针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法
【专利摘要】本发明涉及一种针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法，解决该品种优良品种基数少、繁殖速度慢，无法满足生产需求问题，该方法包括以下的步骤：1)外植体选择；2)外植体灭菌；3)接种培养；4)增殖培养；5)壮苗培养；6)瓶外生根驯化。本发明在温室内搭建拱棚，育苗盘底部给水，控温控湿进行瓶外生根驯化，建立了针叶天蓝绣球组培快繁体系。此方法使该品种繁殖系数增加迅速，一个增殖周期为28-35天，增殖系数在5.78倍，缩短培养周期25-30天且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，一年繁殖系数可达1万倍左右，本发明简便易行，操作简单，有效的缩短了培养周期，成活率高，成本低，为针叶天蓝绣球优良种苗的规模化生产提供了可靠地技术途径。
【专利说明】针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法。
技术背景
[0002]针叶天蓝绣球(Phlox subulata)为花惹科福禄考属多年生草本，其适应性强，抗寒、抗干旱、耐贫瘠，花期早、群植效果显著通过大面积种植能够形成多个观赏景区，能够改善寒冷地区早春园林花卉品种少、色彩单调的局面，由于在我国寒冷地区引进栽培针叶天蓝绣球优良品种较少，无法满足生产需求，限制了该品种在寒地的大面积推广与应用。通过植物组织培养，快速繁殖优良品种，是解决该问题行之有效的方法之一。
[0003]针叶天蓝绣球在园林应用中的主要特点是，群植效果显著，能够形成大面积的观赏景观，通过针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法，解决了该品种优良原种资源奇缺，得不到大面积生产的实际问题。
【发明内容】
[0004]本发明简便易行，操作简单，有效的缩短了培养周期，成活率高，成本低，为针叶天蓝绣球优良种苗的规模化生产提供了可靠地技术途径。为了实现上述目的，本发明的技术方案为:一种针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法，包括以下步骤:
[0005]1)外植体筛选:春季从新萌发的叶天蓝绣球的母株上剪取粗壮的健康嫩茎；
[0006]2)外植体灭菌:剪去嫩茎上针叶，先用自来水浸泡并冲洗30分钟，用洗洁剂清洗
1-2遍，再用自来水流水冲洗20-30分钟，用质量百分比浓度为75%酒精浸泡10-15秒，放入含氯质量百分比浓度为5%的次氯酸钠溶液内滴入1-2滴吐温20(TWeen20)，置于磁力搅拌器上均匀搅拌15-25分钟，在超净工作台内，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5遍，滤纸吸干水分备用；
[0007]3)接种培养:将灭好菌的嫩茎切口倾斜45度，切成2-3cm的茎段，每段带有1_2个叶芽，直立插于诱导培养基中，在22-25°C，光照14小时培养3-4周，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，Lux为:照度的国际单位，茎段潜伏芽生长出长l-2cm的新芽；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_苄胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15-20g/L，琼脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0008]4)增殖培养:切取长l-2cm的新芽，切去新长叶片，插入增殖培养基中，在22-25°C，光照14小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)的培养室内培养4_6周后，每个茎段萌发出丛生芽；分割新长出的侧芽，需大量繁殖时，此阶段可重复进行；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_苄胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15-20g/L，琼脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0009]5)壮苗培养:增殖培养中长到l-2cm长的丛生芽切割后，转入壮苗培养基中，在22-25°C，光照14小时光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小时的培养室内培养
2-3周，形成无侧芽小苗，待苗长到3-5cm时，将瓶苗移置过渡培养间。瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一至，1-2天后，去掉瓶膜1天。挑选健壮苗转入基质中进行瓶外生根驯化；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 6-10g/L，琼脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0010]6)瓶外生根驯化:按照周年计划在寒冷地区每年12月至次年4月份，挑选健壮3-5cm高的组培苗，用温水洗净培养基，浸泡在于室内温度接近的水中，在温室内搭建拱棚，拱棚底部铺设防漏塑料膜，将组培苗移栽到以草炭、珍珠岩、蛭石体积比2:2:1为基质的128穴盘内，128穴盘为:有128个孔的育苗盘，育苗盘在拱棚内底部给水，温度25-30°C，2-3周后开始生根；
[0011]基本培养基(MS)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KN03)，440mg/L 的氯化钙(CaCl2.2Η20)，370mg/L 的硫酸镁(MgS04.7Η20)，1650mg/L 的硝酸铵(ΝΗ4Ν03)，170mg/L的磷酸二氢钾(ΚΗ2Ρ04.Η20)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取 19000mgKN03、4400mgCaCl2 *2H20,3700mgMgS04.7Η20、16500mgNH4N03、1700mg KH2P04.Η20，分别溶解后混合定容至1L，每配置1L培养基取大量元素母液100ml ;微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnS04.4Η20)，6.2mg/L的硼酸(H3B03)，8.6mg/L的硫酸锌(ZnS04.7H20)，0.25mg/L 的钥酸钠(Na2Mo04.2H20)，0.025mg/L 的硫酸铜(CuS04.5H20)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl2.6H20), 0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，配置微量元素母液1L，100 倍量，分别取 2230mgMnS04.4H20、620mgH3B03，860mgZnS04.7H20, 25mgNa2Mo04.2H20,
2.5mgCuS04.5H20, 2.5mgCoCl2.6H20,83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配置1L培养基取微量元母液10ml ;铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeS04.7Η20)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H20)螯合后的溶液(EDTA_Fe)组成，配置铁盐母液1L，分别取2780mgFeS04.7H20、3730mgNa2.EDTA.2H20,分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配置1L培养基取铁盐溶液10ml ;有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸,0.5mg/L的盐酸卩比卩多醇,0.4mg/L的盐酸硫胺素,2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成,配置有机物母液1L,分别取50mg的烟酸,50mg的盐酸卩比卩多醇，40mg的盐酸硫胺素,200mg的甘氨酸，lOOOOmg的肌醇,分别溶解,混合后定容至1L,每配置1L培养基取有机物母液10ml ;棉砂糖15-20g/L，琼脂粉5g/L，pH值5.8?6。
[0012]本发明属于植物组织培养【技术领域】，涉及一种针叶天蓝绣球的组织培养繁育及瓶外生根方法，以针叶天蓝绣球当年萌发的嫩茎段为外植体，以MS为基本培养基，利用萘乙酸NAA、6-苄基腺嘌呤6-BA、吲哆叮酸等外源激素，在温室内搭建拱棚，底部给水，控温控湿进行瓶外生根驯化，建立了针叶天蓝绣球组培快繁体系。此方法使该品种繁殖系数增加迅速，一个增殖周期为28-35天，增殖系数在5.78倍，缩短培养周期25-30天且不受季节的影响，可极大提高种苗繁殖系数，一年繁殖系数可达1万倍左右，本发明简便易行，操作简单，有效的缩短了培养周期，成活率高，成本低，为针叶天蓝绣球优良种苗的规模化生产提供了可靠地技术途径。
【专利附图】
【附图说明】
:
[0013]图1为外植体芽诱导实验数据统计表
[0014]图2为侧芽分化实验统计表
[0015]图3为生根实验统计表
【具体实施方式】
[0016]本发明是一种针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法，包括以下几个步骤:
[0017]1)外植体筛选:春季从新萌发的叶天蓝绣球的母株上剪取粗壮的健康嫩茎；
[0018]2)外植体灭菌:将步骤1)剪去嫩茎上针叶，先用自来水浸泡并冲洗30分钟，用洗洁剂清洗1-2遍，再用自来水流水冲洗20-30分钟，用75%酒精浸泡10-15秒，放入含氯质量百分比浓度为5%的次氯酸钠溶液内，滴入1-2滴吐温20(TWeen20)，置于磁力搅拌器上均匀搅拌15-25分钟，消毒时要注意外植体的颜色变化，时间过长接种不易成活，过短容易发生污染，在超净工作台内，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5遍，确认消毒液冲洗干净后，滤纸吸干水分，放入培养皿中备用；
[0019]3)接种培养:将步骤2)灭好菌的嫩茎切口倾斜45度，切成2-3cm的茎段，每段带有1-2个叶芽，直立插于诱导培养基中，外植体插入培养基不易过深，在22-25°C，光照14小时光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗培养10小时培养3_4周，茎段潜伏芽生长出长l-2cm的新芽；如图1所示；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和 lmg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15_20g/L，琼脂粉 5g/L，pH5.8-6.2 ；
[0020]4)增殖培养:从步骤3)选中取长l-2cm的新芽，切去新长叶片的2/3，插入增殖培养基中，在22-25°C，光照14小时光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小时的培养室内培养4-6周后，每个茎段萌发出丛生芽；分割新长出的侧芽，需大量繁殖时，此阶段可重复进行；如图2所示；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和 lmg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 15_20g/L，琼脂粉 5g/L，pH5.8-6.2 ；
[0021]5)壮苗培养:将步骤4)增殖培养中长到l-2cm长的丛生芽切割后，转入壮苗培养基中，在22-25°C，光照14小时光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小时的培养室内培养2-3周，形成无侧芽小苗，待苗长到3-5cm时，将瓶苗移置过渡培养间。瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一至，1-2天后，去掉瓶膜1天。挑选健壮苗转入基质中进行瓶外生根驯化；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 6-10g/L，琼脂 15 ?20g/L，ρΗ5.8-6.2 ；
[0022]6)瓶外生根驯化:按照周年计划在寒冷地区每年12月至次年4月份，在步骤5)中挑选健壮3-5cm高的组培苗，用温水洗净培养基，浸泡在于室内温度接近的水中，在温室内搭建拱棚，拱棚底部铺设防漏塑料膜，将组培苗移栽到以草炭、珍珠岩、蛭石体积比2:2:1为基质的128穴盘内，128穴盘为:有128个孔的育苗盘，育苗盘底部给水，温度25_30°C，拱棚密闭，温度过高可通风降温，2-3周后开始生根，生根率100%。茎叶的驯化温度在20-25°C，3-5周，期间逐步打开、撤掉棚膜，10周后移入温度20°C的温室内，出苗前3周移入室外炼苗；如图3所示。
[0023]如图1所示，从表1可以看供试的植株外植体100个，3-4周后，其全部分化出侧芽，外植体芽诱导率达到100%。
[0024]如图2所示，从表2中可以看出，以100个侧芽为基数，通过1个月的培养，扩繁得到的组培不定芽578个，增殖倍数为5.78倍。
[0025]如图3所示，从表3可以看出，500株瓶外生根的组织培养苗经过4周驯化培养500株均正常生根，其中死亡35株，其成活率约为93%。
[0026]如图1、图2、图3所示，从表1、2、3中可知，本发明从外植体选择，外植体灭菌；接种培养；增殖培养；壮苗培养；瓶外生根驯化，建立了一整套针叶天蓝绣球组培快繁体系。分化率达到100%，月增殖系数达到5.78，生根率达到100%，成活率达到93%。
【权利要求】
1.一种针叶天蓝绣球的组织培养繁育方法，其特征是:包括以下几个步骤: . 1)外植体筛选:春季从新萌发的叶天蓝绣球的母株上剪取粗壮的健康嫩茎； . 2)外植体灭菌:剪去嫩茎上针叶，先用自来水浸泡并冲洗30分钟，用洗洁剂清洗1-2遍，再用自来水流水冲洗20-30分钟，用质量百分比浓度为75%酒精浸泡10-15秒，放入含氯质量百分比浓度为5%的次氯酸钠溶液内滴入1-2滴吐温20 (Tween20)，置于磁力搅拌器上均匀搅拌15-25分钟，在超净工作台内，倒掉消毒液，用无菌水冲洗3-5遍，滤纸吸干水分备用; . 3)接种培养:将灭好菌的嫩茎切口倾斜45度，切成2-3cm的茎段，每段带有1_2个叶芽，直立插于诱导培养基中，在22-25°C，光照14小时培养3-4周，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，Lux为:照度的国际单位，茎段潜伏芽生长出长l-2cm的新芽；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_苄胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖.15-20g/L，琼脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ； . 4)增殖培养:切取长l_2cm的新芽，切去新长叶片，插入增殖培养基中，在22-25°C，光照14小时，光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)的培养室内培养4_6周后，每个茎段萌发出丛生芽；分割新长出的侧芽，需大量繁殖时，此阶段可重复进行；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L萘乙酸(NAA)和lmg/L6_苄胺基嘌呤(6-BA)，棉砂糖15_20g/L,琼脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ； . 5)壮苗培养:增殖培养中长到l-2cm长的丛生芽切割后，转入壮苗培养基中，在.22-25°C，光照14小时光照强度为1800?2000勒克斯(Lux)，黑暗10小时的培养室内培养.2-3周，形成无侧芽小苗，待苗长到3-5cm时，将瓶苗移置过渡培养间。瓶膜稍敞开，但并不完全揭开，保持瓶内与室内环境一至，1-2天后，去掉瓶膜I天。挑选健壮苗转入基质中进行瓶外生根驯化；所述培养基构成为:基本培养基(MS)附加0.5mg/L6-苄基腺嘌呤(6-BA)，棉砂糖 6-10g/L，琼脂粉 5g/L，ρΗ5.8-6.2 ； .6)瓶外生根驯化:按照周年计划在寒冷地区每年12月至次年4月份，挑选健壮3-5cm高的组培苗，用温水洗净培养基，浸泡在于室内温度接近的水中，在温室内搭建拱棚，拱棚底部铺设防漏塑料膜，将组培苗移栽到以草炭、珍珠岩、蛭石体积比2:2:1为基质的128穴盘内，128穴盘为:有128个孔的育苗盘，育苗盘在拱棚内底部给水，温度25-30°C，2-3周后开始生根，生根率100% ； 基本培养基(MS)中所述大量元素，由质量百分比浓度，1900mg/L的硝酸钾(KNO3),.440mg/L 的氯化钙(CaCl2.2H20), 370mg/L 的硫酸镁(MgSO4.7H20)，1650mg/L 的硝酸铵(NH4NO3)，170mg/L的磷酸二氢钾(KH2PO4 -H2O)组成，配制大量元素母液1L，10倍量，分别取.19000mgKN03、4400mgCaCl2.2H20、3700mgMgS04.7H20、16500mgNH4N03、1700mg KH2PO4.H2O,分别溶解后混合定容至1L，每配置IL培养基取大量元素母液10ml ;微量元素由体积百分比浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO4.4H20),6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L的硫酸锌(ZnSO4.7H20),0.25mg/L 的钥酸钠(Na2M0O4.2H20),0.025mg/L 的硫酸铜(CuSO4.5H20)，.0.025mg/L的氯化钴(CoCl2.6H20), 0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，配置微量元素母液1L，.100 倍量，分别取 2230mgMnS04.4H20、620mgH3B03，860mgZnS04.7H20，25mgNa2Mo04.2H20,.2.5mgCuS04.5H20, 2.5mgCoCl2.6H20,83mgKI，分别溶解后混合定容至1L，每配置IL培养基取微量元母液1ml ;铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO4.7Η20)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na2.EDTA.2H20)螯合后的溶液(EDTA-Fe)组成，配置铁盐母液1L，分别取2780mgFeS04.7H20、3730mgNa2.EDTA.2H20,分别加热溶解，混合后再煮沸约20分钟，冷却后定容至1L，每配置IL培养基取铁盐溶液1ml ;有机物由质量百分比浓度为0.5mg/L的烟酸,0.5mg/L的盐酸卩比卩多醇,0.4mg/L的盐酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇组成,配置有机物母液1L,分别取50mg的烟酸,50mg的盐酸卩比B多醇，.40mg的盐酸硫胺素,200mg的甘氨酸，1000mg的肌醇,分别溶解,混合后定容至1L,每配置IL培养基取有机物母液1ml ;棉砂糖15-20g/L，琼脂粉5g/L，pH值5.8?6.2。
【文档编号】A01H4/00GK104381133SQ201410648995
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】唐焕伟, 曲彦婷, 张冬青, 张兴, 韩辉, 李黎, 陈菲, 熊燕, 张鹏远, 罗春雨, 于振良 申请人:黑龙江省科学院自然与生态研究所