用于调节非结构蛋白质活性的组合物的制作方法

调节(特别是蛋白质活性的抑制)在科学、医学和技术的多个领域中具有重要意义。

在细胞和组织保存中，对于相应制剂的永久性储存重要的是使发挥功能性或催化功能的此类蛋白质的活性完全失活，以防止组织降解。同时，需要保持结构蛋白质完整以保存生物材料的完整性和形状。而且在保存药物制剂或食品或动物饲料产品的领域中，对功能性或非结构蛋白质的抑制对于持续的耐久性是重要的。

功能性蛋白质的失活在技术发酵和生物过程工程、生命和农业科学领域以及在医学应用(例如与毒素、激素和炎症介质的失活有关)中也起到关键作用。

在现有技术中，为了调节或抑制非结构蛋白质(特别是酶)的活性，使用了醛如甲醛，或对蛋白质显示出变性作用的去污剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)、或链长为C₁₂的其他离子表面活性剂。然而，醛具有高急性毒性。它们被认为是致癌、致突变和强致敏。因此，近来醛类再次成为批评的对象。此外，醛不仅对具有酶促活性的蛋白质具有强烈的作用，而且还通过经由交联改变其结构对结构蛋白质具有强烈的作用。SDS和链长度为C₁₂的离子表面活性剂倾向于沉淀，并因此在电解质浓度增加的环境中，特别是与金属离子例如Ca⁺⁺、Mg⁺⁺或K⁺有关的环境中倾向于损失它们的活性。因此，它们不适合在复杂的生物系统中使用。强烈变性作用的去污剂也被认为是高度致敏的，因此对健康有害。非强烈变性的去污剂，例如脂肪醇如Triton X100，不适用于功能性蛋白质的失活，正因为如此，它们被用于蛋白质增溶。

针对这种背景，本发明的一个目的是提供新的组合物或新的活性剂，其适合于调节非结构蛋白质的活性，但是不包括目前在现有技术中所使用的组合物或化合物的缺点。

该目的由用于调节非结构蛋白质活性之包含式I的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的组合物实现：

其中

R₁选自：

C₁-C₆的直链烷基残基，

R₂和R₃选自：

H，XH，

在每个中：

n＝0-20，

m＝1-25，且

X＝O或S。

该目的也通过上述式(I)的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物来实现。

如本发明人所注意到的，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物具有调节非结构蛋白质活性的优异特征。同时，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物仅具有显著小于目前使用的醛或去污剂或表面活性剂的健康问题。

已经证明有利的是，所鉴定的效果是剂量依赖性的。因此，非结构蛋白质活性的调节可以以靶向方式调节到预期的强度和持续时间，并且开辟了大量的应用可能性。

可以根据本领域中通常已知的方法，例如根据DE 3 410 956中所述的方法，生产5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。此外，本发明人能够开发用于生产5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的新方法，其与甚至更少的生产费用相关联。

根据本发明，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸的“衍生物”是其派生物其可以通过对5-氧代-吡咯烷-2-羧酸化学修饰获得。衍生物仍然包含吡咯烷的杂环，然而，衍生物特别是它们的烷基残基方面，可以彼此不同。在衍生物中，吡咯烷的杂环可以在多个位置包含官能团，例如优选在3和4位。根据本发明，包括由其形成的S对映异构体和R对映异构体或外消旋体。“5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物”还包括5-氧代-吡咯烷-2-碳酯衍生物，其也称为焦谷氨酸酯衍生物。

根据本发明，“非结构蛋白质”是指在生物的组织或细胞中不起结构材料作用的这些蛋白质。因此，非结构蛋白质特别是具有催化功能的这些蛋白质，例如酶，以及肽、肽激素、受体、细胞因子、肽毒素等。

根据本发明人的发现，本发明还适用于调节核酸分子(例如核酶、适配体、siRNA等)的催化活性以及类固醇激素的活性。

根据本发明，“调节”涉及变化。因此，“调节非结构蛋白质的活性”应理解为蛋白质的功能在其天然环境中的靶向变化。

根据本发明的组合物的特征、特性、优点和其他开发也相应地适用于5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。

本发明的目的随之完全得到了实现。

根据本发明的组合物或根据本发明的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的一个特定实施方案，所述调节是抑制，优选失活。

该方法具有以下优点：可以以靶向方式减少或甚至关闭蛋白质活性(例如酶促或催化种类的蛋白质活性)，而结构蛋白质仍然在赋予细胞其形状和赋予组织其稳定性和弹性的状态。这在细胞和组织保存领域中尤其重要。

在本发明的另一个实施方案中，非结构蛋白质是酶。

该方法还具有以下优点：根据本发明的组合物或根据本发明的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以靶向方式抑制或关闭催化活性，而结构蛋白质仍然发挥其生物力学和物理性质。

根据本发明优选所述酶选自：氧化还原酶，例如醇脱氢酶；水解酶，例如碱性磷酸酶、内切蛋白酶、RNA酶、DNA酶、脂肪酶；转移酶；裂合酶；异构酶；连接酶。

该方法具有以下优点：这些酶以靶向方式被抑制或完全关闭，这在保存或医学意义上是非常重要的。

在本发明的另一个实施方案中，5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物是式II的葡糖鱼精蛋白(Glucoprotamin)：

通过这种方法，使用了这样的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物，其在现有技术中目前主要在临床上用作表面消毒剂。葡糖鱼精蛋白是由几种组分组成的物质。葡糖鱼精蛋白最重要的两个组分和主要活性剂是(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十二烷基氨基)-丙基和(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十四烷基氨基)丙基。葡糖鱼精蛋白(CAS编号164907-72-6)也被称为胺，N-C12-14-烷基亚丙基二-，L-谷氨酸。在式(II)中，括号表示可存在长链或短链烷基残基，特别是C12和C14，其存在于混合物中。对于C12残基，葡糖鱼精蛋白具有分子式C₂₀H₃₉N₃O₂，且分子量为353.55，对于C14残基，其具有分子式C₂₂H₄₃N₃O₂，且分子量为381.61。

葡糖鱼精蛋白的特征分别在于其对高蛋白质负荷的不敏感性、低毒性或生态毒性，其可以快速和完全降解。其易溶于水，并且长时间稳定。在一项研究中，甚至在储存8年后也不会显示出活性损失。其由例如Ecolab Germany GmbH，Düsseldorf公司销售。

根据本发明的葡糖鱼精蛋白的适用性是令人惊讶的并且未预期到的。在现有技术中，消毒活性的机制被假定为破坏细菌细胞的细胞质膜和包膜病毒的包膜；Meyer和Kluin(1999)，Efficiency of glucoprotamin-containing desinfectants against different species of atypical microbacteria，J.Hosp.Infect.42(2)，151-154页。通过与颗粒的蛋白质衣壳中亲脂基团的相互作用来解释对裸露亲脂性病毒的活性；参见von Rheinbaben和Meyer(2008)，Glucoprotamin.于：Kramer和Assadin(编)，Praxis der Sterilisation，Desinfektion，Antiseptik和Konservierung，第6版，Stuttgart，New York：Georg Thieme Verlag KG，786-787页。

在现有技术中葡糖鱼精蛋白用于调节和抑制非结构蛋白质活性的适用性既没有描述也没有显而易见。

在本发明的另一个实施方案中，提供了根据本发明的组合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物用作防腐剂和/或固定剂。

本发明人证明所述组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物适合于保存组织、器官和全身制品而不使用醛。对在组织裂解中起作用的几类酶的全面和同时灭活允许对生物材料的新型保存。本发明人可以在其实验中证明，在用根据本发明的组合物处理后，器官和全身制品两者在其结构完整性方面几乎没有变化。即使几个月后，全身制品也可以以具有真实触觉的品质保存，这是迄今为止从未达到的。

本发明人发现的特征使得所述组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物也预期用于化妆品、食品或药物产品的防腐剂。

根据本发明的一个实施方案，配置组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以用作药物组合物。

本发明人发现的对非结构蛋白质的抑制活性使得组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物特别适合用作药物制剂。根据本发明的组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物可用于以靶向方式抑制激素、抗体、细胞因子、干扰素、白细胞介素、趋化因子、生长因子、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、受体、核酶和其他介导疾病的酶的活性。

本发明可以以靶向方式针对慢性炎性疾病使用，例如通过产生消炎环境，例如针对慢性类风湿性关节炎。这可例如通过关节内注射根据本发明的组合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物或用其灌洗来实现。另一些实例是慢性炎性肠病，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎、慢性阻塞性肺病、慢性皮肤和粘膜疾病、或自身免疫病。

此外在急性炎症过程中，本发明被用于例如伤口清创术或灌洗的情况下。

组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物也可以用于肿瘤学、免疫学和变态反应学领域，例如用于细胞因子或趋化因子的失活或者用于激素的失活。

在化妆品和个人护理或抗衰老领域中，也会应用根据本发明的组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。它们可用于失活产生气味的酶，因此可用作除臭剂的组分。此外，通过根据本发明的组合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物，可以以靶向方式使弹性蛋白酶和/或胶原酶失活，并且通过这样做，可以预防皮肤衰老的迹象。因此，根据本发明的组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物可以用作乳霜、软膏、洗剂和其他表面应用制剂的组分。

根据本发明的一个优选实施方案，配置组合物或5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以用作杀生物剂，所述杀生物剂优选选自：杀虫剂、杀卵剂、杀螨剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、驱肠虫药(Anthelminthikum)、除草剂、灭藻剂、杀菌剂(Graminizid)和杀树剂(Arborizid)。

该方法具有以下优点：组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物可以用于生命和农业科学中的靶向应用中，并且由于它们以靶向方式对非结构蛋白质特别是对酶的调节或抑制活性，因而可以在其中示出作用。通过对生物体的非结构蛋白质的靶向抑制而关闭其代谢活性，并且因此丧失其损伤作用。

根据一个优选的实施方案，配置根据本发明的组合物和根据本发明的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物以用作发酵助剂。

通过这种方法，实现了本发明在食品和半成品食品生产中的靶向应用。通过靶向抑制发酵酶，可以精确控制发酵过程。此外，在技术发酵和生物过程工程中，特别是在生物乙醇、化学品或药物生产、青贮饲料技术、沼气工厂或生物反应器工厂中的用途也包括在本发明中。

此外在组织工程领域中，通过产生无酶和抗炎环境使用根据本发明的组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。

根据本发明的一个优选实施方案，配置组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物为表面涂层剂。

例如OH、SH或光反应性基团的官能团，可以连接在例如吡咯烷环的3位和4位处。这允许在医药和生物技术领域的产品开发和应用中，使用根据本发明的组合物和5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物作为表面涂层。在该情况中，特别考虑涂覆的医疗装置，例如螺纹材料、支架、关节植入物和伤口敷料。涂层可以例如通过粘附实现，但也可以通过5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的共价结合或固定来实现。

不言而喻，在不脱离本发明的范围的情况下，前面提到的特征和下面要解释的特征不仅可以在每种情况下所指示的组合中使用，而且可以在其他组合中或在分离的情况下使用。

现在通过更详细的实施方案来解释本发明，这将产生其他特征、特性和优点。这些实施方案仅仅是举例说明，并且不限制本发明的范围。

参考示出以下内容的附图：

图1：醇脱氢酶(ADH)反应的反应过程。ADH被葡糖鱼精蛋白完全抑制(正方形；n＝3；误差条＝SEM)。无葡糖鱼精蛋白的对照的动力学(圆圈；n＝3；误差条＝SEM)示出，在测试中所使用的底物/辅酶以饱和浓度存在。

图2：葡糖鱼精蛋白对碱性磷酸酶(ALP)的浓度依赖性调节。与不含葡糖鱼精蛋白的阳性对照(ALP阳性)相比，与葡糖鱼精蛋白(glucoprotamin，GP)孵育20分钟导致ALP依赖于其浓度的失活(n＝3；误差条＝SEM)。

图3：与福尔马林和醇/甘油相比，葡糖鱼精蛋白对内切蛋白酶的失活。用葡糖鱼精蛋白处理多种大鼠器官(Wistar大鼠；出生后3天)导致内切蛋白酶的失活；没有归一化的相对荧光活性(RFU/分钟/mg蛋白质)可如在用福尔马林的处理中测量。在用醇/甘油处理中，仍然可以检测肾脏和结肠中内切蛋白酶的活性(n＝3)。

图4：实时检测葡糖鱼精蛋白对RNA酶的失活。(A)与未处理的RNA酶A(圆圈，n＝3，误差条＝SEM)相比，用葡糖鱼精蛋白处理导致RNA酶A的失活(正方形；n＝3，误差条＝SEM)。(B)葡糖鱼精蛋白使污染的工作区域的RNA酶失活(正方形，n＝3，误差条＝SEM)(阳性对照；圆圈，n＝3，误差条＝SEM)。这种失活可以与市售溶液的去污效果相比较：(C)RNAseZap(三角形，n＝3，误差条＝SEM)和(D)RNase-ExitusPlus(三角形，n＝3，误差条＝SEM)。(B)-(D)用无核酸酶的水处理的阳性对照(圆圈)工作区。

图5：实时检测葡糖鱼精蛋白对脂肪酶的失活。(A)葡糖鱼精蛋白使牛脂蛋白脂肪酶失活(正方形，n＝3，误差条＝SEM)；而在阳性对照中，脂肪酶活性随时间相对地提高(圆圈，n＝3，误差条＝SEM)。(B)葡糖鱼精蛋白使来自皮下脂肪组织的人脂肪酶失活(正方形，n＝3，误差条＝SEM)。从人脂肪组织获得的脂肪酶的活性随时间相对地提高(圆圈，n＝3，误差条＝SEM)。

图6：与用福尔马林保存相比，用葡糖鱼精蛋白保存来自大鼠(Wistar，出生后，31天)的器官。

图7：死亡后7个月，经动脉输注葡糖鱼精蛋白后身体供体之打开的胸部位置。

图8：死亡后7个月，经动脉输注葡糖鱼精蛋白后身体供体之打开的左心室。

实施方案

1.生产5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

在DE 34 10 956中通过葡糖鱼精蛋白的实例描述了5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的生产，该文件的内容被并入本文并且作为本申请的主题。

此外，本发明人已经开发了用于生产5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物的改进方法。

所述反应用以下起始物质进行

I.5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物(优选S对映异构体，但也可以是R对映异构体或外消旋体)和

II.N取代的单胺(2.3)和/或二胺(2.2)和/或脂肪酰胺(2.3)。

a)用N取代的单酰胺转化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

残基的定义：

R₁＝C_1-6，优选C₁的直链烷基残基；

R₂＝链长为C_2-22的直链烷基残基，其中包括单不饱和和多不饱和的烷基残基。

方案1：用N取代的单酰胺转化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

该反应仅需要60℃的优选温度，60分钟的优选反应时间，和300-350mbar的优选压力。蒸馏除去甲醇。

b)用N取代的二胺转化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

残基的定义：

n＝1-6，

R₁＝C_1-6，优选C₁的直链烷基残基；

R₂＝链长为C_2-22的直链烷基或酰基残基，其中包括单不饱和和多不饱和烷基和酰基残基。

方案2：用N-取代的二胺转化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

该反应仅需要60℃的优选温度，60分钟的优选反应时间，和300-350mbar的优选压力。蒸馏除去甲醇。

c)用N取代的脂肪酰胺转化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

残基的定义：

R₁＝C_1-6，优选C₁的直链烷基残基；

R₂＝链长为C_2-24的直链烷基残基，其中包括单不饱和和多不饱和的烷基残基。

方案3：用N取代的脂肪酰胺转化5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

该反应仅需要60℃的优选温度，60分钟的优选反应时间，300-350mbar的优选压力。蒸馏除去甲醇。

用这种新方法，本发明人成功地生产了称为葡糖鱼精蛋白的5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。

在根据本发明的方法中，归属于活性剂葡糖鱼精蛋白的两种活性物质，即(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十二烷基氨基)丙基，和(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十四烷基氨基)丙基，不是通过直链起始物质L-谷氨酸或其酯衍生物与脂肪胺混合物十二烷基/十四烷基亚丙基二胺(也称为椰油基丙烯-1，3-二胺)的反应产生的，而是通过已经是环状的起始产物5-氧代-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯(也称为L-焦谷氨酸甲酯)与椰油基丙烯-1，3-二胺的反应，仅在约60℃、约60分钟和约300至350mbar下产生，并通过蒸馏除去甲醇。

方案4：从5-氧代-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯和椰油基丙烯-1，3-二胺合成葡糖鱼精蛋白

以此目的，在60℃的水浴中将251g(1mol)椰油基丙烯-1，3-二胺(CAS编号6171-63-7)(70mol％十二烷基亚丙基二胺，30mol％十四烷基亚丙基二胺)熔化。然后添加143.14g(1mol)5-氧代-吡咯烷-2(S)-羧酸甲酯，并在330mbar的减压下在旋转蒸发器中在60℃下进行反应1小时。将反应中产生的甲醇(32g)蒸馏掉。转化产物在60℃下是液体粘胶，并在室温下凝固成米黄色蜡状糊状物。转化产物的熔化温度为60-70℃。

对合成产物的分析证实了葡糖鱼精蛋白物质。高分辨率质谱法的结果显示，测试物质的质量偏差仅为[M+H]+＝253g/mol(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十二烷基氨基)丙基，和[M+H]+＝286g/mol(2S)-吡咯烷-5-氧代-羧酸酰胺，N-3-(十四烷基氨基)丙基的理论质量的0.01至0.04ppm。

1H和13C NMR结构分析示出了与理论上预测的光谱(Scifinder/ChemDraw 13.0)的对应性。

由于其温和的反应条件，新的生产方法允许使用长链和/或不饱和的且因此易损的碳链，而在合成反应的情况下不会具有分解或氧化的风险。此外，在新的生产方法中，可以使用“化学组装”的起始物质。此外，复杂的化学反应成为可能，而不影响合成反应。

d)修饰5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物

起始物质5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物和N取代的单胺、二胺和脂肪酰胺衍生物应当被修饰，其目的是对合成产物的活性剂的动力学、活性剂的动态和活性剂的性能产生影响。

可以在吡咯烷环的3和4位修饰起始物质5-氧代-吡咯烷-2-羧酸。

在吡咯烷环的3位和/或4位处例如被保护的羟基或巯基的连接允许将活性物质与多种材料的表面偶联。这允许将所产生的活性剂用作表面涂层。

方案5：通过连接(a)羟基和/或(b)巯基来修饰5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。示出了4位处的羟基和3位处的巯基的实例。R₁代表C_1-6，优选C₁的直链烷基残基。

例如光反应性基团的连接可以允许对活性物质的条件性修饰

方案6：通过连接光反应性基团来修饰5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物。示出3位和4位处的两个实例。R₁代表C_1-6，优选C₁的直链烷基残基。

温和的新生产方法还允许例如使用具有多个链长并且也处于不饱和状态的烷基残基。链长的修饰可导致活性剂谱的变化。

(1)二胺，(2)单胺，(3)脂肪酰胺

其中R₂＝

·链长为C_2-22的直链烷基残基

·单不饱和和/或多不饱和烷基残基

·在(1)中还包括单不饱和和/或多不饱和酰基残基

·n＝1-6

方案7：表示经修饰的单胺、二胺和脂肪酰胺基团。

2.通过葡糖鱼精蛋白调节/失活多种酶类的代表

2.1氧化还原酶(1类酶；EC1)

醇脱氢酶(ADH；EC1.1.1.1)的失活

测量原理：酶醇脱氢酶(ADH)催化乙醇向乙醛的可逆转化，并同时催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)还原成NADH。虽然醇向醛的转化不能被直接检测，但是NADH的形成可以在光度计上进行光学监测。在340nm处的吸收的增加是醇转化的直接量度，并且因此是ADH活性的直接量度。为了测试葡糖鱼精蛋白对ADH的失活，向可商购的NAD-ADH试剂(NAD-ADH试剂多重测试小瓶；Sigma Aldrich；德国)添加2.6％的葡糖鱼精蛋白，并在37℃下孵育10分钟。然后将1％乙醇添加至混合物作为底物，并立即在Infinite M200微板读数器(Tecan，瑞士)中在340nm下测定ADH活性。将得到的ADH动力学相对于没有葡糖鱼精蛋白的对照进行作图(图1)。在比色分析的ADH动力学中显示的结果示出葡糖鱼精蛋白使ADH完全失活。

2.2水解酶(3类酶；EC3)

碱性磷酸酶(EC3.1.3.1)的失活

测量原理：碱性磷酸酶(ALP)在碱性条件下催化磷酸酯水解成有机自由基和无机磷酸盐。通过磷酸对硝基苯酯(pNPP)的裂解进行ALP活性的检测。黄色硝基苯酚盐的形成可以通过测量405nm下的吸收直接监测。

为了测试葡糖鱼精蛋白对ALP的失活，使用了市售的测试系统(碱性磷酸酶测定试剂盒；Abcam，美国)。为此目的，将试剂盒系统中包含的ALP在37℃下与2.6％、5.2％、7.8％和10.4％葡糖鱼精蛋白孵育20分钟。同时，使用没有葡糖鱼精蛋白的相同酶浓度的阳性对照，并像其他样品一样孵育并测量。在添加1mM pNPP后，将样品再孵育30分钟，然后在Infinite M200微板读数器中测定405nm下的吸收(图2)。该终末时间测量的值示出葡糖鱼精蛋白对ALP的失活，其是浓度依赖性的。

内切蛋白酶的失活

测量原理：还通过荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)肽文库测量内切蛋白酶的活性，所述文库含有超过250万种肽(Kapprell等(2011)，Assay and Drug Development Technologies)。该蛋白酶检测的原理基于作为供体的MCA荧光团和作为淬灭剂的2，4-二硝基苯基残基，其与肽偶联。一旦蛋白酶切割肽，供体和淬灭剂就彼此分离，并发生强烈的荧光信号。因此，蛋白酶活性与相对荧光强度的提高成正比。

为了测定葡糖鱼精蛋白对内切蛋白酶的失活，将大鼠(Wistar大鼠，出生后3天)的9种(每种3次)不同器官与2.6％葡萄糖胺，4％福尔马林，或与醇/甘油溶液(70％醇/30％甘油)孵育。然后将这些器官在Tris缓冲液(pH 7.4)中均化。将未固定的、新鲜制备的大鼠器官(n＝3)用作阳性对照。在测定蛋白质浓度(Qubit Protein Assay，Life Technologies，德国)后，将混合物离心，并将10μl上清液添加至80μl Tris缓冲液和10μl基于FRET的肽文库。立即通过Infinite M200微板读数器测定相对荧光强度(RFU)。以蛋白质浓度归一化的每时间单位的相对荧光强度(梯度)示出葡糖鱼精蛋白使内切蛋白酶失活，其类似于福尔马林对内切蛋白酶的失活。肾脏和结肠中的醇/甘油固定不导致内切蛋白酶的完全失活，而仅导致蛋白酶活性的降低(图3)。在所有器官的阳性对照中，均可以鉴定到内切蛋白酶的活性。

RNA酶的失活

测量原理：可以根据FRET原理(RNaseAlert实验室测试试剂盒；Applied Biosystems，德国)，通过可切割的荧光标记的RNA酶底物来确定RNA酶的活性。底物是经修饰的RNA寡核苷酸，当其被RNA酶切割时发射绿色荧光。因此，RNA酶活性与荧光强度的提高成正比。

为了测定葡糖鱼精蛋白对RNA酶的失活，选择了两种不同的方法。首先根据制造商的信息将来自商业测试系统(RNaseAlert实验室测试试剂盒)的5μl RNA酶A(约2pg)添加至2.6％葡糖鱼精蛋白，并在37℃下孵育10分钟。对于阳性对照，添加无核酸酶的水来代替葡糖鱼精蛋白，而其余的以相同的方式处理。添加荧光标记的底物后，通过Infinite M200微板读数器实时测定RNA酶活性。在20分钟的测量时间段内，在用葡糖鱼精蛋白处理的混合物中没有检测到相对荧光强度(RFU)的提高，其因而示出葡糖鱼精蛋白使RNA酶A失活(图4A)。在阳性对照中，可以鉴定到持续的底物饱和的RNA酶活性。

在另一种方法中，实验室工作场所被人汗液和唾液污染。然后将工作区分离为相同大小的四个区域，并且它们各自进行不同处理：无核酸酶水(阳性对照)，2.6％葡糖鱼精蛋白(图4B)，RNaseZap(Blyde Biosystems的商售RNA酶去污溶液；图4C)和RNase exitusPlus(德国AppliChem的商售RNA酶去污溶液；图4D)。孵育10分钟后，用500ml无核酸酶的水润洗处理过的区域两次。区域干燥后，将500μl不含核酸酶的水分别均匀分布在工作区域上，孵育1分钟并通过移液管除去。将荧光标记的底物添加至45μl的这四种不同混合物，并通过Infinite M200微板读数器(Tecan，瑞士)实时测定荧光强度的变化，从而测定RNA酶活性(图4B-D)。用葡糖鱼精蛋白处理工作场所导致汗液和唾液中含有的RNA酶失活，并因此使工作区域去污。这种完全去污可以与迄今为止的商用去污溶液相比较。然而，在仅用无核酸酶水处理的工作场所(阳性对照)上，可以确定依赖于时间的荧光强度的提高，因此可以确定高RNA酶活性。

脂肪酶的失活

测量原理：脂肪酶将花生酰-1-硫代甘油水解成花生四烯酸和硫代甘油。硫代甘油与硫荧光检测器(thiolfluorometrischen Detektor)反应成强荧光产物，可以在380至390nm的激发波长和510至520nm的发射波长下对其进行分析。

为了测试葡糖鱼精蛋白对脂肪酶的失活，根据制造商的信息使用商售测试系统(脂肪酶活性测定，Cayman Chemical Company，美国)。进行了两种不同的测试过程。首先用2.6％的葡糖鱼精蛋白补充10μl牛乳脂蛋白脂肪酶，并根据制造商的信息添加测定缓冲液和硫醇检测器。在阳性对照中，省略了葡糖鱼精蛋白。将这两种溶液混合物在37℃下孵育15分钟。然后添加脂肪酶底物，并通过实时检测荧光强度(RFU)的变化来测定脂肪酶活性(图5A)。葡糖鱼精蛋白使牛乳脂蛋白脂肪酶失活。在第二种测试方法中，在死后取出200mg人的臀部皮下脂肪组织，并用冰冷的PBS通过Precellys陶瓷试剂盒1.4/2.1mm(PeqLab，德国)在微量裂解工作均化器中(PeqLab)于5,000rpm下均化4×10秒。然后将均浆以10,000×g离心10分钟，移出10μl中间相。该样品补充有2.6％的葡糖鱼精蛋白，或直接添加至硫醇检测器的测定缓冲液(阳性对照)。将这两种溶液混合物在37℃下孵育15分钟，并且如上所述实时测量荧光强度(图5B)。葡糖鱼精蛋白使来自皮下脂肪组织的人脂肪酶失活。

3.保存来自大鼠的器官

为了检测葡糖鱼精蛋白的防腐活性，从成年Wistar大鼠(出生后，31天)取出器官并进行照片存档。然后将器官在2.6％葡糖鱼精蛋白或4％福尔马林中孵育7天。然后将器官在没有防腐溶液的情况下另外储存25天，在室温下未覆盖，然后再次进行照片存档和评估(图6)。葡糖鱼精蛋白保存的器官示出与福尔马林固定的器官相当的保存，但它们保持其组织弹性。

4.人全身制品的保存

在根据解剖身体捐赠的实践(伦理委员会表决237/2007B01和1970年7月21日的巴登-符腾堡州的殡葬法)，与福尔马林固定类似地检查在单个酶水平上的结果和动物模型中的器官固定的结果(器官摘除后的浸入固定)的可用性之后，向身体供体的尸体经由股动脉(A.femoralis)动脉内输注17l的2.5％葡糖鱼精蛋白/20％乙醇溶液，泵性能为1bar。

将全身制品用带有上述溶液的湿布包裹并密封在箔中。在2周、1个月、3个月和7个月后进行组织的一致性和组织状态的控制。

2周和1个月后的检查

没有发现裂解的迹象，组织结构保持未改变，与福尔马林固定相反，触觉接近真实情况。

3个月后的侵入性检查

进行诊断性腹腔镜检查，然后通过中位剖腹术进行开放手术检查。结果：胃肠道是完整的，没有发生裂解的迹象。进行的微生物涂片测试示出腹腔内的隐窝和结肠区域的腹膜内空间无菌。

在骨科手术的情况中，进行肩关节的关节镜检查。关节空间保存接近真实，对于触觉而言，韧带和软骨的结构接近真实。

7个月后的侵入性检查

7个月后，进行解剖学的覆盖原位制备(图7和8)以打开并检查整个腹部区域。所有的器官都保存下来。此外，本身具有高含量消化酶的器官(例如胰腺)也保持其形态完整性。打开左心，检查心内膜空间(图8)。甚至精细的结构(例如房室瓣、腱索)也保存的接近真实。

同样在7个月后，可以发现良好保存的结构，而没有发生裂解的迹象。

5.结论

本发明人提供了5-氧代-吡咯烷-2-羧酸衍生物形式的活性物质，例如葡糖鱼精蛋白，其可以有多种应用，并且通过其可以调节(优选抑制)非结构蛋白质的活性。该物质与目前使用的醛、去污剂和表面活性剂相比具有显著较小的健康问题。