一种甜瓜的快速繁殖方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甜瓜的快速繁殖方法及应用，属于植物组织培养【技术领域】。本发明所提供的方法是将甜瓜种子经过剥壳灭菌后切成胚块，在依次经过启动培养、不定芽培养、伸长培养和生根培养后，再对所得植株进行驯化，最终获得甜瓜再生苗。本发明所提供的方法能够明显提高了甜瓜的繁殖系数、再生频率和外植体再生芽数。同时，相比于传统方法，可缩短培育周期13天。
【专利说明】-种甜瓜的快速繁殖方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种甜瓜的快速繁殖方法及应用，属于植物组织培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 甜瓜（化cumis melo L.)是葫芦科黄瓜属一年生蔓性草本植物，茎被短刚毛。卷 须不分叉，叶柄有短刚毛；叶片近圆形或肾形，长宽均8-15厘米，边缘有银齿。雌雄同株，花 弯裂片，花冠黄色，裂片卵状矩圆形，果实的形状、颜色因品种而已，有香味，果皮平滑，种子 呈白色。果实作为水果或蔬菜，瓜蒂和种子可药用，广泛栽培于温带至热带地区。
[0003] 目前，国内外对于甜瓜的快速繁殖的研究主要是通过对甜瓜组织进行离体培养， 进而获得再生植株。国内目前已经能够通过子叶、带牙茎段、真叶、胚轴和茎尖等多种外植 体诱导再生出植株。如张大力从甜瓜子叶愈伤组织诱导获得再生植株、蔡润等分别利用甜 瓜的生长点、子叶、下胚轴为外植体进行离体培养，成功得到再生植株。国外已建立的甜瓜 离体再生体系包括子叶、真叶、下胚轴和茎等。如Nie化等人W幼龄甜瓜子叶为外植体，成 功建立了 4个厚皮甜瓜基因型的再生体系。虽然，现有技术已经能够通过离体组织培养获 得再生植株，但现有方法均存在繁殖周期长、繁殖系数不高，成活率低W及成本高等问题。
【发明内容】
[0004] 为解决上述问题，本发明提供了一种甜瓜的快速繁殖方法，所采取的技术方案如 下：
[0005] 本发明的目的在于提供一种甜瓜的快速繁殖方法，该方法是将甜瓜种子经过剥壳 灭菌后切成胚块，在依次经过启动培养、不定芽培养、伸长培养和生根培养后，再对所得植 株进行驯化，最终获得甜瓜再生苗。
[0006] 所述方法的步骤如下：
[0007] 1)将甜瓜的种子剥壳，灭菌后切成胚块；
[0008] 2)将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，获得启动培养胚块；
[0009] 3)将步骤2)中所得的启动培养胚块，转移到不定芽培养基中培养，获得不定芽培 养胚块；
[0010] 4)将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，获得伸长培养胚 块；
[0011] 5)去除步骤4)所得的伸长培养胚块的不定芽，并移植到生根培养基中培养，获得 再生植株；
[0012] 6)驯化步骤5)所得的再生植株，获得甜瓜再生苗。
[0013] 其中，步骤1)所述灭菌，是用70%体积分数的酒精灭菌30s，再用0.05%质量分数 的升隶消毒；所述切成胚块，是去除胚子叶前端和胚根部分。
[0014] 步骤2)所述启动培养，启动培养基组成为；1/8MS基本培养基+BA2. Omg/ L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L藏糖，P册.8 ;培养条件为，28°C下，暗培养l-2d，然后至 人工气候箱培养，培养条件为白天27-29°C，晚上24-26°C，黑暗7-化/d，光照15-1化/d，光 照强度为1800-22(K)Lx，培养时间为lOd。
[0015] 步骤3)所述不定芽培养，不定芽培养基组成为；MS基本培养基+BA1.0mg/ L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L藏糖，抑5. 8 ;培养条件为；白天28。晚上25。黑暗 她/山光照16h/d，光照强度为20(K)Lx，培养时间为20天。
[0016] 步骤4)所述伸长培养基，组成为；MS基本培养基+BA0. 05mg/L+IAA0. lmg/L+7. 5g/ L琼脂+30g/L藏糖，p册.8 ;培养条件为，28°C下，暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条 件为白天27-29C，晚上24-26C，黑暗7-化/山光照15-1化/山光照强度为1800-2200LX，培 养时间为20天。
[0017] 步骤5)所述生根培养基，组成为；MS基本培养基+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/ L藏糖，抑5.8 ;培养条件为；28°C下，暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天 27-29C，晚上24-26C，黑暗7-化/山光照15-1化/山光照强度为1800-2200LX，培养时间为 10天。
[0018] 所述方法的具体步骤如下：
[0019] 1)将甜瓜的种子剥壳，用70%体积分数的酒精灭菌30s，再用0. 05%质量分数的 升隶消毒，再去除胚子叶前端和胚根部分，获得甜瓜胚块；
[0020] 2)将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，培养条件为，28C暗培养2d，然 后至人工气候箱培养，培养条件为白天28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光照强度为 20(K)Lx，光照条件，培养10天，获得启动培养胚块；
[0021] 所述启动培养基的组成是；1/8MS基本培养基+BA2. Omg/L+IAAO. lmg/L+7. 5g/L琼 脂+30g/L藏糖，p册.8 ;
[0022] 3)将步骤2)所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培 养，培养条件为：白天28°C，晚上25°C，黑暗她/山光照16h/d，光照强度为2000LX，培养时 间为20天，获得不定芽培养胚块；
[0023] 所述不定芽培养基组成为；MS基本培养基+BA1. Omg/L+IAAO. lmg/L+7. 5g/L琼脂 +30g/L 藏糖，p册.8 ;
[0024] 4)将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，培养条件为：白天 28°C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光照强度为20(K)Lx，培养20天，获得伸长培养胚 块；
[00巧]所述伸长培养基的组成是；MS基本培养基+BA0. 05mg/L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂 +30g/L 藏糖，p册.8 ;
[0026] 5)去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中，白天 28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光照强度为2000LX光照条件，培养10天，获得再生 植株；
[0027] 所述生根培养基，组成是；MS基本培养基+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L藏糖， 抑5. 8 ;
[0028] 6)将步骤5)中获得的再生植株进行修剪后，栽植到营养±中驯化，获得甜瓜再生 苗。
[0029] 所述方法用于甜瓜的遗传育种和快速繁殖。
[0030] 本发明有益效果：
[0031] 1，提高繁殖系数，能在短时间获得较多的组培苗。
[0032] 2,为甜瓜离体再生开辟了新的方法，大大解决甜瓜组组培苗再生率低的问题。
[0033] 3，大大缩短了甜瓜的繁殖周期。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为实施例1再生植株的培养过程；
[0035] (A，种子接种到培养基中出苗；B，C切好的子叶节接种到启动培养基中；D，30天 后产生不定芽；E，不定芽在伸长培养基上一周；F，再生植株在生根培养基上生根；G，再生 苗）。
[0036] 图2为实施例2中甜瓜种子去皮切胚。
[0037] 图3为实施例2中切好的胚块在启动培养基中培养。
[0038] 图4为实施例2中在启动培养基胚块放在不定芽培养基中培养。
[0039] 图5为实施例2中胚块在伸长培养基中培养。
[0040] 图6为实施例2中再生植株的移栽成活。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0042] W下实施例所用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中常规的 材料、试剂、仪器和方法。
[0043] 实施例1
[0044] 本实施例提供了一种传统的繁殖甜瓜的方法，步骤如下：
[0045] 1.无菌苗的培养，取上述巧粒饱满、大小均一的甜瓜种子，温汤浸种4?化，流水 冲洗，在超净工作台上先用75%酒精浸泡Imin，再用0. 1% HgCls溶液浸泡10?15min，其 间轻轻摇动，最后用无菌水冲洗5?6次，将种子平放于1/2MS培养基（每升含藏糖30g、琼 脂7肖，抑值5.8)。281：暗培养1?2(1，50%种子露白后转至光下培养：251：，光照1611/(1， 黑暗她/山光照强度为20001X，培养时间为5d。
[0046] 2.不定芽的诱导，取5d左右两片子叶脱离种皮、但未完全张开的甜瓜无菌苗，切 去生长点及下胚轴，两片子叶均切去上半部分（1/2?1/3)，留取子叶下半部分，将子节叶 接种于芽诱导培养基：M1 (MS+0. 5mg/L6-BA+0mg/LIAA)、M2(MS+0. 5mg/L6-BA+0. Img/LIAA)、 M3(MS+0. 5mg/L6-BA+0.5mg/L lAA)、M4(MS+1. 0mg/L6-BA+0mg/L lAA)、M5(MS+1. Omg/ L6-BA+0. Img/L AA)、M6 (MS+1. 0mg/L6-BA+0. 5mg/L lAA)、M7 (MS+1. 5mg/L6-BA+0mg/L IM)、 M8(MS+1. 5mg/L6-BA+0. Img/L AA)、M9(MS+1. 5mg/L6-BA+0. 5mg/L lAA)、Mil(MS+2. Omg/ L6-BA+0mg/L lAA)。MIO(MS+2. 0mg/L6-BA+0. Img/L lAA)、MIO(MS+2. 0mg/L6-BA+0. 5mg/L lAA)每个处理设3次重复，每次重复10个外植体。培养条件：温度25°C，光照16h/d，黑暗 她/山光照强度为20001X。每7?lOd继代一次，30d后统计不定芽数目，计算再生频率和 每外植体再生芽数。
[0047] 3.不定芽的伸长，W CM-15甜瓜自交系为试材，从子叶节外植体上将诱导出的 丛生芽切下，接种于伸长培养基：E0(M巧、EUMS+0. 01mg/L6-BA)、E2(MS+0. 05mg/L6-BA)、 E3 (MS+0. lmg/L6-BA)、E4 (MS+0. 15mg/L6-BA)，15d后统计芽的伸长量。每个处理设3次重 复，每次重复8个外植体。培养条件及数据处理方法同上。
[0048] 4.不定根的诱导将伸长良好、生长健壮的小苗从基部切下，转接到生根培养基 (M巧上进行生根培养，培养条件与伸长培养条件相同。
[0049] 实施例2
[0050] 本实施了提供了一种根据本发明技术方案进行甜瓜快速繁殖的方法，步骤如下：
[0051] (1)取材灭菌，将甜瓜种子剥去壳后。用70 %酒精灭菌30s，再用0.05 %升隶消 毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3-4次。每次泡1分钟。灭菌完成后，用刀片去 除胚子叶前端和胚根部分（如图2所示）。
[0052] (2)启动培养，将灭菌后切好的胚块放在启动培养基中培养。首先在28C下暗培 养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光 照强度为2000LX，光照条件，培养10天。培养基组成为1/8MS+BA2. Omg/L+IAAO. Img/L，琼 脂中（其中每升含藏糖30g、琼脂7. 5g，抑值5. 8)，培养时间为lOd(如图3所示），获得启 动培养胚块。
[0053] (3)不定芽培养，将步骤（2)所得的所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移 到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光照强 度为2000LX，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
[0054] 其中不定芽培养基组成为；MS基本培养基+BA1. Omg/L+IAAO. lmg/L+7. 5g/L琼脂 +30g/L藏糖，抑5. 8,然后转移到MS+BAl. Omg/L+IAAO. Img/L见有不定芽丛长出后，转移到 伸长培养基中MS+BA0. 05mg/L+IAA0. Img/L。图4为在启动培养基培养20天的胚块。
[0055] (4)伸长培养，将启动培养获得的胚块均匀切成四小块，转移到伸长培养基中培养 (图5)。培养条件为：白天28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光照强度为2000LX，培 养20天，获得伸长培养胚块。
[0056] (5)去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中，培养 条件为：白天28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光照强度为2000LX光照条件，培养10 天，获得再生植株；
[0057] 所述生根培养基，组成是；MS基本培养基+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L藏糖， 地5. 8。
[0058] (6)再生植株驯化，将生根的甜瓜苗取出，适当修剪，然后栽植到营养±幢石；草 炭=1:1中，注意保温保湿，2周后与实生苗长势相同（图6)。
[00则 实施例3
[0060] 本实施了提供了另外一种根据本发明技术方案进行甜瓜快速繁殖的方法，步骤如 下：
[0061] (1)取材灭菌，将甜瓜种子剥去壳后。用70 %酒精灭菌30s，再用0. 05 %升隶消 毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3-4次。每次泡1分钟。灭菌完成后，用刀片去 除胚子叶前端和胚根部分。
[0062] (2)启动培养，将灭菌后切好的胚块放在启动培养基中培养。首先在28C下暗培 养Id,然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28C，晚上25C，黑暗化/山光照15h/d，光 照强度为2200LX，光照条件，培养10天。培养基组成为1/8MS+BA2. Omg/L+IAAO. Img/L，琼 脂中（其中每升含藏糖30g、琼脂7. 5g，抑值5. 8)，培养时间为lOd，获得启动培养胚块。
[0063] (3)不定芽培养，将步骤（2)所得的所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移 到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28C，晚上25C，黑暗化/山光照15h/d，光照强 度为22(K)Lx，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
[0064] 其中不定芽培养基组成为；MS基本培养基+BA1. Omg/L+IAAO. lmg/L+7. 5g/L琼脂 +30g/L藏糖，抑5. 8,然后转移到MS+BAl. Omg/L+IAAO. Img/L见有不定芽丛长出后，转移到 伸长培养基中 MS+BA0. 05mg/L+IAA0. Img/L。
[0065] (4)伸长培养，将启动培养获得的胚块均匀切成四小块，转移到伸长培养基中培 养。培养条件为：白天28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光照强度为2000LX，培养20 天，获得伸长培养胚块。
[0066] (5)生根培养，去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养 基中，培养条件为：白天28C，晚上24C，黑暗化/山光照15h/d，光照强度为2200LX光照条 件，培养10天，获得再生植株；
[0067] 所述生根培养基，组成是；MS基本培养基+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L藏糖， 地5. 8。
[0068] (6)再生植株驯化，将生根的甜瓜苗取出，适当修剪，然后栽植到营养±幢石；草 炭=1:1中，注意保温保湿，2周后与实生苗长势相同。
[006引 实施例4
[0070] 本实施了提供了另外一种根据本发明技术方案进行甜瓜快速繁殖的方法，步骤如 下：
[0071] (1)取材灭菌，将甜瓜种子剥去壳后。用70 %酒精灭菌30s，再用0.05 %升隶消 毒10分钟，在超净工作台上用灭菌水洗3-4次。每次泡1分钟。灭菌完成后，用刀片去 除胚子叶前端和胚根部分。
[0072] (2)启动培养，将灭菌后切好的胚块放在启动培养基中培养。首先在28C下暗培 养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天28C，晚上25C，黑暗她/山光照16h/d，光 照强度为2000LX，光照条件，培养10天。培养基组成为1/8MS+BA2. Omg/L+IAAO. Img/L，琼 脂中（其中每升含藏糖30g、琼脂7. 5g，抑值5. 8)，培养时间为lOd，获得启动培养胚块。
[0073] (3)不定芽培养，将步骤（2)所得的所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移 到不定芽培养基中培养，培养条件为：白天28C，晚上25C，黑暗化/山光照17h/d，光照强 度为1800LX，培养时间为20天，获得不定芽培养胚块；
[0074] 其中不定芽培养基组成为；MS基本培养基+BA1. Omg/L+IAAO. lmg/L+7. 5g/L琼脂 +30g/L藏糖，抑5. 8,然后转移到MS+BAl. Omg/L+IAAO. Img/L见有不定芽丛长出后，转移到 伸长培养基中 MS+BA0. 05mg/L+IAA0. Img/L。
[0075] (4)伸长培养，将启动培养获得的胚块均匀切成四小块，转移到伸长培养基中培 养。培养条件为：白天28C，晚上25C，黑暗化/山光照17h/d，光照强度为1800LX，培养20 天，获得伸长培养胚块。
[0076] (5)生根培养，去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养 基中，培养条件为：白天28°C，晚上26°C，黑暗化/山光照17h/d，光照强度为1800LX光照条 件，培养10天，获得再生植株；
[0077] 所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L藏糖， 地5. 8。
[007引 做再生植株驯化，将生根的甜瓜苗取出，适当修剪，然后栽植到营养±幢石；草 炭=1:1中，注意保温保湿，2周后与实生苗长势相同。
[0079] 实施例5
[0080] 本实施例对实施例1-4所提供的方法的效果进行了测定。对甜瓜再生植株培育过 程中，繁殖系数、再生频率、外植体再生芽数及培植周期进行了测定和统计，结果见表1。
[0081] 表1实施例1-4方法培植再生植株的效果
[0082]
【权利要求】
1. 一种甜瓜的快速繁殖方法，其特征在于，是将甜瓜种子经过剥壳灭菌后切成胚块，在 依次经过启动培养、不定芽培养、伸长培养和生根培养后，再对所得植株进行驯化，最终获 得甜瓜再生苗。
2. 权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 将甜瓜的种子剥壳，灭菌后切成胚块； 2) 将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，获得启动培养胚块； 3) 将步骤2)中所得的启动培养胚块，转移到不定芽培养基中培养，获得不定芽培养胚 块； 4) 将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，获得伸长培养胚块； 5) 去除步骤4)所得的伸长培养胚块的不定芽，并移植到生根培养基中培养，获得再生 植株； 6) 驯化步骤5)所得的再生植株，获得甜瓜再生苗。
3. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述灭菌，是用体积分数70%的酒精灭 菌30s，再用质量分数0. 05%的升汞消毒；所述切成胚块，是去除胚子叶前端和胚根部分。
4. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述启动培养，启动培养基组成为：1/8MS 基本培养基 +BA2. 0mg/L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，pH5. 8 ;培养条件为， 28°C下，暗培养l-2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29°C，晚上24-26°C，黑 暗7-9h/d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200LX，培养时间为10d。
5. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述不定芽培养，不定芽培养基组成为： MS基本培养基+BA1. 0mg/L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5. 8 ;培养条件为：白 天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20天。
6. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述伸长培养，伸长培养基组成为：MS 基本培养基 +BA0. 05mg/L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖，pH5. 8 ;培养条件为：28°C 下，暗培养2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29°C，晚上24-26°C，黑暗7-9h/ d，光照15-17h/d，光照强度为1800-2200Lx，培养时间为20天。
7. 权利要求2所述方法，其特征在于，步骤5)所述生根培养，生根培养基组成为：MS 基本培养基+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5. 8 ;培养条件为：28°C下，暗培养 2d，然后至人工气候箱培养，培养条件为白天27-29 °C，晚上24-26 °C，黑暗7-9h/d，光照 15-17h/d，光照强度为1800-2200LX，培养时间为10天。
8. 权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下： 1) 将甜瓜的种子剥壳，用70%体积分数的酒精灭菌30s，再用质量分数0.05%的升汞 消毒，再去除胚子叶前端和胚根部分，获得甜瓜胚块； 2) 将步骤1)中所得胚块放到启动培养基中培养，培养条件为：28°C暗培养2d，然后 至人工气候箱培养，培养条件为白天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为 2000Lx，光照条件，培养10天，获得启动培养胚块； 所述启动培养基的组成为：1/8MS基本培养基+BA2. 0mg/L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂 +30g/L 鹿糖，pH5. 8 ; 3) 将步骤2)所得的启动培养胚块均匀切成四小块，并转移到不定芽培养基中培养，培 养条件为：白天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养时间为20 天，获得不定芽培养胚块； 所述不定芽培养基组成为：MS基本培养基+BA1. Omg/L+IAAO. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/ L 鹿糖，pH5. 8 ; 4) 将步骤3)所得的不定芽培养胚块转移到伸长培养基中培养，培养条件为：白天 28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养20天，获得伸长培养 胚块；所述伸长培养基的组成是：MS基本培养基+BA0. 05mg/L+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂 +30g/L 鹿糖，pH5. 8 ; 5) 去除步骤4)所得伸长胚块中长于3cm的不定芽并移植到生根培养基中培养，培养条 件为：白天28°C，晚上25°C，黑暗8h/d，光照16h/d，光照强度为2000Lx，培养10天，获得再 生植株； 所述生根培养基，组成是：MS基本培养基+IAA0. lmg/L+7. 5g/L琼脂+30g/L蔗糖， pH5. 8 ； 6) 将步骤5)中获得的再生植株进行修剪后，栽植到营养土中驯化，获得甜瓜再生苗。
9.权利要求1-8所述方法，其特征在于，用于甜瓜的遗传育种和快速繁殖。
【文档编号】A01H4/00GK104396743SQ201410597395
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】张慧君, 李桂萍, 李翠 申请人:淮北师范大学