本发明涉及一种转基因黑色素草莓的培育方法，属于种植技术领域。
背景技术：
随着转基因技术的成熟，推动了各个产业的发展，尤其以农业为代表。2006年,全球转基因作物种植面积以13％的速度迅猛增长，首次突破了1亿公顷，世界上大多数国家都有草莓栽培。美国草莓栽培面积2.3万公顷，产量56.7万吨，约占世界总产量的28％，平均产量24.6吨/公顷。日本栽培面积1.1万hm2，产量21.8万吨，占世界总产量的11％，平均产量19.3吨/公顷。欧洲是主要草莓产地，约占世界产量的50％；我国的大果草莓栽培始于1915年，但过去未受到重视，发展缓慢；20世纪80年代以来草莓生产有了迅速的发展，中国目前草莓生产面积约7万hm2，面积居世界第一位。本发明基于以上的背景下，提出了一种转基因黑色素草莓的培育方法。中国专利CN201310033997公开了一种无公害草莓的培育方法，中国专利CN104335891公开了一种草莓新品种培育方法。
技术实现要素：
本发明目的在于：针对传统的种植方法生长周期长、产量低、抗病虫能力低等问题，提供了一种高产量、营养价值高、抗性强的转基因黑色素草莓的培育方法。
为了达成上述目的，本发明的一种转基因黑色素草莓的培育方法， 包括以下步骤:
步骤1：培养基的制备
按各成分的重量份计，琼脂8-12、磷酸二氢钾0.6-1.0、氯化镁0.1-0.2、胶原蛋白12-16、硫酸锌0.2-0.5、氯化钠0.4-0.8；将各组分溶解、搅拌，加蒸馏水，分装、高温杀菌、备用；
步骤2：复合营养液的制备与使用
按各成分的重量份计，硫代硫酸钠3.5-5.5、硫酸镁4.0-7.5、葛根渣17.5-24.0、淀粉13.5-18、硫酸钠1.0-2.5、海波石2.5-3.5、水39-58.0，将各组分按比例加入，密封，发酵7-9天，在草莓育苗期、花蕾期、生长期，将其掺入泥土中，每天早晚各一次；
步骤3：在草莓种子上引入黑大豆色素基因
将草莓种子在阳光下晒干，使得种子的含水量为10-15％，将黑大豆中提取得到的黑色素基因注入到草莓种子中，置于上述培养基中，用2-3uw/cm2紫外光照射接种的种子35-60min后，将其放入恒温箱中，先在45℃下恒温处理20-28h，再经55℃恒温处理10-20h，取出，自然冷却到室温；将处理后的转基因草莓种子移入经灭菌处理的玻璃器皿中，日光下晒干，使种子含水量为5-10％，密封，备用；
步骤4：育苗
将转基因草莓种子与水均匀润湿，草莓种子的重量与水的重量之比为1000：5-1000：10，将湿润后的转基因种子与亚硫酸钠充分混合，上述种子与亚硫酸钠的质量之比为100：2.5-100：5；经处理后，置于玻璃器皿中，密封，10-14h后播种，育苗。
本发明提供了对上述方法进行几种进一步的优选，第一种优选的步骤为:
步骤1中：
各成分的重量份为，琼脂10、磷酸二氢钾0.8、氯化镁0.2、胶原蛋白14、硫酸锌0.4、氯化钠0.6、蒸馏水1000；
步骤2中：
各成分的重量份计，硫代硫酸钠4.5、硫酸镁5.5、葛根渣20、淀粉16、硫酸钠1.5、海波石3.0、水45.0；
步骤3中：
种子的含水量为12％，将黑大豆中提取得到的黑色素基因注入到草莓种子中，置于上述培养基中，用2-3uw/cm2紫外光照射接种的种子50min后，将其放入恒温箱中，先在45℃下恒温处理24h，再经55℃恒温处理15h，取出，自然冷却到室温；将处理后的转基因草莓种子移入经灭菌处理的玻璃器皿中，日光下晒干，使种子含水量为7.5％，密封，备用；
步骤4中：
将转基因草莓种子与水均匀润湿，草莓种子的重量与水的重量之比为1000：7.5，将湿润后的转基因种子与亚硫酸钠充分混合，上述种子与亚硫酸钠的质量之比为100：3.5；经处理后，置于玻璃器皿中，密封，12h后播种，育苗。
本发明的培育方法，第二种优选的步骤为:
步骤1中：
各成分的重量份为，琼脂12、磷酸二氢钾1.0、氯化镁0.2、胶原蛋白16、硫酸锌0.5、氯化钠0.8、蒸馏水800；
步骤2中：
各成分的重量份计，硫代硫酸钠5.5、硫酸镁7.5、葛根渣24、淀粉18、硫酸钠2.5、海波石3.5、水58.0。
本发明的培育方法，第三种优选的步骤为:
步骤1中：
各成分的重量份为，琼脂8、磷酸二氢钾0.6、氯化镁0.1、胶原蛋白12、硫酸锌0.2、氯化钠0.4、蒸馏水1200；
步骤2中：
各成分的重量份为，硫代硫酸钠3.5、硫酸镁4.0、葛根渣17.5、淀粉13.5、硫酸钠1.0、海波石2.5、水39，将各组分按比例加入，密封，发酵7-9天，在草莓育苗期、花蕾期、生长期，将其掺入泥土中，每天早晚各一次。
本发明提供了对上述任一的方法所获得转基因黑色素草莓苗的应用，具体为：
(1)选择地势较高，地面平坦，土质疏松，排灌方便的有机质丰富的壤土中种植转基因黑色素草莓苗；选地时pH值为5.5-6.5；
(2)亩施优质粗肥2500-3500重量份、尿素10-20重量份、磷酸二铵15-25重量份、硫酸钾10-20重量份；在早春生长期，追肥1-2次，开花前的3月，再追施以磷钾为主的肥料1-4次，在浇水施肥时，别把肥水溅在花果上；
(3)在气温22-28℃，地温15-20℃定植；实行单畦双行，株行距25×25厘米，亩需5000-6500株；20×20规格；并及时补苗：种后一周，已知苗是否成活，及时检查补缺；用锌硫磷或新斯的明进行土壤处理以防治地下害虫和苗期虫害；用70-80％甲基托布津可湿性粉剂600-1000倍液进行喷雾，在单株盛花期至结荚初期，每亩喷施125ppm的多效唑水溶液40-60重量份；用0.1-0.3％的磷酸二氢钾溶液进行叶面喷施，加入0.8-1.2％的尿素，以增强长势；
(4)将含黑色素的DNA直接导入即将成熟草莓植物细胞，辅之以高效率的组织培养系统，然后将这些细胞在体外培养再生出植株；后去除植物细胞壁，使之成为原生质体，在金属微粒上蘸涂了外源DNA，然后用来直接转入外源DNA注入草莓植物细胞，之后让草莓植株正常生长；
(5)等到5月中旬时，已经是草莓露地栽培成熟期，此时的草莓果实新鲜，在温度较低的早晨或傍晚进行采摘草莓，这样可以提高草莓鲜果的保鲜率和完好率。
本发明提供的又一种对上述任一的方法所获得转基因黑色素草莓苗的应用，具体为：
(1)选择地势较高，地面平坦，土质疏松，排灌方便的有机质丰富的壤土中种植；选地时pH值为6；
(2)亩施优质粗肥3000重量份、尿素15重量份、磷酸二铵20重量份、硫酸钾15重量份；在早春生长期，追肥1-2次，开花前的3月，再追施以磷钾为主的肥料1-2次，在浇水施肥时，别把肥水溅在花果 上；
(4)在气温25℃，地温17℃定植；实行单畦双行，株行距25×25厘米，亩需6000株；20×20规格；并及时补苗：种后一周，已知苗是否成活，及时检查补缺；用锌硫磷或新斯的明进行土壤处理以防治地下害虫和苗期虫害；用75％甲基托布津可湿性粉剂800倍液进行喷雾，在单株盛花期至结荚初期，每亩喷施125ppm的多效唑水溶液50重量份；用0.2％的磷酸二氢钾溶液进行叶面喷施，加入1％的尿素，以增强长势。
在本发明一个较佳实施例中，在具体应用步骤(3)中在单株盛花期至结荚初期，每亩喷施150ppm的多效唑水溶液50千克。其效果更加显著。
在本发明一个较佳实施例中，在具体应用步骤(1)中地势较高，地面平坦，土质疏松，排灌方便，光照良好的沙壤土种植，发现效果更显著。
在本发明一个较佳实施例中，在具体应用步骤(3)中每亩喷施125ppm的多效唑水溶液50千克；用0.25％的磷酸二氢钾溶液进行叶面喷施，发现效果更显著。
本发明将目的基因用基因枪法直接导入受体细胞是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，具有的有益效果为：
(1)增加产量，可缩短生长期而且还增加作物产量，使土地得到了最大限度的充分利用；
(2)改良品质，使草莓的外观、味道、口感甚至营养成分完全改变；
(3)增强抗逆性，通过基因改变，使传统草莓植株具备了抵御病虫害的能力，大大减少农药和杀虫剂的使用；
(4)生产转基因药品，植入黑色素，预防或治疗疾病。
具体实施方案
实施例1一种转基因黑色素草莓的培育方法，方法为:
(1)培养基的制备
按各成分的质量计，琼脂8-12g、磷酸二氢钾0.6-1.0g、氯化镁0.1-0.2g、胶原蛋白12-16g、硫酸锌0.2-0.5g、氯化钠0.4-0.8g；将各组分溶解、搅拌，加蒸馏水定容至1000mL，分装、高温杀菌、备用；
(2)复合营养液的制备与使用
按各成分的质量百分比计，硫代硫酸钠3.5-5.5％、硫酸镁4.0-7.5％、葛根渣17.5-24.0％、淀粉13.5-18％、硫酸钠1.0-2.5％、海波石2.5-3.5％、水39-58.0％，将各组分按比例加入，密封，发酵7-9天，在草莓育苗期、花蕾期、生长期，将其掺入泥土中，每天早晚各一次；
(3)在草莓种子上引入黑大豆色素基因
将草莓种子在阳光下晒干，使得种子的含水量为10-15％，将黑大豆中提取得到的黑色素基因注入到草莓种子中，置于上述培养基中，用2-3uw/cm2紫外光照射接种的种子35-60min后，将其放入恒温 箱中，先在45℃下恒温处理20-28h，再经55℃恒温处理10-20h，取出，自然冷却到室温；将处理后的转基因草莓种子移入经灭菌处理的玻璃器皿中，日光下晒干，使种子含水量为5-10％，密封，备用；
(4)育苗
将转基因草莓种子与水均匀润湿，草莓种子的重量与水的重量之比为1000：5-1000：10，将湿润后的转基因种子与亚硫酸钠充分混合，上述种子与亚硫酸钠的质量之比为100：2.5-100：5；经处理后，置于玻璃器皿中，密封，10-14h后播种，育苗。
该草莓外观呈黑色，颗粒大，且大小均匀；富含的维生素E、铁元素易于人体吸收，生物转化率高，对脑血栓病人有特殊疗效；草莓幼苗发芽率高达99.5％，抗病毒性、抗逆境性强，在低温-5--10℃下可保存25-30天。
实施例2
精细整地：草莓具有喜光、喜水、喜肥、怕涝的特点，选择地势较高，地面平坦，土质疏松，排灌方便的有机质丰富的壤土中种植，草莓喜中性或微酸性土壤，选地时PH值为6；
施足底肥：一般亩施优质粗肥3000千克、尿素15千克、磷酸二铵20千克、硫酸钾15千克；在早春生长期，追肥1-2次，开花前的3月，再追施以磷钾为主的肥料1-2次，在浇水施肥时，别把肥水溅在花果上；
植株种植：气温25℃，地温17℃定植；种法：单畦双行，株行距25×25厘米，亩需6000株；20×20规格；及时补苗：种后一 周，已知苗是否成活，应及时检查补缺，用锌硫磷或新施明了进行土壤处理以防治地下害虫和苗期虫害；用75％甲基托布津可湿性粉剂800倍液进行喷雾，在单株盛花期至结荚初期，每亩喷施125ppm的多效唑水溶液50千克；用0.2％的磷酸二氢钾溶液进行叶面喷施，加入1％的尿素，以增强长势；
培育方式：直接转入法，将含黑色素的DNA直接导入即将成熟草莓植物细胞，辅之以高效率的组织培养系统，然后将这些细胞在体外培养再生出植株，后去除植物细胞壁，使之成为原生质体，在金属微粒上蘸涂了外源DNA，然后用来直接转入外源DNA注入草莓植物细胞，之后让草莓植株正常生长；
及时采收：等到5月中旬时，已经是草莓露地栽培成熟期，此时的草莓果实新鲜，在温度较低的早晨或傍晚进行采摘草莓，这样可以提高草莓鲜果的保鲜率和完好率。
实施例3
与实施例2基本相同，在单株盛花期至结荚初期，每亩喷施150ppm的多效唑水溶液50千克。其效果更加显著。
实施例4
与实施例2基本相同，选择地势较高，地面平坦，土质疏松，排灌方便，光照良好的沙壤土种植，发现效果更显著。
实施例5
与实施例2基本相同，不同的是每亩喷施125ppm的多效唑水溶液50千克；用0.25％的磷酸二氢钾溶液进行叶面喷施，发现效果更 显著。
以上所述实施例仅仅是本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。