野菊多糖促进白术中白术内酯类成分合成的新用途的制作方法

本发明涉及野菊多糖促进白术生长期增加白术内酯含量的积累，属于农业生物技术领域。

背景技术：

白术为菊科苍术属Atractylodes多年生草本植物白术A.macrocephala的干燥根茎，主要产于浙江、安徽、湖南、江西等地，其中浙江白术品质上佳，白术内酯类成分为白术主要的药效学成分，对人类胃癌、肠道疾病有明显防控功效。次生代谢物的低产现象是制约天然产物规模化应用的核心问题之一。虽然国内外研究者针对次生代谢物低产问题进行了研究，包括优良株系选育，培养技术改造、目标组分合成关键酶的合成等，其关键是寻找有效诱导子促进代谢物的生物合成。

野菊多糖是野菊(Chrysanthemum indicum L)主要的活性成分之一，其由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6种单糖组成，具有提高免疫力、降血脂、抗氧化及诱导抗性(专利号：)等功效。但其与次生代谢物的关系还未见研究报道，研究发现野菊多糖可以促进白术植物中白术内酯类成分的代谢累积，提高白术药效成分，增加质量。本发明的野菊多糖用于诱导白术内酯倍量增加之用途属于首次发现。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高白术内酯成分积累的新型诱导子，特别是一种野菊多糖促进剂及其制备方法。从而使白术具有高含量的白术内酯含量、且非浙江地区种植的白术同样具有高含量的道地成分，进而提高白术的经济效益和市场价值。

本发明的白术内酯促进剂的制备方法包括以下几个步骤：

(1)野菊多糖的制备：a、采集野菊并在60℃-70℃烘箱中烘干，粉碎，过80-100目筛；

b、在上述野菊粉末中分别加入野菊粉末质量15-20倍的体积量的纯水，煎煮2-3次，每次2-3小时，取汁去渣，合并滤液，过滤，得野菊水提物溶液；

c、减压低温浓缩野菊水提物溶液至比重为1.1-1.31；

d、浓缩液加1％活性炭脱色2-3次，抽滤，得到脱色后的浓缩液；

e、在浓缩脱色后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液体积6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃静置过夜；

f、待沉淀析出后，以3000-4500rpm离心上述混合液10-15min，取沉淀，使用冷冻干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

g、在野菊粗多糖中加入粗多糖质量75-80倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸：正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20-25min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重复上述g步骤多次，除去糖蛋白，得纯野菊多糖。

野菊多糖也可以通过市场途径购买得到，纯度可以是10％-99％，可据实际情况配制成适用浓度。

以上野菊多糖辅以常用的药用赋形剂，制成水剂、粉剂等剂型，喷施与农作物植株上，用于提高白术中白术内酯II和白术内酯III的含量，提高白术的质量。

上述野菊多糖作为诱导子提高白术药效成分含量的用途，其特征在于，辅以常用的药用赋形剂，可制成水剂、粉剂、颗粒剂等剂型，该促进剂施用浓度为1-200g/L，优选浓度为1-20g/L。

上述野菊多糖作作为诱导子提高白术药效成分含量的用途，其特征在于，通过浸种、灌根和喷施处理，野菊多糖对幼苗苗期的白术促进其内酯类成分的累积形成。

上述野菊多糖作为抗病诱导子在农业上的应用，其特征在于，该野菊多糖可以从菊科植物野菊(Chrysanthemum indicum)包括野菊(Chrysanthemum indicum L)、北野菊(C.boreale Mak.)或岩香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)等的全草包括根茎和花中提取得到。

本发明的有益效果是：本发明选择白术样品植物，分别考察野菊多糖对白术中白术内酯积累的促进作用。结果显示：野菊多糖生物制剂能有效地诱导白术生长期内白术药效学物质-白术内酯类成分的累积，提高了白术道地性质量，为白术的优质优产提出了有效手段，显示出良好的市场前景。本发明开辟了野菊多糖作为诱导子促进白术种植中品质的提高的新用途，并且成本低廉、使用方便、效果明显，在中药农业上具有很好的开发利用价值，应用空间广阔。

附图说明

图1：白术中自术内酯I(atractylenolide-I)和白术内酯III(atractylenolide-III)，白术内酯II(atractylenolide-II)的HPLC图谱；其中a和b为对照组CK；c和d为施用野菊多糖组

以下实验例用于进一步说明本发明

实验例1野菊多糖促进白术中白术内酯类成分累积的效应

本实验以白术为对象，研究野菊多糖对白术内酯的影响。

1.1野菊多糖的提取

(1)采集野菊花蕾野菊(Chrysanthemum indicum L.)并在烘箱中烘干，粉碎，过80-100目筛，称取500g备用；

(2)在上述野菊粉末中分别加入野菊粉末质量6-8倍的体积量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小时，取出，过滤，滤渣水浴加热挥干剩余石油醚，得到脱色后的野菊粉末；

(3)在脱色后的野菊粉末中分别加入野菊粉末质量18-20倍的体积量的纯水，煎煮2-3次，每次2-3小时，取汁去渣，合并滤液，过滤，得野菊水提物溶液；

(4)减压低温浓缩野菊水提物溶液至比重为1.15-1.25：

(5)在浓缩后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液体积6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃静置过夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm离心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷冻干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖质量75-80倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸：正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20-25min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重复上述(7)步骤8-9次，除去糖蛋白，得纯野菊多糖13.56g，硫酸-苯酚法测定纯度为99％。

(8)野菊多糖水溶液的配制：取上述野菊多糖适量，分别配制成10mg/ml、2mg/ml和0.4mg/ml的水溶液，密封贮藏，备用。

1.2野菊多糖对白术内酯含量的影响

(1)田间试验设计

试验共设7个处理：分别配制成10mg/ml的多糖药剂(ETH)、2mg/ml的多糖药剂(ETM)和0.4mg/ml的多糖药剂(ETL)的水溶液，分别采用叶面喷施(ETH叶、ETM叶、ETL叶)和灌根(ETH根、ETM根、ETL根)两种方法；清水空白对照组(CK)。每处理重复3次。

(2)实验样品采集

试验田位于浙江农林大学德清试验基地和浙江农林大学平山试验基地，试验时间2013年12月至2014年11月。2012年12月将浸种处理的白术种子播种在试验田，试验期间人工除草、人工摘蕾，不使用其他任何除草剂、灭菌剂。2014年5月开始，每隔10天喷药一次，共喷3次，同时有无菌水为对照。在白术采集期2014年10月分别采集实验基地的样品，每处理随机采集5株，洗挣后50℃下烘干，保存于冰箱备用。

(3)样品中自术内酯类成分的测定

i色谱条件

色谱柱：Sun Fire C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相甲醇(A)和水(B)，梯度洗脱程序为0-14min，73％-89％A；14-15min，89％-95％A；15-22min，95％-100％A；22-26min，100％A。体积流量1mL/min，进样量20μL，柱温30℃，白术内酯I、III的检测波长为220nm，白术内酯II检测波长为276nm。

白术样品和标准品的测定即按此程序进行。

ii白术供试品溶液的制备

将上述备用白术样品切片粉碎过200目筛制成白术粉末，精密称取0.5g置于10ml容量瓶中，加8ml甲醇超声提取30分钟，静止后用甲醇定容至10ml，摇匀，过有机微孔滤膜(0.45μm)得供试品溶液。

(4)数据处理与分析

利用SPSS13.0软件对数据进行分析。

(5)结果与分析

如图1显示野菊多糖水溶液施用后与对照组比较白术中白术内酯I、II、III含量显著提高。表1.显示平山、德清试验田喷施野菊多糖的处理组的白术内酯含量均高于对照组。其中ETH叶、ETH根和ETL根组达到显著差异水平。采用灌根处理和叶面喷施的高剂量组药效最好。

表1.野菊多糖对白术中内酯类成分的影响

注：所有数据为3次重复的平均数±标准误，同列数据后不同小写字母表示P＝0.05水平上差异显著，不同大写字母表示P＝0.01水平上差异极显著

下述实施例均能实现以上实验例的效果

具体实施方式

实施例1：野菊多糖的提取方法

(1)采集北野菊(C.boreale Mak.)花并在烘箱中烘干，粉碎，过100目筛，称取1kg备用；

(2)在上述野菊粉末中分别加入野菊粉末质量6-8倍的体积量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小时，取出，过滤，滤渣水浴加热挥干剩余石油醚，得到脱色后的野菊粉末；

(3)在脱色后的野菊粉末中分别加入野菊粉末质量18-20倍的体积量的纯水，煎煮2-3次，每次2-3小时，取汁去渣，合并滤液，过滤，得野菊水提物溶液；

(4)减压低温浓缩野菊水提物溶液至比重为1.15-1.25；

(5)在浓缩后的野菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液体积6-8倍的90％-95％的乙醇，4℃静置过夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm离心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷冻干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖质量75倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸：正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重复上述(7)步骤8次，除糖蛋白，得纯野菊多糖26.76g，经采用硫酸-苯酚法测定野菊多糖的纯度为98％，备用。

实施例2：水剂的制备

取实施例1中提取得到的野菊多糖，加入适量水配制成含野菊多糖100g/L的水溶液，摇匀，密封储藏。在白术生长的苗期喷施与叶面上，结果与对照组比较，能显著提高白术内酯含量。

实施例3：粉剂的应用

按实施例1法制备得到野菊多糖(纯度为98％)，干燥，加工成细粉，密封储藏。临用时，配制成含野菊多糖50g/L的水溶液，喷施于白术叶面上，结果与对照组比较，能显著提高白术内酯类成分的含量。

实施例4：水剂的应用

重复实施例1的步骤(1)-(6)得到野菊粗多糖，在野菊粗多糖中加入粗多糖质量80倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸：正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡25min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重复操作4遍，除糖蛋白，得野菊多糖38g，经采用硫酸-苯酚法测定野菊多糖的纯度为50％。加蒸馏水配置成含野菊多糖为1g/L的溶液，摇匀，贮藏备用。在白术生长的苗期，灌根，结果与对照组比较，能显著提高白术中白术内酯类成分的含量。

实施例5野菊多糖的制备

(1)采集岩香菊(C.lavandulaefolium(Fisch.)Mak.)全草，并在烘箱中烘干，粉碎，过80目筛，称取2kg备用；

(2)在上述岩香菊粉末中分别加入粉末质量6-8倍的体积量的石油醚，回流1-2次，每次1-2小时，取出，过滤，滤渣水浴加热挥干剩余石油醚，得到脱色后的野菊粉末；

(3)在脱色后的岩香菊粉末中分别加入粉末质量20倍的体积量的纯水，煎煮2-3次，每次2-3小时，取汁去渣，合并滤液，过滤，得野菊水提物溶液；

(4)减压低温浓缩野菊水提物溶液至比重为1.10-1.30：

(5)在浓缩后的岩香菊水提物溶液中，慢慢加入上述溶液体积9倍的90％-95％的乙醇，4℃静置过夜；

(6)待沉淀析出后，以3000-4500rpm离心上述混合液12-15min，取沉淀，使用冷冻干燥法干燥沉淀，得到野菊粗多糖；

(7)在野菊粗多糖中加入粗多糖质量50倍的体积量的蒸馏水，并加入与蒸馏水同体积的三氯乙酸：正丁醇(体积比为1∶8-10)，剧烈震荡20min，静置，待分层，取下清液，除去上层正丁醇层及中层杂蛋白，加2NNaOH至中性，蒸干，再重复上述(7)步骤6次，除糖蛋白，得纯岩香菊多糖26.76g，经采用硫酸-苯酚法测定野菊多糖的纯度为59％，备用。

实施例6

取实施例6中提取得到的野菊多糖，加入适量水配制成含野菊多糖90g/L的溶液，摇匀，密封储藏。在白术生长的苗期喷施与叶面上，结果与对照组比较，能显著提高白术内酯含量。

还需说明的是：经本申请人实验。以野菊多糖作为诱导子配制的诱导剂显示出诱导白术中白术内酯类成分的显著累积，且与施用剂量及施用方法有关联，因此，施用浓度的下限值可以下降到含野菊多糖0.1g/L，当然施用浓度的上限值也可以根据实际情况上调。