一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用与流程

本发明涉及一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法及应用，属于生物技术领域。

背景技术：
香鳞毛蕨(Dryopterisfragrans(L.)Schott)是鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物，主要分布于中国、日本、朝鲜等地，以中国黑龙江省为分布中心，在五大连池地区分布面积较大。香鳞毛蕨主要生长在高寒地区的滑石坡、火山岩浆缝中。王全喜、Momose等对鳞毛蕨科植物的配子体发育进行了大量的研究，但是关于香鳞毛蕨愈伤组织的诱导和再生植株的方法研究尚未见报道。香鳞毛蕨是一种药用植物，对皮肤病具有很好的疗效，具有一定的开发前景，而野生的香鳞毛蕨资源也因其药用价值正遭到严重的破坏。应用蕨类植物孢子进行组织培养，可以建立蕨类植物的快繁体系。在香鳞毛蕨组织培养研究中，由于通过组织培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易产生内生真菌，所以以野生香鳞毛蕨为外植体诱导愈伤很难实现，且愈伤诱导过程中容易产生褐化现象，所以香鳞毛蕨愈伤组织诱导方面尚未报道，并且通过茎尖和幼嫩叶片基部进行愈伤组织诱导也未见报道。

技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，采用的技术方案如下：本发明的目的在于提供一种香鳞毛蕨愈伤组织的诱导方法，该方法是将香鳞毛蕨孢子制备成无菌的孢子悬浮液后接种到改良的Knop′s培养基上，先黑暗处理萌发后进行培养，获得孢子体，将获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖和幼嫩叶片基部作为外植体，接入添加6-BA和NAA的培养基中进行培养，形成绿色小球体；将绿色小球体和孢子体茎尖接种于含有6-BA和2,4-D的培养基中进行增殖分化形成愈伤组织。优选地，所述方法，步骤如下：1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+蔗糖的固体培养基中进行培养，获得孢子体；2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖或幼嫩叶片基部作为外植体，接入1/2MS+6-BA+NAA+蔗糖的固体培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体的茎尖接入1/2MS+6-BA+2,4-D+蔗糖的固体培养基中培养，形成愈伤组织后加入到1/2MS+蔗糖的固体培养基进行分化培养，获得香鳞毛蕨愈伤组织。优选地，所述培养基，pH值为5.7-5.8.优选地，所述培养，温度为25±2℃，光照12h，黑暗12h，光强150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。优选地，步骤1)所述改良的Knop′s培养基，含有NaH2PO40.25g，KNO30.25g，MgSO40.25g，Ca(NO3)21.0g和蒸馏水1000mL。优选地，步骤1)所述1/4MS+蔗糖的固体培养基，为1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。优选地，步骤1)所述1/2MS+蔗糖的固体培养基，为1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。优选地，步骤2)所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L；所述NAA，浓度为0.5mg/L-5.0mg/L。优选地，步骤3)所述6-BA，浓度为0.5mg/L-2.0mg/L。优选地，步骤3)所述2,4-D，浓度为0.5mg/L-1.5mg/L。优选地，步骤3)所述1/2MS+蔗糖的固体培养基，为1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基。优选地，所述方法，步骤如下：1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，获得孢子体；2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖或幼嫩叶片基部作为外植体，接入1/2MS+0.5mg/L～2.0mg/L6-BA+0.5mg/L～5.0mg/LNAA+2.0％蔗糖的固体培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体的茎尖接入1/2MS+0.5mg/L～2.0mg/L6-BA+0.5mg/L～1.5mg/L2,4-D+2.0％蔗糖的固体培养基中培养，形成愈伤组织后加入到1/2MS+3.0％蔗糖的固体培养基进行分化培养，获得香鳞毛蕨愈伤组织。更优选地，所述方法，具体步骤为：1)孢子体的诱导：将香鳞毛蕨的成熟孢子制备成孢子悬浮液后，将孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发后进行培养，待长至原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养，每隔3天向培养基里加入无菌水，每隔3-5周继带一次，80d后获得孢子体；所述改良的Knop′s培养基，含有NaH2PO40.25g，KNO30.25g，MgSO40.25g，Ca(NO3)21.0g和蒸馏水1000mL；2)绿色小球体的诱导：将步骤1)获得的香鳞毛蕨孢子体的茎尖或幼嫩叶片基部作为外植体，接入1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行诱导培养，获得香鳞毛蕨绿色小球体；3)愈伤组织的诱导和增殖：将步骤2)获得的香鳞毛蕨绿色小球体或步骤1)获得的孢子体茎尖接入1/2MS+0.5mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂培养基中培养形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行分化培养，3-4周继代一次；所述培养，温度为25±2℃，光照12h，黑暗12h，光强150～180μmol·m-2·s-1；所述培养基，pH值为5.7-5.8。以上所述任一方法在香鳞毛蕨的愈伤组织培养、无性繁殖以及建立快速繁殖体系中的应用。本发明有益效果：本发明方法克服了通过组织培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易产生内生真菌的问题，实现了以组培香鳞毛蕨孢子体为外植体诱导愈伤，并且降低了愈伤诱导过程中容易产生褐化的现象。本文通过对香鳞毛蕨不同部位诱导产生愈伤组织,为建立香鳞毛蕨的快繁体系奠定了理论及实践依据,从而保护了香鳞毛蕨的野生资源。并且在香鳞毛蕨组织培养研究中，通过茎尖和幼嫩叶片基部进行愈伤组织诱导未见报道。愈伤组织可研究植物生长发育及分化的机制并对蕨类遗传转化具有特殊意义。利于缓解对现有蕨类植物需求的压力，保存蕨类植物种质资源。有助于探讨和阐明蕨类植物生理、遗传等一系列理论问题。因此，蕨类植物组织培养还有待于进一步的研究和探索。附图说明图1为通过野生孢子诱导形成香鳞毛蕨幼苗。图2为香鳞毛蕨茎尖。图3为香鳞毛蕨幼嫩叶。图4为香鳞毛蕨绿色小球体(GGB)图5为香鳞毛蕨愈伤组织。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中的材料方法如下：1.材料和方法1.1试验材料蕨类植物香鳞毛蕨采自黑龙江省五大连池市火山熔岩的岩缝间。1.2培养条件基本培养基为改良的Knop′s配方(NaH2PO40.25g、KNO30.25g、MgSO40.25g、Ca(NO3)21.0g、蒸馏水1000mL)，琼脂浓度为0.7-0.8％。诱导孢子体培养基为MS大量元素、微量元素及有机成分，再添加3.0％的蔗糖和0.7-0.8％的琼脂。蔗糖：天津市科密欧化学试剂有限公司琼脂：购自乘风牌，福建泉州市泉港化工厂附加激素：6-BA(中文名：6-苄基氨基嘌呤；英文名：6-Benzylaminopurine；购自南京助研生物技术有限公司)，2,4-D(中文名：2,4-二氯苯氧乙酸；英文名：2,4-dichlorophenoxyacetec；购自南京助研生物技术有限公司)。NAA(中文名：萘乙酸；英文名：1-naphthlceticacid；购自南京助研生物技术有限公司)。培养基在高压灭菌前用氢氧化钠或盐酸调整pH值为5.7-5.8；培养温度25±2℃，光照12h，黑暗12h，光强约为150～180μmol·m-2·s-1，培养过程中始终保持一定的湿度。实施例1：实验方法如下：1、孢子体的诱导取成熟的孢子置于1.5mL离心管内,滴入无菌水,充分振荡使成悬浮液,4000r/min离心1min,使孢子全部沉淀,弃去上清液。离心管内再滴入约1.0mL的0.1％HgCl2溶液,灭菌1min,无菌水冲洗4～5次,用上述离心方法获得无菌的孢子悬浮液。然后采用不同的培养方法，包括固体培养基培养和液体培养基培养。固体培养基采用1/2MS、1/4MS和改良的Knop′s配方(NaH2PO40.25g、KNO30.25g、MgSO40.25g、Ca(NO3)21.0g、蒸馏水1000mL),琼脂浓度为0.8％。培养基分装三角瓶中,高压灭菌(121℃、20min)后备用。待原叶体长出性器官后每3天用无菌水冲洗,以促进受精。液体培养基培养是将1/2MS、1/4MS和改良Knop′s液体培养基直接分装在三角瓶中,高压灭菌(121℃、20min)后备用。将获得的孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发36h后进行培养，待心脏形原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；培养一段时间待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养并每3天用无菌水冲洗，以促进受精，每隔3-5周继带一次，约80d形成孢子体。2、绿色小球体(GGB)的诱导将获得的香鳞毛蕨孢子体茎尖作为外植体，在无菌条件下接入1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的诱导培养基中，获得香鳞毛蕨GGB，诱导率可达91.67％。3、愈伤组织诱导和增殖将获得的香鳞毛蕨GGB，在无菌条件下接入1/2MS+0.5mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂培养基中进行分化培养，3-4周继代一次，所述培养基，pH值为5.7-5.8。实施例21、孢子体的诱导取成熟的孢子置于1.5mL离心管内,滴入无菌水,充分振荡使成悬浮液,4000r/min离心1min,使孢子全部沉淀,弃去上清液。离心管内再滴入约1.0mL的0.1％HgCl2溶液,灭菌1min,无菌水冲洗4～5次,用上述离心方法获得无菌的孢子悬浮液。然后采用不同的培养方法，包括固体培养基培养和液体培养基培养。固体培养基采用1/2MS、1/4MS和改良的Knop′s配方(NaH2PO40.25g、KNO30.25g、MgSO40.25g、Ca(NO3)21.0g、蒸馏水1000mL),琼脂浓度为0.8％。培养基分装三角瓶中,高压灭菌(121℃、20min)后备用。待原叶体长出性器官后每3天用无菌水冲洗,以促进受精。液体培养基培养是将1/2MS、1/4MS和改良Knop′s液体培养基直接分装在三角瓶中,高压灭菌(121℃、20min)后备用。将获得的孢子悬浮液接种于改良的Knop′s培养基中先黑暗处理同步萌发36h后进行培养，待心脏形原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；培养一段时间待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养并每3天用无菌水冲洗，以促进受精，每隔3-5周继带一次，约80d形成孢子体。将孢子体的茎尖，在无菌条件下接入1/2MS+0.5mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂培养基中进行分化培养，3-4周继代一次，所述培养基，pH值为5.7-5.8。实施例3本实施例与实施例1的区别在于：1、孢子体的诱导：待心脏形原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；培养一段时间待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；2、绿色小球体(GGB)的诱导将获得的香鳞毛蕨孢子体茎尖作为外植体，在无菌条件下接入1/2MS+1.0mg/L6-BA+3.0mg/LNAA+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的诱导培养基中,获得香鳞毛蕨GGB。3、愈伤组织诱导和增殖将获得的香鳞毛蕨GGB，在无菌条件下接入1/2MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基中进行分化培养，3-4周继代一次，所述培养基，pH值为5.7-5.8。实施例4本实施例与实施例1的区别在于：1、孢子体的诱导：待心脏形原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；培养一段时间待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；2、愈伤组织诱导和增殖：将获得的孢子体茎尖，在无菌条件下接入1/2MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2,4-D+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基中进行分化培养，3-4周继代一次，所述培养基，pH值为5.7-5.8。实施例5本实施例与实施例1的区别在于：1、孢子体的诱导：待心脏形原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％琼脂的培养基中进行培养；培养一段时间待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养；2、绿色小球体(GGB)的诱导将获得的香鳞毛蕨孢子体茎尖作为外植体，在无菌条件下接入1/2MS+0.5mg/L6-BA+5.0mg/LNAA+2.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的诱导培养基中,获得香鳞毛蕨GGB。3、愈伤组织诱导和增殖将获得的香鳞毛蕨GGB，在无菌条件下接入1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+2％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂培养基中进行分化培养，3-4周继代一次，所述培养基，pH值为5.7-5.8。实施例6本实施例与实施例1的区别在于：1、孢子体的诱导：待心脏形原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.7％琼脂的培养基中进行培养；培养一段时间待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中进行培养；2、愈伤组织诱导和增殖将获得的孢子体茎尖，在无菌条件下接入1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/L2,4-D+2％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂的培养基中形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3.0％蔗糖+0.7％～0.8％琼脂培养基中进行分化培养，3-4周继代一次，所述培养基，pH值为5.7-5.8。实施例7本实施例与实施例1的区别在于：1、孢子体的诱导：待心脏形原叶体阶段将其接种于1/4MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；培养一段时间待原叶体长出性器官后将其接种于1/2MS+3.0％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中进行培养；2、绿色小球体(GGB)的诱导将获得的香鳞毛蕨孢子体幼嫩叶片基部作为外植体，在无菌条件下接入1/2MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+2％蔗糖+0.8％琼脂的诱导培养基中,获得香鳞毛蕨GGB。3、愈伤组织诱导和增殖将获得的香鳞毛蕨GGB，在无菌条件下接入1/2MS+0.5mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D+2％蔗糖+0.8％琼脂的培养基中形成愈伤组织，然后加入到1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基中进行分化培养，3-4周继代一次，所述培养基，pH值为5.7-5.8。实施例8将实施例1-7效果进行比较，比较结果如表1所示：表1实施例1-7方法效果的对比诱导率％周期d褐化率％实施例191.67309.09实施例2100306.67实施例383.333012实施例486.673011.5实施例566.673025实施例666.673015实施例76.674575从表1可以看出，本发明方法采用茎尖和幼嫩叶片基部作为外植体通过诱导形成绿色小球体进而形成愈伤组织,发现以茎尖能够高效的诱导出绿色小球体，将诱导出的绿色小球体作为外植体通过6-BA和2,4-D能够高效的诱导愈伤组织，并且以孢子体茎尖直接诱导愈伤组织同样能够成功诱导愈伤组织，两种方法周期均较短，30d即可，诱导率高，极大的降低了褐化率，且茎尖的诱导率明显高于幼嫩叶片基部。本发明方法克服了通过组织培养诱导孢子体的过程周期较长，且野生的香鳞毛蕨在诱导过程中容易产生内生真菌的问题，实现了以组培香鳞毛蕨孢子体为外植体诱导愈伤，并且降低了愈伤诱导过程中容易产生褐化的现象。虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。