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)为CGMCC6012。植物乳杆菌为CGMCC No.9405。
[0013] 本发明中植物乳杆菌CGMCC No. 9405菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为 短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光 滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
[0014] 理化特征为：过氧化氢酶（-)，明胶液化（-)，吲哚实验（+)，运动性（-)，发酵产气 (-)，亚硝酸盐还原（-)，发酵产气（-)，产硫化氢气体（-)，pH4. OMRS培养基中生长（+)。
[0015] 本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：
[0016] 原始出发菌种一试管活化一硫酸二乙酯（DES)诱变一亚硝基胍（NTG)诱变一等离 子体诱变一平板初筛一摇瓶复筛一传代稳定性试验。
[0017] 本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/ d，当培养基pH为3. 5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0. 34mg/h/kg白菜。出发 菌株为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。
[0018] 为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG 技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发 酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验， 评价其遗传稳定性。
[0019] 植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都 比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的 菌株。
[0020] 经验证发现：该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时 发酵后乳酸浓度达到95g/L ;能够在pH为1. 80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分 解能力达到9. 8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为I. lmg/h/kg)，能够耐 1%胆盐。
[0021] 因此采用该菌种生产泡菜，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kg以下，远低于 国家标准GB2714-2003中规定的含量（20mg/kg)。
[0022] 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) tl j-2014,该菌株已于 2014 年 7 月 2 日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：中国北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101)，保藏号为CGMCC NO. 9405。
[0023] I. DES诱变选育
[0024] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L 一环，接入装有50mL培养基MRS (无 琼脂，葡萄糖20g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对 数生长前期。
[0025] 2)取5mL菌液，5000rpm离心IOmin收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0026] 3)用pH7. 0磷酸缓冲液稀释成IO7个/mL菌悬液。
[0027] 4)取32mL pH7. 0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0. 4mL DES在预先放入转子的 150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1 % (v/v)。
[0028] 5)在 37°C摇床中 150rpm 反应 30min，取 ImL 混合液，加入 0· 5mL 25% Na2S2O3 溶 液中止反应。
[0029] 6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基（含100g/L 葡萄糖的碳酸钙MRS培养基）平皿中。在37°C培养2?3天后，采用影印法将该筛选平板 的菌株转印到PH为1. 5、1. 8和2. 0的LPHMRS培养基（低pH值改性MRS培养基）上和亚 硝酸钠筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基）上。
[0030] 7)在37°C培养2?3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛 选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆 菌L1。
[0031] 2.亚硝基胍诱变
[0032] 1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌Ll 一环，接入装有50mL培养基MRS (无 琼脂）培养基（葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养ia左右，使菌 体处于对数生长前期。
[0033] 2)取5mL菌液5000rpm离心IOmin收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
[0034] 3)用pH6. 0磷酸缓冲液稀释成IO7个/mL菌悬液。
[0035] 4)取IOmL菌悬液转移至IOOmL三角瓶中，加入IOmg的NTG，配制成终浓度为IOmg/ mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
[0036] 5)在37°C下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心IOmin收集菌体，用无菌生理 盐水洗涤数次，中止反应。
[0037] 6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基（含100g/L 葡萄糖的碳酸钙MRS培养基）平皿中。在37°C培养2?3天后，采用影印法将该筛选平板 的菌株转印到PH为1. 5、1. 8和2. 0的LPHMRS培养基（低pH值改性MRS培养基）上和亚 硝酸钠筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基）上。
[0038] 7)挑选菌株方法：挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基 上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。
[0039] 3.摇瓶复筛
[0040] 1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基 MRS (无琼脂）培养基（葡萄糖浓度为100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养15h左 右，使菌体处于对数生长中期。
[0041] 2)分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基（含250g/L葡萄糖的 碳酸钙MRS培养基）平皿中、pH为L 5、L 8和2. 0的LPHMRS液体培养基（低pH值改性MRS 培养基）和亚硝酸钠液体筛选培养基（单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基） 上（注：采用250mL三角瓶）。200rpm，37°C培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培 养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚 硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生 速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。
[0042] 3)选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH (该菌种仅能在最低为pHl. 8的培养基 中生长）和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。
[0043] 4.遗传稳定性试验
[0044] 将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵 情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正 常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum) tlj-2014。
[0045] 5. 5L发酵罐试验
[0046] 1)取斜面上的植物乳杆菌L2 -环，接入装有50mL培养基MRS (无琼脂）（葡萄糖 浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37°C培养12h左右，使菌体处于对数生 长中期。
[0047] 2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基（初始葡萄糖为150g/L)的5L发 酵罐中。接种量为10%，37°C下IOOrpm培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0.5L/ min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。这样的 产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
[0048] 3)将对数期的菌种接入装有3L pH为1. 8的LPHMRS液体培养基（初始葡萄糖为 5(^/1)的51^发酵罐中。接种量为10%，371：下100印111培养8小时，对数前期溶氧控制10% (通气0. 5L/min)，后期厌氧，整个过程用0. 5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1. 8,总 培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2. 5g/L，说明植物乳杆菌 L2能够在pHl. 8的环境中生存。
[0049] 4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基（单一氮源为2g/L亚 硝酸钠的改性MRS筛选培养基）的5L发酵罐中。接种量为10%，37°C下IOOrpm培养8小 时，对数前期溶氧控制10% (通气〇.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速 率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对 亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/ h/L〇
[0050] 5)将对数期的菌种IOmL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行 加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，L2菌对亚硝 酸钠的分解速率为9. 8mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于5mg/kg，远低于国家 标准GB2714-2003中规定的含量（20mg/kg)。
[0051] 灵芝菌固体发酵培养物制备方法如下：
[0052] 斜面菌种活化培养：将保藏的灵芝斜面菌种转接到斜面培养基上,22_28°C培养 96-120小时左右，至菌丝长满斜面即可；最佳培养温度25°C。
[0053] 1.液体一级种子培养：将上述灵芝斜面菌种挑取一块接入装有100毫升培养基 的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分，22-28°C培养 96-130小时左右；旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25°C为宜。
[0054] 2.液体二级种子培养：将一级摇瓶种子以5-20 %接种量接入装有100毫升培养基 的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，培养条件：旋转式摇床80-180转/分，22-28°C培养 96-130小时左右；合适接种量为10%，旋转式摇床150转/分为宜，培养温度以25°C为宜。
[0055] 3.固体发酵培养：将二级摇瓶种子以5-10%接种量接入装有灭菌后固体发酵培 养基的500L固体发酵罐中，培养条件：装料量50 %，培养温度20-27 °C，湿度75-90 %，通风 量0. 3-1. 0 (V/V)，培养时间15-40天。每隔3-10天开启搅拌10分钟。采用SGF固体发酵 罐。
[0056] 4.发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7 %以 下。对固体发酵物料进行粉碎。
[0057] 本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯 (粉碎后）等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉 等；需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。
[0058] 所述女贞子提取物制备方法如下：
[0059] 女贞子粉碎，过40-50目筛后，添加女贞子3-6倍重量无水乙醇浸渍提取，控制温 度为60_65°C 3-4小时，提取液浓缩、干燥得到乙醇提取物；乙醇提取后的女贞子残渣中添 加75-85°C热水，热水添加量为女贞子残渣重量的2-4倍，处理时间30-50分钟，连续提取 2-3次，将提取液真空浓缩后喷雾干燥，得到热水提取物；将上述乙醇提取物和热水提取物 合并粉碎，过60目筛，即得女贞子提取物。
[0060] 所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC6012,冻干菌粉中活菌数量为4-8X IO8 个/g。所述复合饲料添加剂由以下方法制得：
[0061] 粉碎后灵芝菌培养物、低聚果糖、生姜、女贞子提取物、植物乳杆菌和枯草芽孢杆 菌冻干菌粉按照比例粉碎混合造粒得到复合饲料添加剂。
[0062] 本发明提供一种饲料生产用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)菌种，该菌株已 经于2012年4月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址 位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，（邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 6012。
[0063] 有益效果：
[0064] 枯草芽孢杆菌：具有如下功能：1.耗氧产酸，调节肠道微生态平衡，达到预防腹 泻、下痢等疾病；2.分泌多种酶类，提高饲料消化利用率；3.产生多种营养素，参与机体新 陈代谢；4.提高动物免疫力。本发明女贞子进行粉碎破壁处理，使女贞子中功能因子实现 全价溶出和高效提取利用，分别采用有机溶剂和热水实现其中不同功效成分的有效提取， 特别是控制温度分段提取更是有效提高了女贞子提取物的提取效率和质量。水苏糖能明显 改善肠道内微生物种群比例，它是肠内双歧杆菌的活化增殖因子，可减少和抑制肠内腐败 物质的产生，抑制有害细菌的生长，调节肠道内平衡；本发明通过科学复配，将枯草芽孢杆 菌、植物乳杆菌、灵芝菌、生姜实现了有机组合，高耐酸性植物乳杆菌的添加可以有效通过 胃部，提高植物乳杆菌的效力发挥。本发明产品可以有效降低抗生素类药物在饲养动物中 的使用量，提高动物肉制品的安全性，提高动物的饲料利用效率，增强动物的免疫力，提高 饲养效益。
[0065] 具体实施方法：
[0066] 本发明中灵芝菌培养物生产过程如下：
[0067] (1)斜面菌种活化培养：
[0068] (2)液体一级种子培养：
[0069] (3)液体二级种子培养：
[0070] ⑷固体发酵培养：
[0071] (5)发酵培养结束，选择流化床等多种干燥方法，将物料干燥到水分含量在7%以 下。
[0072] 对固体发酵物料进行粉碎。
[0073] 本发明所用灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏中心，菌号CICC14080。
[0074] 本发明中斜面培养基组成可以为PDA斜面培养基或其他合适培养基。
[0075] 本发明固体发酵培养基的碳源主要选择麸皮、葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、玉米芯 (粉碎后）等常用原料，氮源可以选择花生饼粉、蛋白胨、脱脂大豆蛋白粉、豆饼粉、酵母粉 等；需要添加的无机盐有磷酸二氢钾，硫酸镁。
[0076] 本发明中液体发酵发酵培养基组成：淀粉2-3 %，蔗糖3-5 %，生姜1 %，葡萄糖 1-3%，蛋白胨0. 5%，脱脂大豆蛋白粉2-3%，磷酸二氢钾0. 13-0. 2%，硫酸镁0. 1-0. 15%， 维生素 BjPPm，PH6-7。
[0077] 本发明中灵芝培养方法适合同属其它菌种通过发酵法进行大规模发酵培养。
[0078] 菌种诱变
[0079] 采取紫外诱变方法：以CICC10023为出发菌株，制成菌悬液，涂布于培养基平皿 上，紫外照射90s后37°C培养箱中培养。
[0080] 菌种筛选
[0081] 从90s平皿上挑30个长得强壮的单菌落，接种于斜面上，37°C培养箱中，培养24 小时，0--4°C冷藏保存；以原始菌种作为对照，采用常规选育条件，羧甲基纤维素钠作为碳 源和蛋白水解圈方法筛选产纤维素酶和蛋白酶强的菌株，筛选获得产纤维素酶和蛋白酶强 的菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)Ll，此菌株产纤维素酶能力比原始菌株提高了 25%，产蛋白酶能力比原始菌株提高了 52%。将该菌种在中国普通微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No 6012。
[0082] 本产品所用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)菌种，该菌株已经于2012年4月 16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，（邮编100101)，保藏编号为CGMCC N〇6012。
[0083] 通过实验研究表明：本发明产品具有良好的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、等致 病菌的特性。采用杯碟法对灵芝饲料添加剂产品的抑菌效果进行了研究，试验采用饲料添 加剂的10倍水浸提液进行研究。实验结果见表1，结果表明本发明产品具有抑制致病菌生 长的良好特性。
[0084] 表1饲料添加剂产品的抑菌效果
[0085]

【权利要求】
1. 一种饲料添加剂产品；重量份数组成如下：水苏糖4-8,生姜1-4,女贞子提取物 6-10,枯草芽孢杆菌菌粉15-25,植物乳杆菌菌粉10-25,灵芝菌固体发酵培养物8-15。
2. 根据权利要求1所述饲料添加剂产品，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为 CGMCC6012。植物乳杆菌为 CGMCC No. 9405。
3. 根据权利要求1所述一种饲料添加剂产品，其特征在于：所述饲料添加剂产品；重量 份数组成如下： 水苏糖5,生姜2,女贞子提取物8,枯草芽孢杆菌菌粉20,植物乳杆菌菌粉15,灵芝菌固 体发酵培养物10。
4. 根据权利要求1所述一种饲料添加剂产品，其特征在于：所述饲料添加剂产品；重量 份数组成如下： 水苏糖4,生姜4,女贞子提取物6,枯草芽孢杆菌菌粉25,植物乳杆菌菌粉10,灵芝菌固 体发酵培养物15。
5. 根据权利要求1所述一种饲料添加剂产品，其特征在于：所述饲料添加剂产品；重量 份数组成如下：水苏糖8,生姜1，女贞子提取物10,枯草芽孢杆菌菌粉15,植物乳杆菌菌粉 25,灵芝菌固体发酵培养物8。
【文档编号】A23K1/16GK104366020SQ201410509070
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】李建树, 李政 申请人:天津天绿健科技有限公司