专利名称：链霉菌ht-18及其产黑色素的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离自连云港海域的链霉菌HT-18 {Streptomyces sp. HT-18) CGMCC NO. 3979 (已于2010年7月2日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 3979)；本发明还涉及该菌株与产黑色素的方法。
背景技术：
黑色素是由苯环或吲哚环通过氧化聚合形成的类多酚高分子聚合体，自然界中的黑色素基本上可分为三类，即真黑素、棕黑素和异黑素。真黑素含氮，不含硫原子，颜色为深棕色或黑色；棕黑素含氮和硫原子，颜色为略带红色的棕色或黄色；异黑素呈棕色或黑色， 不含氮，主要存在于植物中。对于黑色素的研究已有半个世纪的历史，但由于黑色素通常与蛋白质、多糖等牢固地结合在一起不易分离以及黑色素对于可见光和紫外光的吸收性质， 使黑色素的研究遇到很大困难。黑色素一般不溶于酸性溶液，微溶于水，不溶于常见的有机溶剂，但可溶于碱溶液。黑色素在紫外可见光下，随波长的增加，吸收值下降，所以黑色素能作为紫外线吸收剂， 另外还可以作为抗氧化剂、自由基清除剂、阳离子螯合剂，因此黑色素在医疗、食品和化妆品工业中有着广泛的应用。在医疗上，可以用来治疗某些与黑色素缺乏有关的神经系统疾病，如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症等。近年来发现一些可溶性黑色素在体外对艾滋病病毒有显著的抑制作用，使黑色素将来有可能成为一种新的抗艾滋病药物。在食品工业上，可将它作为酒类、饮料类、婴儿保健品及大众食品等的添加剂，特别是近年来的研究表明，黑色素具有抗氧化和防止衰老等功能，这将大大促进天然黑色素在日益受重视的保健食品工业中的应用。黑色素具有防止紫外线辐射的功能，能吸收大部分紫外线，从而保护和减轻由于日光引起的皮肤急性和慢性损伤，因此，黑色素作为防晒品被用于日用化妆品工业。目前使用的黑色素大多是非天然的黑色素，人工合成的黑色素有安全隐患，如在工业中所用的绝大多数黑色素，其结构中的特征基团为偶氮基，现已证实具这种结构的黑色素有一定的毒性，能够致癌。随着人们对自然物质的呼唤，从天然物质中提取的黑色素更加安全，使得天然黑色素具有更大的优势。天然黑色素的来源很多，可以从动植物和微生物中提取或分离。许多植物的果实或叶呈黑色，可用来提取黑色素。如程玉峰等用萃取的方法从黑芝麻中提取黑色素，大大降低了黑色素的成本，增加了黑芝麻的附加值；鲁京兰等利用混合溶剂提取玉米中的黑色素， 可使黑色素和玉米油同时提取出来，因而可提高黑玉米的使用价值。动物体内也可产生黑色素，乌骨鸡、动物毛发、乌贼和蝌蚪是研究的最多的动物黑色素材料。人体也能合成黑色素，如人体头发中的黑色素无毒无害，可以制成安全可靠的染发剂。张沙艳等从毛发中提取黑色素，并与发油混合，制成染发剂，具有亲和力强，色泽自然，无毒，不过敏等优点。能合成黑色素的微生物很多，细菌、真菌、放线菌等都有过报道。在细菌中，彭方等从土壤中初筛得到13株能分泌黑色素的菌株，进一步筛选得到一株产黑色素能力高、产黑色素快、产量大的菌株，正在进一步作开发应用方面的研究；段晓红等用固定化细胞方法固定产酪氨酸酶的细菌，以酪氨酸为底物生产黑色素获得成功。在真菌中，黑色素对真菌的生长和发育并不是必需的，但它可以中和环境压力产生的氧化性物质，保护真菌抗恶劣的环境条件，如紫外线、极端温度、水解酶类等；Selvakumar等首次从鲍鱼菇中提取黑色素，并证实鲍鱼菇合成了 DOPA型的黑色素。郑晨娜等从一株链霉菌GH-D-4发酵培养并提取黑色素，并对黑色素进行了鉴定；柯冠群在试验中发现一株88号链霉菌产黑色素快，产量高，且发酵时菌丝体微小，更适用于大规模工业生产。黑色素在医疗、食品和化妆品工业中有着广泛的应用，而且产黑色素的微生物资源丰富，生产工艺简单，便于操作，因此研究微生物发酵生产黑色素具有很大优势。但产黑色素的微生物大多是细菌和真菌，已报道的产黑色素的放线菌较少，而分离自海洋环境的链霉菌生产黑色素的研究国内还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、可以产黑色素的链霉菌 HT-18 iStreptomyces sp. HT-18)。本发明的特征包括链霉菌HT-18 (SirepiOfflJ^e1S sp. HT_18)CGMCC NO. 3979 菌株 (以下称菌株HT-18)本身，以及利用菌株HT-18产黑色素的方法。本发明所涉及的菌株是在中国黄海连云港海域的海泥中分离到的链霉菌HT-18 iStreptomyces sp. HT-18) CGMCC NO. 3979，该链霉菌 HT-18 于 2010 年 7 月 2 日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 3979 ；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明还公开了如上所述的链霉菌HT-18产黑色素的方法，其特点是将链霉菌 HT-18 iStreptomyces sp. HT-18) CGMCC NO. 3979 菌株接种于种子培养基中沘 °C、150r/ min振荡培养1天制成种子液；然后按1 %接种量接种于发酵培养基中，调节初始pH为6. 5， 装液量为90mL/250 mL，于31°C、180r/min振荡培养3天；培养后的发酵液经抽滤去除菌体， 调pH至2-3，静置过夜，5000 r/min离心20 min后的沉淀在5mol/L的HCl中浸泡4h，之后2次无水乙醇、1次丙酮依次洗涤，烘干后即得纯化的黑色素。以下对本发明进行详细的阐述。1、材料与方法。1. 1 材料。1. 1. 1 主要试剂和仪器细菌DNA提取试剂盒购自上海赛百盛生物有限公司； 凝胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司；其它试剂均为国产分析纯。日本NIKON公司的90i型全电动光学显微镜；日本JEOL公司的JSM-6390LV扫描电子显微镜；美国Bio-rad 公司的PTC200型PCR仪和Gel Doc )(R型凝胶成像仪。1.1.2 培养基
I:种子培养基(液体高氏一号)可溶性淀粉20g, KNO3 lg, K2HPO4O. 5g，NaCl 0. 5g， MgSO4O. 5g, FeSO4O. Olg,陈海水 lOOOmL，调节 ρΗ7· 2 7. 4。
: 发酵培养基(酪氨酸培养基):葡萄糖lg，蛋白胨5g，NaCl 5g, CaCl2 0. lg，L_酪
氨酸lg,陈海水IOOOmL,定容至1L，ρΗ7· 0。1.2菌株分离和筛选
样本为采自江苏省连云港市赣榆县海头镇沿岸的泥样，称取5 g泥样加入盛有45 ml 无菌海水的三角瓶中，震荡2 11，即成10-1泥样稀释液。再用无菌海水稀释到10-2、10-3、10_4， 分别吸取200 ul不同稀释倍数的稀释液涂布于海水高氏一号琼脂平板上，每稀释度重复3 次，于培养，挑取培养特征相异的单菌落反复纯化后移至斜面保存于4°C。将纯化得到的菌种编号并接种至2216E琼脂平板，挑选在菌落周围呈明显黑色的菌种完成初筛；进一步复筛，首先在种子培养基上观！振荡培养Id (150r/min)制成种子液，然后按接种量接种于基础发酵培养基中，于观！振荡培养(150r/min) 7d，发酵液离心取上清测OD4tltlnm值，比较产黑色素的能力(在一定范围内，OD4tltlnm值与溶液中黑色素含量成正比)，获得产黑色素能力最强的链霉菌HT-18菌株。1.3黑色素的分离纯化
将链霉菌HT-18 iStreptomyces sp. HT_18)CGMCC NO. 3979菌株接种于种子培养基中 28 °C、150r/min振荡培养1天制成种子液；然后按1 %接种量接种于发酵培养基中，调节初始pH为6. 5，装液量为90mL/250 mL,于31°C、180r/min振荡培养3天；培养后的发酵液经抽滤去除菌体，调PH至2-3，静置过夜，5000 r/min离心20 min后的沉淀在5mol/L的HCl 中浸泡4h，之后2次无水乙醇、1次丙酮依次洗涤，烘干后即得纯化的黑色素样品。黑色素的理化性质研究 1.4. 1 溶解性
将分离到的黑色素样品，分别取少量加入H20、HC1、NaOH、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、二甲基亚砜等溶液中，充分振荡，观察溶解性。1.4.2紫外-可见吸收光谱
取发酵液，以空白酪氨酸培养基作为对照，在300-800nm进行紫外-可见吸收光谱分析。1.4.3 红外吸收光谱
将得到的物质充分干燥，按1 :100比例加入KBr，干燥并混勻。在压缩机上压片，然后转入红外光谱仪，在^OO-SOOcnf1进行红外扫描。1.5 菌株HT-18的鉴定
1.5.1形态学观察①采用插片法将菌株HT-18划线接种在高氏一号培养基上，同时将灭菌的盖玻片(1cm Xlcm)斜插入培养基内，28 °C培养7d后，取出盖玻片在光学显微镜下观察菌丝形状②取在高氏一号平板上培养7d的菌株进行扫描电镜样品加工处理。 样品用3%戊二醛固定4h，0. IM磷酸缓冲液漂洗。后经酒精梯度脱水、乙酸异戊脂置换、C02 临界点干燥、粘样、镀膜后在扫描电镜下观察菌丝和孢子形态。1. 5. 2培养特征和生理生化特征参照《链霉菌鉴定手册》中推荐的部分培养基 (表1)和方法进行，28 °C培养12 15d后观察记录特征。1.5.3 分子鉴定试剂盒法提取菌株HT-18基因组DNA，采用通用引物(P1: 5，-AGAGTTTGATCATGGC-3，，P2 :5，-TACCTTGTTACGACTT-3，)进行 16S rDNA 的 PCR 扩增，PCR扩增产物用凝胶回收试剂盒进行回收、测序，将所得序列与GenBank数据库中序列进行 BLAST分析比对，并选取相似性较高的菌株与菌株HT-18用Clustal X(1.83)软件进行多重序列匹配排列(Multiple alignments)分析，用MEGA4软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树。2结果与分析。2.1黑色素的理化性质。2. 1. 1 溶解性。本实验得到的黑色素样品溶于碱性溶液和二甲基亚砜，微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等有机溶剂，与国内外文献报道的一致。2. 1. 2紫外-可见吸收光谱。由图1可知菌株HT-18产生的黑色素样品在紫外及可见光区，光吸收值随波长的增大而减小，没有特征吸收峰，与报道的标准黑色素的图谱一致。2. 1. 3红外吸收光谱。黑色素样品红外光谱图是一系列宽而强的吸收峰，每一宽峰都是由多种官能团振动形成的。从红外光谱图可以看出，样品在3380CHT1附近都存在较强的共振吸收，是由-OH、-NH2的伸展振动产生的1657(3!^1附近较强的吸收峰说明分子中存在羰基结构，与 3380CHT1处的强吸收峰一起指示-COOH结构的存在；1439cm—1左右的弱吸收峰则是由于芳环骨架振动所产生的吸收峰，以上特征与文献报道的标准黑色素的特征吸收峰一致。2.2 菌株HT-18的鉴定。2.2.1 形态学观察。通过光学显微镜观察发现(见图2)，菌株HT-18的基内菌丝未见横隔膜，气生菌丝繁茂多分枝，常在气丝上形成长孢子丝，孢子丝呈松散的螺旋形，孢子卵圆形，表面光滑 (见图3)。2.2.2培养特征和生理生化特征。表1为菌株HT-18在不同培养基上培养结果，其中在高氏一号培养基上气生菌丝白色，日久成灰绿色，基内菌丝灰色，无可溶性色素产生。生理生化测定结果表明，菌株HT-18能产生硫化氢，能使淀粉水解，不能使明胶液化，牛奶凝固，也不能在纤维素上生长。对碳源的利用结果表明，菌株HT-18可以利用葡萄糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖、甘露醇、L-半乳糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖。结果见图11。2. 2. 3 16S rRNA 序列分析。HT-18菌株的16S rRNA序列PCR扩增得到了一条约1500 bp大小的条带，将测序所得到的1403bpDNA序列与NCBI数据库Blast 比对，登录号为HM348894。与其同源性较高的菌株均属于链霉菌属，选取14株相关菌株进行系统发育分析，用MEGA4软件中的 Neighbor-Joining法构建系统发育树(见图4)，可以看出，菌株HT-18与Sti^ptomyces misionensis (FJ792563)聚于同一分支中，其相似性达到99. 3%。
2.3黑色素发酵条件优化。2. 3. 1培养基的筛选。种子液按的量分别加入到高氏I号液体合成培养基、克氏I号液体合成培养基、蔗糖察氏培养基、葡萄糖天门冬素培养基、2216E和酪氨酸培养基中，装液量150πι ν250mL，pH7.0J8°C，150r/min条件下培养7 d，离心取上清测OD4tltlnm值，结果见图5。从6种培养基的效果看，酪氨酸培养基是最优培养基。2.3.2初始pH对产黑色素的影响。发酵培养基的pH值，对微生物生长具有非常明显的影响，也是影响发酵过程中各种酶活性的重要因素。由于PH不当，可能严重影响菌体的生长和产物的合成，特别是对产物稳定性的影响，因此对微生物发酵来说PH十分重要。将优化得到的酪氨酸培养基初始pH 分别调至pH5. 0、pH5. 5、pH6. 0、pH6. 5、pH7. 0、pH7. 5、pH8. 0、pH8. 5、pH9. 0，装液量 150mL/250 mL，的接种量加种子液，在^°C，150r/min条件下培养7d后，离心取上清，测OD4citlnm值。 结果显示(见图6)，在pH6. 5时黑色素产量达到最高点，因此，最适初始pH值为6. 5。分析出现双峰的原因可能是合成黑色素的最适PH为8. 5，而适合菌株HT-18生长的pH为6. 5。2.3.3装液量对产黑色素的影响。在发酵过程中，溶氧的大小对菌体生长和产物的性质及产量都会产生不同的影响，该菌株是好氧菌，氧的供给就更为重要，溶氧不足会影响菌体生长，溶氧太大有时会抑制产物的形成，因此，需要寻找临界氧浓度。本试验采用250mL的三角瓶分别装入30mL、 50mL、70mL、90mL、110mL、130mL发酵培养基，调节初始pH为6. 5，1 %的接种量加种子液，在 ^°C，150r/min条件下培养7d后，离心取上清，测OD4tltlnm值。结果显示(见图7)，随着摇瓶装液量的改变，产黑色素量不同，其中250mL的三角瓶装入90mL最有利于黑色素的合成。2.3.4温度对产黑色素的影响。发酵的温度会直接影响菌体酶的活性，温度太高或太低不利于胞外产物的释放。 因此，需要寻找最适的产黑色素温度。调节培养基初始PH为6.5，装液量150!1117250 mL， 1 %的接种量加种子液，150 r/min条件下，分别放入25°C、28°C、31°C、34°C、37°C、40°C中培养7d后，离心取上清，测OD4tltlnm值。结果显示(见图8)，温度明显影响黑色素的产出，31°C 时，黑色素产量最大。因此，31°C是本试验发酵产黑色素的最适温度。2.3.5转速对产黑色素的影响。转速有利于溶氧，也可以使菌体不粘附于瓶壁上，转速的影响直接关系到发酵产物的产量。调节培养基初始PH为6.5，装液量150!1117250 mL，31°C，1 %的接种量加种子液，分别在转速为 90r/min、120r/min、150r/min、180r/min、210r/min 下培养 7d 后，离心取上清，测OD4tltlnm值。结果显示(见图9)，转速为180r/min时，产黑色素的浓度最大。因此， 180r/min是本试验发酵产黑色素的最佳转速。2.3.6发酵时间对产黑色素的影响。配制酪氨酸培养基，调节pH6. 5，装液量90mL/250mL，1 %的接种量加种子液，在 31°C、转速180r/min下培养。每天取样，离心取上清，测OD4tltlnm值。结果显示(见图10)， HT-18菌株在培养基中培养Id时，黑色素就开始迅速产生，在第3d时，黑色素的产量达到较高值，其后的变化不大，基本处于平台期。从经济的角度考虑采用3d为最佳培养时间。本发明是一株分离自海洋的产黑色素菌株HT-18，对该菌株进行鉴定并对其发酵条件进行优化，可以发酵生产黑色素；其生产工艺简单，操作方便。所产的黑色素可以广泛地应用在医疗、食品和化妆品工业中。
图1为本发明方法所产黑色素的紫外-可见吸收光谱图。图2为菌株HT-18孢子丝的油镜图(1000X)。图3为菌株HT-18孢子的电镜图(5000X )。图4为菌株HT-18与相关菌株的系统发育树图。图5为培养基的选择图。图6为初始pH值对产黑色素的影响图。图7为装液量对产黑色素的影响图。图8为温度对产黑色素的影响图。图9为转速对产黑色素的影响图。图10为黑色素的产出时间图。图11为菌株HT-18的培养特征图。本发明中所涉及的链霉菌HT-18 iStreptomyces sp. HT_18)CGMCC NO. 3979 己于 2010年7月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 3979 ；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施例方式以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1。一种链霉菌 HT-18 (SirepiOfflj^e1S sp. HT_18)CGMCC NO. 3979。将链霉菌HT-18 iStreptomyces sp. HT-18) CGMCC NO. 3979菌株接种于种子培养基中沘"C、 150r/min振荡培养1天制成种子液；然后按1 %接种量接种于发酵培养基中，调节初始pH 为6. 5，装液量为90mL/250 mL，于31 °C、180r/min振荡培养3天；培养后的发酵液经抽滤去除菌体，调PH至2-3，静置过夜，5000 r/min离心20 min后的沉淀在5mol/L的HCl中浸泡 4h，之后2次无水乙醇、1次丙酮依次洗涤，烘干后即得纯化的黑色素。
权利要求
1.一种链霉菌 HT-18 (SirepiOfflJ^e1S sp. HT-18) CGMCC NO. 3979。
2.一种如权利要求1所述的链霉菌HT-18产黑色素的方法，其特征在于将链霉菌 HT-18 iStreptomyces sp. HT_18)CGMCC NO. 3979 菌株接种于种子培养基中沘 °C、150r/ min振荡培养1天制成种子液；然后按1 %接种量接种于发酵培养基中，调节初始pH为6. 5， 装液量为90mL/250 mL，于31°C、180r/min振荡培养3天；培养后的发酵液经抽滤去除菌体， 调pH至2-3，静置过夜，5000 r/min离心20 min后的沉淀在5mol/L的HCl中浸泡4h，之后2次无水乙醇、1次丙酮依次洗涤，烘干后即得纯化的黑色素。
全文摘要
本发明是一种链霉菌HT-18(Streptomyces sp.HT-18)CGMCC No.3979。将菌株HT-18接种于种子培养基中28℃、150r/min振荡培养1天制成种子液；然后按1％接种量接种于发酵培养基中，调节初始pH为6.5，装液量为90mL/250mL，于31℃、180r/min振荡培养3天；培养后的发酵液经抽滤去除菌体，调pH至2-3，静置过夜，5000r/min离心20min后的沉淀在5mol/L的HCl中浸泡4h，之后2次无水乙醇、1次丙酮依次洗涤，烘干后即得纯化的黑色素。是一株分离自海洋的产黑色素菌株HT-18，它可以发酵生产黑色素；其生产工艺简单，操作方便，所产的黑色素可以广泛地应用在医疗、食品和化妆品工业中。
文档编号C12N1/20GK102277311SQ20101051301
公开日2011年12月14日 申请日期2010年10月20日 优先权日2010年10月20日
发明者吴少杰, 徐静, 秦蕾, 阎斌伦, 高焕 申请人:淮海工学院