本发明属于蕨类植物组织培养技术领域，尤其涉及一种粤紫萁可育孢子培养及其繁殖方法。
背景技术：
蕨类植物在作为物种资源和保持生态平衡方面起着重要作用；其次,在研究植物的物种起源、进化和分类方面也极具科学价值；第三,它还有药用、食用、观赏等方面的用途。因此组织培养技术在蕨类植物的研究和生产中得到了广泛的应用。目前在蕨类的组织培养研究中，外植体可采用地下茎段或茎尖、嫩叶或叶原基、孢子等。通常蕨类的地下茎段或茎尖、嫩叶或叶原基都包被鳞片，消毒较难，而且珍稀种类个体数量本身就很少，材料来源本身十分珍贵，因此多采用孢子作为外植体进行繁殖。
粤紫萁(Osmunda mildei C.Chr.)是多年生中型草本蕨类植物，分布仅见于香港、深圳和江西崇义的齐云山，是特有的草本植物，稀少，及其珍贵。但是粤紫萁是一个杂合的二倍体种，孢子完全成熟并自然繁殖接近100％败育。已报道的粤紫萁总数不超过10株，为了扩大该种类的个体数量，达到保育该种的目的，研究出一种适合粤紫萁可育孢子的萌发和组培快繁方法十分必要。
中国专利局公开的专利文献201010594485.3《一种粤紫萁组织培养的方法》采用的是幼嫩茎尖的诱导和繁殖培养，由于粤紫萁总数非常稀少，这种模式或多或少的会伤害原株，造成原株的死亡，导致粤紫萁自然个体的减少，不利于野生个体的保护。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中粤紫萁植物孢子繁殖难的问题，提供一种适合杂合物种粤紫萁的可育孢子萌发和组培快繁方法。
本发明提供的粤紫萁可育孢子培养及其繁殖方法，包含以下步骤：
S1孢子的消毒处理：
3～5月份粤紫萁孢子囊由深绿刚转为淡绿时，将孢子叶片摘下，收集孢子粉，用灭菌水浸泡5-10min，然后倒去上清液，加入0.1％的HgCL2溶液消毒处理2-6min，灭菌水冲洗后加适量灭菌水混匀制成悬浮液；
或者，3～5月份粤紫萁孢子囊由深绿刚转为淡绿时，将每个孢子小叶摘下，用0.1％的HgCL2溶液消毒处理2-6min，灭菌水冲洗后吸干表面水分，切成含2～3个孢子囊的小块；
S2原叶体的获得：
将步骤S1消毒处理的孢子囊小块或孢子粉，接种在MS基本培养基并添加6-苄基嘌呤0.5～1.5㎎/L、萘乙酸0.01～0.1㎎/L，做培养处理，孢子萌发后经过丝状体、片状体逐渐长成原叶体；
S3原叶体中幼孢子体的形成：
将步骤S2所获得的原叶体转入1/2MS、1/4MS培养基中，做培养处理，待原叶体体积明显增大时，再转入相同的固体培养基中培养，形成孢子体幼苗；
S4生根培养及移栽：
将步骤S3产生的孢子体幼苗接种在含吲哚丁酸0.5～1.0㎎/L的培养基中，做培养处理，20d左右长出幼根，待根形成后，继续在原瓶中培养1个月左右，移入盆中栽培。
本发明提供的粤紫萁可育孢子培养及其繁殖方法，取材于粤紫萁植物孢子，利用植物组织培养技术获得大量无性繁殖系，培育出的原叶体和幼孢子体，既不会伤害植物原株，又解决了目前粤紫萁繁殖难的问题，可在短期内快速繁殖粤紫萁幼苗，能够满足研究其濒危机制及物种形成机制的大量取材需要，为拯 救濒危植物粤紫萁作出了贡献；同时由于蕨类植物在城市绿地系统生物多样性中具有重要的作用，尤其是原生蕨类的开发，当绿化需要时短时间内就可以大量生产，将在绿化应用中有广阔的发展前景。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供粤紫萁可育孢子培养及其繁殖方法，主要包括：(1)孢子的消毒处理；(2)原叶体的获得；(3)原叶体中幼孢子体的形成；(4)孢子体幼苗生根培养以及移栽。上述步骤通过选取粤紫萁植物孢子培植原叶体和幼孢子体，解决了目前粤紫萁繁殖难的问题，可在短期内快速繁殖粤紫萁幼苗，有效保护了粤紫萁的稀有资源。
下面结合实施例对本发明做进一步详述。
实施例一：
本实施例包含以下步骤：
S1孢子的消毒处理：
3～5月份粤紫萁孢子叶完全展开，孢子囊开始由深绿色向淡绿转变时，将孢子叶片摘下，立即用清水冲去表面浮尘，待孢子叶表面的水分晾干后，收集孢子粉；或者，将孢子叶置于铺有硫酸纸的培养皿中，放在干燥器中干燥处理后收集孢子粉。然后在超净工作台上，将其放入小试管中，用灭菌水浸泡5-10min，再用3500转/分的离心机离心后倒去上清液，加入0.1％的HgCL2溶液消毒2-6min，灭菌水冲洗5-6次，最后加适量灭菌水混匀制成悬浮液。
该步骤中，以消毒3分钟为最佳，不以观察配子体发育为目的的单纯性增殖培养，用孢子叶直接消毒处理方便操作。
S2原叶体的获得：
将步骤S1消毒处理的孢子粉，接种在MS基本培养基上，添加激素6-苄基嘌呤0.5～1.5㎎/L、萘乙酸0.01～0.1㎎/L，在温度(25±2)℃，光照12～16h/天、光照度1500～2000lx的条件下做培养处理，待孢子萌发后经过丝状体、片状体逐渐长成原叶体。
本步骤中，MS基本培养基为本领域常规培养基，通过在MS基本培养基上组合6-苄基嘌呤和萘乙酸，可促进孢子分裂、生长和发育，有利于孢子的萌发和原叶体的形成。
本步骤还可进一步对上述原叶体采用下述S21步骤进行增值培养。
S21将获得的原叶体接种在MS基本培养基并含有6-苄基嘌呤1.5～2.0㎎/L、萘乙酸0.1～0.5㎎/L的增殖培养基中,进行增殖培养,45d左右转接1次。其增值培养处理过程中，添加6-苄基嘌呤和萘乙酸可进一步提高原叶体的增殖速度，短期内形成大量原叶体，达到快速繁殖的目的。
S3、原叶体中幼孢子体的形成：
步骤S2所获得的原叶体，因增殖数量多，原叶体个体小，不利于性器官的形成，很难再形成孢子体。此时需要转入1/2MS、1/4MS(所述1/2MS、1/4MS为MS基本培养基成分中的大量元素减少为1/2或1/4，其余成分不变)培养基中，在温度(25±2)℃，光照12～16h/天、光照度1500～2000lx的条件下培养，待原叶体体积明显增大，再转入相同的固体培养基(如琼脂培养基)中培养，接种时在固体培养基表面加入1mm左右的灭菌水，以增加精子的移动，便于精子与卵细胞结合，形成孢子体幼苗。经过1个月左右的培养，有30％以上的原叶体形成孢子体幼苗。
本步骤中，孢子体幼苗可直接转入后续移栽步骤或者转入下述步骤S31幼孢子体增殖培养基中进行增殖培养，没有形成幼孢子体的原叶体，可继续转入S2步骤原叶体增殖培养基中进行增殖培养，也可以在1/2、1/4MS继续培养，以便产生更多的孢子体幼苗。
S31幼孢子体的增殖培养：
将步骤S3产生的幼孢子体，接种在含有6-糠基腺嘌呤0.5～1.0㎎/L、萘乙酸0.1㎎/L的孢子体增殖培养基中，在温度(25±2)℃，光照12～16h/d、光照度1500～2000lx的条件下做培养处理，45d左右在其基部就可以诱导出新的幼孢子体。
本步骤中，采用高浓度的6-糠基腺嘌呤和萘乙酸组合，可促使幼孢子体增殖，进一步加快孢子体幼苗的繁殖。
S4生根培养：
将步骤S3或S31产生的幼孢子体接种在含有吲哚丁酸0.5～1.0㎎/L的培养基中，在温度(25±2)℃，光照12～16h/天、光照度1500～2000lx的条件下培养处理，20d左右就可以长出幼根，待根形成后，继续在原瓶中培养1个月左右就可以移栽。
本步骤中，添加吲哚丁酸，可诱导孢子体幼苗根原基的形成，促进根原基的分裂和分化，有利于新根生成和维管束系统的分化，提高幼根的数量，利于幼孢子体移栽成活。
S5移栽：
幼孢子体在相同培养基中继续培养45d左右，即可从培养瓶中取出，洗干净培养基，移入盆中栽培。
所述幼孢子体生根后栽培可采用下述基质：
(1)黄土：腐殖质，其比例为1：1；
(2)河沙：黄土：腐殖质，其比例为1：1：3；
(3)珍珠岩：黄土：腐殖质，其比例为1：1：3。
栽培后，开始可用塑料薄膜遮盖保湿，每天打开塑料薄膜1个小时通风，一周后增加通风时间，20d以后可以完全去除塑料薄膜。
上述三种栽培基质中的幼苗成活率均可以达到90％以上，其中以(2)河沙：黄土：腐殖质配比的栽培基质中的幼苗长势最好。
实施例二：
S1在3～5月份粤紫萁孢子叶完全展开，孢子囊开始由深绿色向淡绿转变时，将孢子叶片摘下，立即用清水冲去表面浮尘，把每个孢子小叶摘下，在超净工作台上，用0.1％的HgCL2溶液消毒2-6min，灭菌水冲洗5-6次，消毒滤纸吸干表面水分，切成含2～3个孢子囊的小块。
该步骤中，以消毒5分钟为最佳，不以观察配子体发育为目的的单纯性增殖培养，用孢子叶直接消毒处理方便操作。
S2原叶体的获得：
将步骤S1消毒处理的孢子囊小块接种在MS基本培养基上，添加激素6-苄基嘌呤0.5～1.5㎎/L、萘乙酸0.01～0.1㎎/L，在温度(25±2)℃，光照12～16h/天、光照度1500～2000lx的条件下做培养处理，待孢子萌发后经过丝状体、片状体逐渐长成原叶体。
本步骤中，MS基本培养基为本领域常规培养基，通过在MS基本培养基上组合6-苄基嘌呤和萘乙酸，可促进孢子囊内的孢子分裂、生长和发育，有利于孢子的萌发和原叶体的形成。
本步骤还可进一步对上述原叶体进行增值培养，其增值培养处理过程中适当提高6-苄基嘌呤和萘乙酸的浓度，具体为：将获得的原叶体接种在MS基本培养基并含有6-苄基嘌呤1.5～2.0㎎/L、萘乙酸0.1～0.5㎎/L的增殖培养基中,进行增殖培养,45d左右转接1次。其增值培养处理过程中，提高6-苄基嘌呤和萘乙酸可进一步提高原叶体的增殖速度，短期内形成大量原叶体，达到快速繁殖的目的。
S3、原叶体中幼孢子体的形成：
步骤S2所获得的原叶体，因增殖数量多，原叶体个体小，不利于性器官的形成，很难再形成孢子体。需要转入1/2MS、1/4MS(所述1/2MS、1/4MS为MS基本培养基成分中的大量元素减少为1/2或1/4，其余成分不变)培养基中，在温度(25±2)℃，光照12～16h/天、光照度1500～2000lx的条件下培养，待 原叶体体积明显增大，再转入相同的固体培养基(如琼脂培养基)中培养，接种时在固体培养基表面加入1mm左右的灭菌水，以增加精子的移动，便于精子与卵细胞结合，形成孢子体幼苗。经过1个月左右的培养，有30％以上的原叶体形成孢子体幼苗。
本步骤中，孢子体幼苗可直接转入后续移栽步骤或者转入幼孢子体增殖培养基中进行增殖培养，没有形成幼孢子体的原叶体，可继续转入原叶体增殖培养基中进行增殖培养，也可以在1/2、1/4MS继续培养，以便产生更多的孢子体幼苗。
S31幼孢子体的增殖培养：
将步骤S3产生的幼孢子体，接种在含有6-糠基腺嘌呤0.5～1.0㎎/L、萘乙酸0.1㎎/L的孢子体增殖培养基中，在温度(25±2)℃，光照12～16h/d、光照度1500～2000lx的条件下做培养处理，45d左右在其基部就可以诱导出新的幼孢子体。
本步骤中，采用高浓度的6-糠基腺嘌呤和萘乙酸组合，可促使幼孢子体增殖，进一步加快孢子体幼苗的繁殖。
S4生根培养：
将步骤S3或S31产生的孢子体幼苗接种在含有吲哚丁酸0.5～1.0㎎/L的培养基中，在温度(25±2)℃，光照12～16h/天、光照度1500～2000lx的条件下培养处理，20d左右就可以长出幼根，待根形成后，继续在原瓶中培养1个月左右就可以移栽。
本步骤中，添加吲哚丁酸，可诱导孢子体幼苗根原基的形成，促进根原基的分裂和分化，有利于新根生成和维管束系统的分化，提高幼根的数量，利于幼孢子体移栽成活。
S5移栽：
幼孢子体在相同培养基中继续培养45d左右，即可从培养瓶中取出，洗干净培养基，移入盆中栽培。
所述幼孢子体生根后栽培可采用下述基质：
(1)黄土：腐殖质，其比例为1：1；
(2)河沙：黄土：腐殖质，其比例为1：1：3；
(3)珍珠岩：黄土：腐殖质，其比例为1：1：3。
栽培后，开始可用塑料薄膜遮盖保湿，每天打开塑料薄膜1个小时通风，一周后增加通风时间，20d以后可以完全去除塑料薄膜。
上述三种栽培基质中的幼苗成活率均可以达到90％以上，其中以(2)河沙：黄土：腐殖质配比的栽培基质中的幼苗长势最好。
综上所述，本发明上述实施例所示仅为本发明较佳实施例之部分，并不能以此局限本发明，在不脱离本发明精髓的条件下，本领域技术人员所作的任何修改、等同替换和改进等，都属本发明的保护范围。