专利名称：离子交换色谱介质辅助蛋白质复性的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及离子交换色谱介质辅助蛋白质复性技术，及其在蛋白质稀释复性中的 应用，属于生物技术中的蛋白质复性技术领域。
背景技术：
自70年代重组DNA技术发明以来，现代生物技术的迅猛发展推动了重组蛋白质产 品的开发。由于大肠杆菌表达体系具有质粒结构简单、营养要求低、生长迅速、蛋白质产量 高、容易分离纯化的优点，所以目前大部分重组蛋白质都是采用大肠杆菌为宿主体系。对于 该体系而言，目标蛋白质产品常常以无活性聚集体-包含体的形式存在。包含体中蛋白质 的一级结构正确，但是无三级结构，必须通过复性才能得到预期生物活性的蛋白质。由于蛋 白质自身结构的复杂性，复性较为困难，使得复性成为了基因工程生产生物医药蛋白质的 瓶颈。由于蛋白质从无活性松散肽链折叠复性到具有活性的天然态蛋白质的过程中，蛋白 质聚集沉淀是影响蛋白质复性收率的最重要因素，所以抑制聚集成为促进复性的关键。目前加入复性添加剂是抑制蛋白质聚集的一个极为重要的方法。如应用人工分 子伴侣，用表面活性剂分子抑制变性分子聚集，通过加入环糊精来剥离蛋白质使其复 性；应用甘油、聚乙二醇、甜菜碱、精氨酸、盐酸胍、尿素等添加剂来削弱分子间的疏水作用 (Effectof Additives on Refolding of a denatured protein. Biotechnology Progress, 2008,14,601-606 ；Chaperonin and osmolyte protein folding and related screening methods, US patent, US6887682, 2005)而使得蛋白质不易聚集。然而，应用这些添加剂在 抑制聚集辅助复性中存在如下问题它们的加入都会在复性体系中引入新的“杂质”，需要 进一步进行其与复性后天然蛋白质的分离操作，而且分离困难，添加剂不能够重复利用。迄今所报道的色谱介质对蛋白质的复性作用主要是在色谱柱内，通过疏水作用或 者静电作用对变性蛋白进行吸附抑制蛋白分子之间的疏水相互作用及聚集。目前还没有直 接将色谱介质作为有效添加剂来辅助蛋白质复性的报道。关于蛋白质的色谱复性，人们已 经有了非常详细的研究。色谱复性包括过柱复性(尺寸排阻色谱)和吸附洗脱复性(疏水 相互作用色谱、离子交换色谱、亲和层析色谱)。对于离子交换色谱，人们关注于与蛋白质带 有相反电荷的色谱介质对蛋白质的辅助复性效果(Folding and refolding of proteins inchromatographic beds. Current Opinion in Biotechnology,2004,15,487-494), O=L^ 并没有人研究与蛋白质带有同种电荷的色谱介质辅助蛋白质复性的效果。色谱复性方法具 有的优势是在复性的同时实现分离，不会引入其它杂质分子，然而此法需要应用比较昂贵 的色谱设备，操作条件苛刻，处理量小，放大困难，而且在辅助包含体蛋白质复性的过程中 蛋白质聚集易造成管路堵塞等问题。为了克服添加剂辅助复性以及色谱复性的不足，本发明提出了一种新型的离子交 换色谱介质辅助蛋白质复性的方法，所有操作简单，不需要昂贵的大型设备，不会对复性蛋 白质造成污染，而且作为添加剂的离子交换色谱介质经适当处理后可重复利用。
发明内容
本发明的目的在于建立一种通过抑制变性蛋白质聚集从而辅助变性蛋白质有效 复性的技术方法。本方法利用与复性条件下蛋白质带有同种电荷的离子交换色谱介质为添 加剂，通过离子交换色谱介质与蛋白质间的静电排斥作用抑制变性蛋白质的聚集，从而辅 助蛋白质高效复性。本方法具有无需液相色谱系统、操作简单、无污染等特点，此外作为添 加剂的离子交换色谱介质可以重复使用。本发明是通过下述技术方案加以实现的本发明的离子交换色谱介质辅助蛋白质复性方法，步骤如下1)采用与蛋白质带有同种电荷的离子交换色谱介质；2)离子交换色谱介质预处理，用盐洗冲掉杂质离子后，再用去离子水冲掉盐溶 液；3)将色谱介质加入复性液中，然后再将变性蛋白质加入复性缓冲液开始复性，4)复性完成后，采用离心或重力沉降方法收集上清液；获得复性蛋白溶液。所述的的离子交换色谱介质为带有正电荷的阴离子交换色谱介质或带有负电荷 的阳离子交换色谱介质。带有正电荷的阴离子交换色谱介质为DEAE-S印haroes Fast Flow 或Q-S^harose Fast Flow。带有负电荷的阳离子交换色谱介质为SP-S印harose Fast Flow 或 CM-Sepharose Fast Flow。所述的复性缓冲液为0. 02-0. IM三羟甲基氨基甲烷(Tris) ,0-0. 003M乙二胺四乙 酸二钠(EDTA)、0-2M 尿素；pH 值为 7. 5-9. 0。复性缓冲液中无无机盐或无机盐含量不高于0. 05M。所述的步骤2)方法是将所选的离子交换色谱介质移入烧结玻璃漏斗抽滤除去 液体后，依次用摩尔浓度为0. 2-2M氯化钠溶液和去离子水各冲洗3-8次，每次冲洗所用的 液体体积为离子交换色谱介质沉降体积的20-30倍。所述的步骤3)方法是复性缓冲液中色谱介质的浓度为0. 025-0. 5g/mL ；混合 物置于温度为20-37°C的恒温水浴中振荡预平衡直至温度恒定；然后，加入待复性蛋白 质溶液，复性液中蛋白的终浓度为0. 07-4mg/mL ；振荡混勻后，放入恒温水浴中在转速为 50-170rpm条件下复性，复性温度与此前复性液预平衡的温度相同。本发明的离子交换色谱介质辅助蛋白质复性方法，应用于复性过程中易于聚集的 蛋白质，包括不含二硫键的蛋白质、含有二硫键但是二硫键未断开或未发生错配的蛋白质 以及含二硫键并且二硫键被还原断开或发生错配的蛋白质的复性。具体说明如下本发明所述的离子交换色谱介质辅助蛋白质复性方法，根据复性液pH值下变性 蛋白质所带电荷性质选择带有同类电荷的离子交换色谱介质；所选的离子交换色谱介质移 入烧结玻璃漏斗抽滤除去液体后，依次用摩尔浓度为0. 2-2M氯化钠溶液和去离子水各冲 洗3-8次，每次冲洗所用的液体体积为离子交换色谱介质沉降体积的20-30倍；经上述处理 后离子交换色谱介质移入由0.02-0. IM三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0-0. 003M乙二胺四乙酸 二钠(EDTA)、0-2M尿素组成且pH为7. 5-9. 0的复性缓冲液中，使最终复性缓冲液中色谱介 质的浓度为0. 025-0. 5g/mL ；上述混合物置于温度为20_37°C的恒温水浴中振荡预平衡直 至温度恒定；然后，加入待复性蛋白质溶液，复性液中蛋白的终浓度为0. 07-4mg/mL ；振荡
4混勻后，放入恒温水浴中在转速为50-170rpm条件下复性，复性温度与此前复性液预平衡 的温度相同；复性完成后，采用离心或重力沉降方法收集上清液；沉降的色谱介质进一步 用复性缓冲液冲洗3-5次，每次复性液的用量为色谱介质沉降体积的1. 5-3倍；用离心或重 力沉降方法收集每次冲洗后的上清液，所收集的上清液合并后获得复性蛋白溶液；使用后 的离子交换色谱介质依次用0. 5-2M氯化钠溶液和去离子水彻底冲洗后可重复利用。本发明的离子交换色谱介质辅助蛋白质复性的方法应用于变性蛋白质复性中。变 性失活的蛋白质样品使用本发明的方法进行复性可以保证较高的复性收率。复性过程中易 于聚集的蛋白质均可使用本专利的复性方法进行复性。本发明的方法可用于含有二硫键蛋白质的复性和不含二硫键的蛋白质的复性。对 于不含二硫键的蛋白质，复性过程可选择偏离蛋白质等电点1.0以上的PH进行复性。对于 含二硫键并且二硫键被还原断开的变性蛋白质可以在氧化还原剂存在下使用本专利方法 进行复性，优选的PH为偏离蛋白质等电点1. 0以上，并且不小于7. 5的pH条件。本发明的离子交换色谱介质辅助蛋白质复性方法中，复性缓冲液中可以含有其它 抑制聚集的添加剂尿素，二者具有协同的效果，可以共同促进复性收率的提高。本发明的关键技术有四点首先，离子交换色谱介质的选用方法，根据蛋白质所带 的电荷性质，采用与蛋白质带有同种电荷的离子交换色谱介质，溶液中的色谱介质与变性 蛋白质分子间的静电斥力可以有效地抑制变性蛋白质分子在复性溶液中的聚集；其次，离 子交换色谱介质预处理，用盐洗冲掉杂质离子后，再用去离子水冲掉盐溶液，防止盐在复性 过程中会削弱蛋白质和色谱介质之间的静电斥力；关键之三色谱介质和变性蛋白质加入复 性液的顺序，在辅助蛋白质复性时，要先将色谱介质加入复性液中，然后再将变性蛋白质加 入复性液开始复性，因为蛋白质由变性液稀释到复性液过程的最初阶段是聚集的最重要阶 段，在此阶段里变性蛋白质疏水残基暴露相对较多，比较容易发生分子间聚集；关键之四复 性完成后离子交换色谱介质的处理，由于蛋白质和离子交换色谱介质之间具有静电斥力， 使得通过简单的离心就可以使色谱介质和蛋白质得到很好的分离，色谱介质可以很容易进 行重复利用。本发明所介绍的离子交换色谱介质作为添加剂辅助蛋白质复性的方法与其它的 添加剂辅助复性方法以及离子交换色谱辅助复性方法相比有如下优点第一，本发明所采 用的添加剂是不溶于水的离子交换色谱介质，不会污染蛋白质；第二，本发明所采用的添加 剂在复性完成后，易与蛋白质分离；第三，本发明介绍的离子交换色谱介质复性方法，不需 要色谱柱或色谱系统等昂贵的大型设备，操作简单，成本低廉，易于应用于大规模生产。
图1 实施例1中的强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow辅助4mg/mL 还原变性溶菌酶的复性；图2 实施例2中的弱阴离子交换色谱介质DEAE-S印harose Fast Flow辅助4mg/ mL还原变性溶菌酶的复性；图3 实施例3中的强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow在含NaCl条 件下辅助4mg/mL还原变性溶菌酶的复性；图4 实施例4中的强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow在0. 025g/mL和0. 5g/mL浓度下辅助还原变性溶菌酶的复性；图5 实施例5中的强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow辅助0. 07mg/ mL还原变性溶菌酶的复性；图6 实施例6中的强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow在氧化型谷 胱甘肽为氧化剂时辅助4mg/mL还原变性溶菌酶的复性；图7 实施例7中的强阳离子交换色谱介质SP-S印harose Fast Flow辅助2mg/mL 还原变性牛血清白蛋白的复性；图8 实施例8中的弱阳离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow辅助2mg/mL 还原变性牛血清白蛋白的复性；图9 实施例9中的强阳离子交换色谱介质SP-S印harose Fast Flow辅助0. 4mg/ mL变性碳酸酐酶II的复性；图10 实施例10中的弱阳离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow辅助 0. 4mg/mL变性碳酸酐酶II的复性。
具体实施例方式下面的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。实施例1 强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow辅助4mg/mL还原变性 溶菌酶的复性由于溶菌酶在复性pH 8. 5条件下带正电，所以离子交换色谱介质选择为带有正 电荷的阴离子交换色谱介质Q-Sepharose Fast Flow0在烧结玻璃砂滤漏斗中放入2mL储 存于20%乙醇中的离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow，首先抽滤掉20%的乙醇溶 液，再用160mL 0. 5M NaCl溶液分4次对色谱介质进行冲洗，每次加入40mL 0. 5M NaCl溶 液，用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去离子水200mL分5次冲洗色谱介质，每 次加入40mL去离子水后用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。最后用去离子水洗完之后， 持续抽干lOmin，放入4°C冰箱备用。变性蛋白质样品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl和 0. 00IMEDTA, pH 8. 5的变性缓冲溶液中于40°C还原变性3小时。复性缓冲液为含有IM尿 素、0. 0054M胱胺和0. 00IMEDTA的0. IM Tris-HCl缓冲液，溶液pH为8. 5。对于不含色谱 介质的复性是将复性缓冲液温度平衡使其达到20°C形成ImL复性液，对于含有色谱介质的 复性是向复性缓冲液中加入0. 2g色谱介质，温度平衡使含有色谱介质的复性缓冲液达到 20°C并振荡混合均勻形成ImL复性液；然后，在复性液中加入变性蛋白质，迅速振荡混勻， 然后放入恒温摇床170rpm开始复性，复性过程中恒温摇床的温度也为20°C。溶菌酶的活性 检测以微球菌为底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸盐缓冲液与0. IOmL稀释后 的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度25°C。通 过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收 率。复性完成后IOOOOrpmX Imin离心，取上清，向沉降的色谱介质中加入复性缓冲液0. 4mL 冲洗，然后离心、取上清，反复4次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，加入 色谱介质和不加色谱介质的复性收率随时间变化比较如图1所示。由图可知，在上述实验 条件下阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow的加入可以极大地提高带正电荷的变性还原溶菌酶的复性收率，在最终蛋白质浓度达到4mg/mL高浓度的条件下仍然可以获得 94%的活性收率，而不加入色谱介质的复性收率只能达到40%。将沉降的0. 2g Q-Sepharose Fast Flow 色谱介质用 0· 5M NaCl 溶液平衡 15min， lOOOOrpmX Imin离心去除上清，将吸附的杂质洗脱；将色谱介质放入烧结玻璃砂滤漏斗， 先用16mL IM NaCl溶液分4次清洗，然后用去离子水16mL分4次冲洗；最后用20%的乙
醇保存备用。实施例2 弱阴离子交换色谱介质DEAE-S^harose Fast Flow辅助4mg/mL还原 变性溶菌酶的复性由于溶菌酶在复性pH 8. 5条件下带正电，所以离子交换色谱介质为阴离子交换 色谱介质DEAE-S印harose Fast Flow。在烧结玻璃砂滤漏斗中放入2mL储存于20%乙醇中 的离子交换色谱介质DEAE-S印harose Fast Flow，首先抽滤掉20%的乙醇溶液，再用120mL 2MNaCl溶液分3次对色谱介质进行冲洗，每次加入40mL 2M NaCl溶液，用玻璃棒搅拌均勻， 然后抽去水溶液。之后用去离子水ISOmL分3次冲洗色谱介质，每次加入60mL去离子水后 用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。最后用去离子水洗完之后，持续抽干lOmin，放入4°C 冰箱备用。变性蛋白质样品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl和 0. 001M EDTA，pH 8. 5的变性缓冲溶液中于40°C变性3小时。复性缓冲液为:pH 8. 5的0. 02M Tris-HCl含IM尿素、0. 0054M胱胺和0. 003M EDTA。对于不含色谱介质的复性是将复性缓 冲液温度平衡使其达到37°C形成ImL复性液，对于含有色谱介质的复性是向复性缓冲液中 加入0. 2g色谱介质，温度平衡使含有色谱介质的复性缓冲液达到37°C并振荡混合均勻形 成ImL复性液；然后，在温度平衡后的复性液中加入变性蛋白质，迅速振荡混勻，然后放入 恒温摇床50rpm开始复性，复性过程中恒温摇床的温度也为37°C。活性检测应用的是微球 菌为底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸盐缓冲液与0. IOmL稀释后的蛋白质复 性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性测定温度25°C。通过0_90s间 吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。采用本专 利所述方法复性，复性液中色谱介质加入量为0. 2g/mL。复性完成后lOOOOrpmX Imin离心， 取上清，向沉降的色谱介质中加入复性缓冲液0. 6mL冲洗，然后IOOOOrpmX Imin离心、取上 清，反复3次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，加入色谱介质和不加色 谱介质的复性收率随时间变化比较如图2所示。由图可知，在上述实验条件下阴离子交换 色谱介质DEAE-S印harose Fast Flow的加入可以极大地提高变性还原的溶菌酶的复性收 率，在最终蛋白质浓度达到4mg/mL高浓度的条件下仍然可以获得85%的活性收率，而不加 入色谱介质的复性收率只能达到40%。将DEAE-S印harose Fast Flow 色谱介质用 2M NaCl 溶液平衡 5min， lOOOOrpmX Imin离心去除上清，将吸附的杂质洗脱；将色谱介质放入烧结玻璃砂滤漏斗， 先用0. 5M NaCl溶液16mL分3次清洗，然后用去离子水16mL分4次清洗，最后用20%的乙
醇保存备用。实施例3 强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow在含NaCl条件下辅助 4mg/mL还原变性溶菌酶的复性离子交换色谱介质为实施例1准备的阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast
7Flow。变性蛋白质样品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl,pH 8.5 的变性缓冲溶液中于40°C变性3小时。复性缓冲液为pH 8. 5的0. IMTris-HCl含IM尿 素、0. 0054M胱胺、0. 025或0. 05M NaCl和0. OOlM EDTA。实验过程中复性恒温摇床的温度 为25°C。活性检测应用的是微球菌为底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸盐缓冲 液与0. IOmL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。通过 0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。 活性测定温度25°C。采用本专利所述方法复性，复性液中色谱介质加入量为0和0. 2g/mL。 复性完成后自然沉降5min，取上清，向沉降的色谱介质中加入复性缓冲液0. 3mL冲洗，然后 IOOOOrpmX Imin离心、取上清，反复5次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相 同，复性4小时后加入色谱介质和不加色谱介质的复性收率比较如图3所示。由图可知，在 上述实验条件下阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow的加入可以极大地提高变性 还原溶菌酶的复性收率，在最终蛋白质浓度达到4mg/mL高浓度的条件下有0. 025M NaCl存 在时可以获得75%的活性收率，有0. 05M NaCl存在时可以获得63%的活性收率，而不加入 色谱介质的复性收率只能达到45%以下。将沉降的Q-S^harose Fast Flow色谱介质用IM NaCl溶液平衡lOmin， IOOOOrpmX Imin离心去除上清，然后将色谱介质放入烧结玻璃砂滤漏斗，先用0. 5M NaCl 溶液16mL分6次清洗，然后用去离子水16mL分6次清洗，最后用20%的乙醇保存备用。实施例4 强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow在0. 025g/mL和0. 5g/ mL浓度下辅助还原变性溶菌酶的复性离子交换色谱介质为实施例1所准备的阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow。变性蛋白质样品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl,pH 8.5 的变性缓冲溶液中于40°C变性3小时。复性缓冲液为pH 8. 5的0. IMTris-HCl含IM尿 素、0. 0054M胱胺和0. 001MEDTA。实验过程中复性恒温摇床的温度为25°C。活性检测应用 的是微球菌为底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸盐缓冲液与0. IOmL稀释后的 蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。通过0_90s间吸光值降低 速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。活性测定温度25°C。 采用本专利所述方法复性，复性液中不加入色谱介质或加入终浓度为0. 025g/mL和0. 5g/ mL的色谱介质。对含有色谱介质的复性，复性完成后自然沉降5min，取上清，向沉降的色谱 介质中分别加入复性缓冲液0. 075mL和ImL冲洗，然后IOOOOrpmX Imin离心、取上清，反复 5次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，复性4小时后加入色谱介质和不 加色谱介质的复性收率比较如图4所示。由图可知，在上述实验条件下阴离子交换色谱介 质Q-S印harose Fast Flow的加入可以极大地提高变性还原溶菌酶的复性收率，即使在较 低的色谱介质浓度条件下也具有很好的辅助蛋白复性的效果，在最终蛋白质浓度达到4mg/ mL高浓度的条件下，不加色谱介质的复性收率仅为40%，而在0. 025g/mL色谱介质的辅助 下复性收率达到60%，在0. 5g/mL色谱介质的辅助下，复性收率可以达到几乎100%。将沉降的Q-S印harose Fast Flow色谱介质用IM NaCl溶液平衡lOmin， IOOOOrpmX Imin离心去除上清，然后将色谱介质放入烧结玻璃砂滤漏斗，先用0. 5M NaCl 溶液16mL分6次清洗，然后用去离子水16mL分6次清洗，最后用20%的乙醇保存备用。实施例5 强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow辅助0. 07mg/mL还原变性溶菌酶的复性离子交换色谱介质为实施例1准备的阴离子交换色谱介质Q-Si^pharose Fast Flow。变性蛋白质样品:14. 3mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT,0. IM Tris-HCl, pH 8. 5的变性缓冲溶液中于40°C变性3小时。复性缓冲液为:pH 8. 5的0. IM Tris-HCl含2M 尿素、0.0005M胱胺和0. OOlM EDTA。实验过程中复性恒温摇床的温度为25°C。活性检测应 用的是微球菌为底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH 6. 2的磷酸盐缓冲液与0. IOmL稀释后 的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。通过0-90s间吸光值降低 速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来计算溶菌酶活性收率。活性测定温度25°C。 采用本专利所述方法复性，复性液中色谱介质加入量为0和0. 2g/mL。复性完成后自然沉 降5min，取上清，向沉降的色谱介质中加入复性缓冲液0. 4mL冲洗，然后IOOOOrpmX Imin 离心、取上清，反复5次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，复性3小时后 加入色谱介质和不加色谱介质的复性收率比较如图5所示。由图可知，在上述实验条件下 0. 2g/mL阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow的加入可以极大地提高变性还原溶 菌酶的复性收率，在最终蛋白浓度为0. 07mg/mL的条件下可获得几乎100%的活性收率，而 不加入色谱介质的复性收率只能达到20%。将沉降的Q-S印harose Fast Flow色谱介质用IM NaCl溶液平衡lOmin， IOOOOrpmX Imin离心去除上清，然后将色谱介质放入烧结玻璃砂滤漏斗，先用0. 5M NaCl 溶液16mL分6次清洗，然后用去离子水16mL分6次清洗，最后用20%的乙醇保存备用。实施例6 强阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow辅助4mg/mL还原变性 溶菌酶的复性离子交换色谱介质为阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow0在烧结玻璃 砂滤漏斗中放入2mL储存于20%乙醇中的离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow，首 先抽滤掉20%的乙醇溶液，再用160mL 0. 5M NaCl溶液分4次对色谱介质进行冲洗，每次加 入40mL0. 5M NaCl溶液，用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去离子水200mL分5 次冲洗色谱介质，每次加入40mL去离子水后用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。最后用 去离子水洗完之后，持续抽干lOmin，放入4°C冰箱备用。变性蛋白质样品:60mg/mL溶菌酶在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. IM Tris-HCl和 0. 00IMEDTA, pH 8. 5的变性缓冲溶液中于40°C还原变性3小时。复性缓冲液为含有2M尿 素、0. 0054M氧化性谷胱甘肽(GSSG)和0. 00IMEDTA的0. IM Tris-HCl缓冲液，溶液pH为 8. 5。对于不含色谱介质的复性是将复性缓冲液温度平衡使其达到20°C形成ImL复性液，对 于含有色谱介质的复性是向复性缓冲液中加入0. 2g色谱介质，温度平衡使含有色谱介质 的复性缓冲液达到20°C并振荡混合均勻形成ImL复性液；然后，在复性液中加入变性蛋白 质，迅速振荡混勻，然后放入恒温摇床170rpm开始复性，复性过程中恒温摇床的温度也为 200C。溶菌酶的活性检测以微球菌为底物，1. 30mL 0. 25mg/mL底物的pH6. 2的磷酸盐缓冲 液与0. IOmL稀释后的蛋白质复性液充分混合，测定反应液在450nm下的吸光度变化。活性 测定温度25°C。通过0-90s间吸光值降低速率与天然酶催化条件下的降低速率的比值来 计算溶菌酶活性收率。复性完成后lOOOOrpmXlmin离心，取上清，向沉降的色谱介质中加 入复性缓冲液0. 4mL冲洗，然后离心、取上清，反复4次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。 其它条件相同，加入色谱介质和不加色谱介质在复性3h之后的比较如图6所示。由图可知，以GSSG作为氧化剂时，在上述实验条件下阴离子交换色谱介质Q-S印harose Fast Flow 的加入也可以极大地提高带正电荷的变性还原溶菌酶的复性收率，在最终蛋白质浓度达到 4mg/mL高浓度的条件下仍然可以获得91 %的活性收率，而不加入色谱介质的复性收率只 能达到59%。将沉降的0. 2g Q-Sepharose Fast Flow 色谱介质用 0· 5M NaCl 溶液平衡 15min， lOOOOrpmX Imin离心去除上清，将吸附的杂质洗脱；将色谱介质放入烧结玻璃砂滤漏斗， 先用16mL IM NaCl溶液分4次清洗，然后用去离子水16mL分4次冲洗；最后用20%的乙
醇保存备用。实施例7 强阳离子交换色谱介质SP-S^harose Fast Flow辅助2mg/mL还原变 性牛血清白蛋白的复性由于牛血清白蛋白在复性pH 9条件下带负电，所以离子交换色谱介质选择为带 有负电荷的阳离子交换色谱介质SP-S印harose Fast Flow0在烧结玻璃砂滤漏斗中放入 2mL储存于20%乙醇中的离子交换色谱介质SP-S^harose Fast Flow，首先抽滤掉20% 的乙醇溶液，再用400mL 0. 2M NaCl溶液分8次对色谱介质进行冲洗，每次加入50mL 0. 2M NaCl溶液，用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去离子水400mL分8次冲洗色谱介 质，每次加入50mL去离子水后用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。最后用去离子水洗完 之后，持续抽干lOmin，放入4°C冰箱备用。变性蛋白质样品60mg/mL牛血清白蛋白在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. 05MTris-HCl和0. 001MEDTA，pH 8. 5的变性缓冲溶液中于25°C变性3小时。复性缓冲液 为:pH 9的0. 05M Tris-HCl.O. 0027M胱胺和0. 001M EDTA0对于不含色谱介质的复性样 品，直接温度平衡使复性缓冲液达到25°C形成2mL复性液，对于含有色谱介质的复性样品， 向复性缓冲液中加入0. 2g色谱介质，温度平衡使含有色谱介质的复性缓冲液达到25°C并 且振荡混合均勻形成2mL复性液；然后，在复性液中加入变性蛋白质样品，迅速振荡混勻， 然后放入恒温摇床IOOrpm开始复性。复性过程中恒温摇床的温度也为25°C。复性液中天 然牛血清白蛋白定量通过C18反相色谱分离，根据峰面积进行定量。采用本专利所述方法 复性，复性液中色谱介质加入量为0. lg/mL。复性完成后自然沉降15min，取上清，然后向沉 降的色谱介质中加入复性缓冲液0. 3mL冲洗，然后IOOOOrpmX Imin离心、取上清，如此反复 三次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，加入色谱介质和不加色谱介质的 复性收率随时间变化比较如图7所示。由图可知，在上述实验条件下阳离子交换色谱介质 SP-Sepharose Fast Flow的加入可以极大地提高带负电荷的变性还原的牛血清白蛋白的 复性收率，在最终蛋白质浓度达到2mg/mL高浓度的条件下仍然可以获得85%的复性收率， 而不加入色谱介质的普通稀释复性收率只能达到26%。将沉降的SP-S印harose Fast Flow色谱介质用2M NaCl溶液平衡15min， lOOOOrpmX Imin离心去除上清，将吸附的杂质洗脱；将色谱介质放入烧结玻璃砂滤漏斗， 先用0. 5MNaCl溶液16mL分5次清洗，然后用去离子水16mL分5次清洗，最后用20%的乙
醇保存备用。实施例8 弱阳离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow辅助2mg/mL还原变 性牛血清白蛋白的复性离子交换色谱介质为阳离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow。在烧结玻璃
10砂滤漏斗中放入2mL储存于20%乙醇中的离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow，首 先抽滤掉20%的乙醇溶液，再用160mL 0. 5M NaCl溶液分4次对色谱介质进行冲洗，每次加 入40mL 0. 5M NaCl溶液，用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。之后用去离子水200mL分5 次冲洗色谱介质，每次加入40mL去离子水后用玻璃棒搅拌均勻，然后抽去水溶液。最后用 去离子水洗完之后，持续抽干lOmin，然后放入4°C冰箱备用。变性蛋白质样品60mg/mL牛血清白蛋白在含有8M尿素，0. IM DTT, 0. 05mMTris-HCl和0. OOlM EDTA，pH 8. 5的变性缓冲溶液中于25°C变性3小时。复性缓冲液 为:pH 8. 5的0. 05M Tris-HCl.O. 0027M胱胺和0. OOlM EDTA0对于不含色谱介质的复性样 品，直接温度平衡使复性缓冲液达到25°C形成2mL复性液，对于含有色谱介质的复性样品， 向复性缓冲液中加入0. 2g色谱介质，温度平衡使含有色谱介质的复性缓冲液达到25°C并 且振荡混合均勻形成2mL复性液；然后，在温度平衡后的复性液中加入变性蛋白质样品，迅 速振荡混勻，然后放入恒温摇床IOOrpm开始复性。复性过程中恒温摇床的温度也为25°C。 复性液中天然牛血清白蛋白定量通过C18反相色谱分离，根据峰面积进行定量。采用本专 利所述方法复性，复性液中色谱介质加入量为0. lg/mL。复性完成后lOOOOrpmX Imin离心， 取上清，然后向沉降的色谱介质中加入复性缓冲液0. 3mL冲洗，然后lOOOOrpmX Imin离心、 取上清，如此反复三次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，加入色谱介质 和不加色谱介质的复性收率随时间变化比较如图8所示。由图可知，在上述实验条件下阳 离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow的加入可以极大地提高带负电的变性还原的 牛血清白蛋白的复性收率，在最终蛋白质浓度达到2mg/mL高浓度的条件下仍然可以获得 82%的复性收率，而不加入色谱介质的复性收率只能达到26%。实施例9 强阳离子交换色谱介质SP-S^harose Fast Flow辅助0. 4mg/mL变性 碳酸酐酶II的复性由于在pH7. 5的复性条件下CAII带有负电荷，所以离子交换色谱介质选择为实施 例7所准备的阳离子交换色谱介质SP-S印harose Fast Flow0变性蛋白质样品12mg/mL 碳酸酐酶II在含有8M尿素，0. 05M Tris-HCl,pH 7. 5的变性缓冲溶液中于25°C变性24小 时。复性缓冲液为PH 7.5&0.05M Tris-HCl含2Μ尿素。对于不含色谱介质的复性样品， 直接温度平衡使复性缓冲液达到25°C形成2mL复性液，对于含有色谱介质的复性样品，向 复性缓冲液中加入0. 2g色谱介质，温度平衡使含有色谱介质的复性缓冲液达到25°C并且 振荡混合均勻形成2mL复性液；然后在复性液中加入变性蛋白质样品，迅速振荡混勻，放入 恒温摇床170rpm开始复性。复性过程中恒温摇床的温度也为25°C。活性检测方法应用 4-硝基苯基乙酸酯为底物的水解反应，15 μ L复性样品加入到ImL 0. 05Μ Tris-HCl, 0. 005Μ EDTA, pH 7.5，and 10 μ L of 0. IM 4-硝基苯基乙酸酯的乙腈溶液.在400nm波长下检测 其吸光值变化。通过0-90s间吸光值升高速率与天然酶催化条件下的升高速率的比值来计 算碳酸酐酶II的活性收率。活性测定温度25°C。采用本专利所述方法复性，复性液中色 谱介质加入量为0. lg/mL。复性完成后自然沉降lOmin，取上清，然后向沉降的色谱介质中 加入复性缓冲液0. 3mL冲洗，然后IOOOOrpmX Imin离心、取上清，如此反复3次冲洗，可将 复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，加入色谱介质和不加色谱介质复性4小时后收率 比较如图9所示。由图可知，在上述实验条件下阴离子交换色谱介质SP-Si^pharose Fast Flow的加入可以极大地提高变性碳酸酐酶II的复性收率，在最终蛋白质浓度达到0. 4mg/
11mL浓度的条件下仍然可以获得几乎100%的复性收率，而不加入色谱介质的复性收率只能 达到74%。实施例10 弱阳离子交换色谱介质CM-S^harose Fast Flow辅助0. 4mg/mL变性 碳酸酐酶II的复性由于在pH 7. 5的复性条件下CAII带有负电荷，所以离子交换色谱介质选择为实 施例8所准备的阳离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow。变性蛋白质样品12mg/mL 碳酸酐酶II在含有8M尿素，0. 05M Tris-HCl,pH 7. 5的变性缓冲溶液中于25°C变性24小 时。复性缓冲液为PH 7.5的0.05M Tris-HCl含2M尿素。含有色谱介质的复性样品是向复 性缓冲液中加入0.2g色谱介质，温度平衡使含有色谱介质的复性缓冲液达到25°C并且振 荡混合均勻形成2mL复性液，然后在复性液中加入变性蛋白质样品，迅速振荡混勻，放入恒 温摇床170rpm开始复性。对于不含色谱介质的复性样品，将2mL复性缓冲液恒温于25°C，然 后直接向其中加入变性蛋白质样品，迅速振荡混勻，于170rpm复性。复性过程中恒温摇床 的温度也为25°C。活性检测方法应用4-硝基苯基乙酸酯为底物的水解反应，15 μ L复性样 品加入到 ImL 0. 05Μ Tris-HCl，0. 005Μ EDTA，pH 7. 5, and 10 μ L ofO. IM 4-硝基苯基乙酸 酯的乙腈溶液.在400nm波长下检测其吸光值变化。通过0_90s间吸光值升高速率与天然 酶催化条件下的升高速率的比值来计算碳酸酐酶II的活性收率。活性测定温度25°C。采 用本专利所述方法复性，复性液中色谱介质加入量为0. lg/mL。复性完成后自然沉降5min， 取上清，然后向沉降的色谱介质中加入复性缓冲液0. 3mL冲洗，然后lOOOOrpmX Imin离心、 取上清，如此反复三次冲洗，可将复性蛋白质回收近100%。其它条件相同，复性4小时后加 入色谱介质和不加色谱介质的复性收率比较如图10所示。由图可知，在上述实验条件下阴 离子交换色谱介质CM-S印harose Fast Flow的加入可以极大地提高变性碳酸酐酶II的复 性收率，在最终蛋白质浓度达到0. 4mg/mL的浓度的条件下仍然可以获得92%的复性收率， 而不加入色谱介质的复性收率只能达到74%。本发明提出的离子交换色谱介质辅助蛋白质复性的方法及应用，并将其用于变性 蛋白质样品的复性，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离 本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明 技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
权利要求
离子交换色谱介质辅助蛋白质复性方法，其特征在于步骤如下1)采用与蛋白质带有同种电荷的离子交换色谱介质；2)离子交换色谱介质预处理，用盐洗冲掉杂质离子后，再用去离子水冲掉盐溶液；3)将色谱介质加入复性液中，然后再将变性蛋白质加入复性缓冲液开始复性；4)复性完成后，采用离心或重力沉降方法收集上清液；获得复性蛋白溶液。
2.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的的离子交换色谱介质为带有正电 荷的阴离子交换色谱介质或带有负电荷的阳离子交换色谱介质。
3.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的带有正电荷的阴离子交换色谱介 质为 DEAE-Sepharoes Fast Flow 或 Q-Sepharose Fast Flow。
4.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的带有负电荷的阳离子交换色谱介 质为 SP-Sepharose Fast Flow 或 CM-Sepharose Fast Flow。
5.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的复性缓冲液为0.02-0. IM三羟甲 基氨基甲烷、0-0. 003M乙二胺四乙酸二钠和0-2. OM尿素；pH值为7. 5-9.0。
6.如权利要求4或5所述的复性方法，其特征在于所述的复性缓冲液中无机盐含量不 高于0. 05M。
7.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的步骤2)方法是将所选的离子 交换色谱介质移入烧结玻璃漏斗抽滤除去液体后，依次用摩尔浓度为0. 2-2. OM氯化钠溶 液和去离子水各冲洗3-8次，每次冲洗所用的液体体积为离子交换色谱介质沉降体积的 20-30 倍。
8.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的步骤3)方法是复性缓冲液中色 谱介质的浓度为0. 025-0. 5g/mL ；混合物置于温度为20_37°C的恒温水浴中振荡预平衡直 至温度恒定；然后，加入待复性蛋白质溶液，复性液中蛋白的终浓度为0. 07-4mg/mL ；振荡 混勻后，放入恒温水浴中在转速为50-170rpm条件下复性，复性温度与此前复性液预平衡 的温度相同。
9.离子交换色谱介质辅助蛋白质复性应用，其特征是应用于本发明的离子交换色谱介 质辅助蛋白质复性方法，应用于复性过程中易于聚集的蛋白质，包括不含二硫键的蛋白质 和含有二硫键的蛋白质的复性。
全文摘要
本发明涉及离子交换色谱介质辅助蛋白质复性的方法及应用；1)采用与蛋白质带有同种电荷的离子交换色谱介质；2)离子交换色谱介质预处理，用盐洗冲掉杂质离子后，再用去离子水冲掉盐溶液；3)将色谱介质加入复性液中，然后再将变性蛋白质加入复性缓冲液开始复性；4)复性完成后，采用离心或重力沉降方法收集上清液；获得复性蛋白溶液。本发明优点第一采用的添加剂是不溶于水的离子交换色谱介质，不会污染蛋白质；第二采用的添加剂在复性完成后，易与蛋白质分离；第三本发明介绍的离子交换色谱介质复性方法，不需要色谱柱或色谱系统等昂贵的大型设备，操作简单，成本低廉，易于应用于大规模生产。
文档编号C07K1/18GK101948504SQ20101050736
公开日2011年1月19日 申请日期2010年10月14日 优先权日2010年10月14日
发明者史清洪, 孙彦, 王国珍, 董晓燕 申请人:天津大学