本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法。
背景技术：
黄梁木(Neolamarckia cadamba)别名团花树，属茜草科团花属常绿阔叶乔木，在我国的华南地区广泛分布(Ouyang et al,2013)。高可达35m，胸径可达1m，树干通直圆满，10年左右成材，胸径可达40～50cm，衰退期晚，适合于培养大径级用材，5年以前为高生长期，年平均高生长量达3.0～3.5m，5～10年为直径生长旺期，年平均生长量达3～4cm(邓小梅等，2011)。由于其生长十分快速，在菲律宾被称颂为“宝石树”(Fox,1971)，并在1972年的世界林业大会上被称为“奇迹树”。黄梁木材质良好，其木材淡黄色，纹理通直，锯刨切削容易，顺纹刨面光滑，且干燥快，不易开裂变形；可作家具、建材等，同时也是人造纤维、纤维板、胶合板等工业的理想原料。目前，黄梁木种苗主要通过种子播种方式繁育，存在周期长、成本高、效率低下等问题；种子播种虽然容易获得大量幼苗，然而经种子繁育的后代易发生性状分离，遗传性状不稳定，易丢失亲本的优良性状；黄梁木的种子也不耐贮藏，一年后种子活力就下降50％，随着贮藏时间延长，种子萌发率越来越低。因此，釆用植物组织培养技术来缓解其种苗紧张压力、进行可持续开发利用是十分必要的。
关于黄梁木的组织培养，国内外已有的报道分别为：1)用带芽茎段扩繁，但扩繁的速度慢、效率低，远不及通过不定芽诱导；2)以子叶和下胚轴为外植体，通过不定芽诱导构建再生体系，但这些材料过于幼嫩，在建立遗传转化体系过程中易损伤、操作不便，并且以此材料进行转基因功能研究时，缺少遗传背景一致的对照植株，不能准确验证基因功能。
技术实现要素：
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法。该方法以叶片为外植体，操作更简便、取材更广泛、扩繁更高效。通过诱导不定芽、丛生芽增殖、试管苗生根、炼苗移栽等阶段成功获得了黄梁木离体再生植株，建立黄梁木高效再生体系。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法，包括如下步骤：
(1)不定芽的诱导：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去边缘并横向切2～3刀增加伤口；接种到诱导培养基上，于25～28℃条件下全暗培养3～4天，再转移至光照强度为1500～2500lx，光照时间12～15小时，培养温度为25～28℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽；诱导率可达89％以上。
(2)继代培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照13～15小时，光照强度为2000～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养。增殖系数达7.42～8.13。
步骤(1)中所述的诱导培养基为：MS+0.1～0.3mg/L TDZ+0.5～1.5mg/L 2,4-D+1.0～3.0mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8；
步骤(2)中所述的增殖培养基为：MS+2.0～4.0mg/L 6-BA+0.5～2.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
为了更好的实现本发明，还包括如下步骤：
(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25～28℃条件下全暗培养3～5天，然后置于每天光照12～15小时，光照强度为1500～2500lx，培养温度为25～28℃的条件下培养至生根；生根率可达96％以上。
(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗3～5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由泥炭土基质中并定植于塑料盆中。
步骤(3)中所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～1.5mg/L IBA+0.5～1.5mg/L GGR+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
本发明的机理是：本发明利用植物组织培养技术进行黄梁木种苗规模化生产，建立了黄梁木的组织培养快繁方法，具有简单、易行、经济的特点。通过本发明育成的黄梁木组培苗移栽成活率达到98％以上，可以为黄梁木规模化种植提供优质种苗保障。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明以叶片作为外植体有其巨大的优势，取材方便、操作容易、来源广泛，有利于再生及遗传转化的重复进行等。因此，本发明以黄梁木无菌苗嫩叶为外植体，通过不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等过程成功获得了黄梁木离体再生植株，建立黄梁木高效再生体系，对于进行黄梁木优良品种的快速繁殖和大面积推广、促进黄梁木的产业化发展具有重要意义，并且为黄梁木遗传转化体系的构建奠定了基础，从而为在黄梁木中进行基因功能等分子生物学研究提供平台。
附图说明
图1是本发明的以黄梁木叶片为外植体的高效再生过程；其中，图A为继代无菌苗的嫩叶片，用于本发明中的外植体材料；图B和C为在MS+0.1～0.3mg/L TDZ+0.5～1.5mg/L 2,4-D+1.0～3.0mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8的芽诱导培养上培养直至长出不定芽；图D为在MS+2.0～4.0mg/L 6-BA+0.5～2.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8的增殖培养基上培养丛生芽；图E为在1/2MS+0.5～1.5mg/L IBA+0.5～1.5mg/L GGR+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8的生根培养基上诱导出根；图F为炼苗成活的黄梁木植株。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去边缘并横向切2～3刀增加伤口。接种到诱导培养基上，于25℃条件下全暗培养3天，再转移至光照强度为1500lx，光照时间12小时，培养温度为25℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达92.7％。所述的诱导培养基为：MS+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.5；
(2)继代培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，培养温度为25℃的条件下培养，20天转接一次，增殖系数为7.64。所述的增殖培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH为5.5；
(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在25℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照12小时，光照强度为1500lx，培养温度为25℃的条件下培养7天即开始生根，生根率可达96.2％。所述的生根培养基为：1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L GGR(注：双吉尔-GGR，购自北京艾比蒂研究开发中心)+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4；
(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中，移栽成活率为100％。
实施例2
(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去边缘并横向主叶脉切3刀增加伤口。接种到诱导培养基上，于26℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为2000lx，光照时间13小时，培养温度为26℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达95.4％。所述的诱导培养基为：MS+0.2mg/L TDZ+1.0mg/L 2,4-D+2.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4；
(2)继代培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照14小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养，25天转接一次，增殖系数为8.13。所述的增殖培养基为：MS+3.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8；
(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在26℃条件下全暗培养4天，然后置于每天光照15小时，光照强度为2000lx，培养温度为26℃的条件下培养10天即开始生根，生根率可达97％。所述的生根培养基为：1/2MS+1.5mg/L IBA+1.0mg/L GGR(注：双吉尔-GGR，购自北京艾比蒂研究开发中心)+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂，pH为5.8；
(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗4天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中，移栽成活率为100％。
实施例3
(1)诱导不定芽：选取继代无菌苗的嫩叶为外植体，除去边缘并横向主叶脉切3刀增加伤口。接种到诱导培养基上，于28℃条件下全暗培养4天，再转移至光照强度为2500lx，光照时间15小时，培养温度为28℃的条件下培养，直至诱导形成不定芽，不定芽诱导率可达89.1％。所述的诱导培养基为：MS+0.3mg/L TDZ+1.5mg/L 2,4-D+3.0mg/L IBA+15g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.4；
(2)继代培养：将步骤(1)获得的不定芽从基部切下，接种到增殖培养基上进行继代培养，接种后置于每天光照15小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养，20天转接一次，增殖系数为7.42。所述的增殖培养基为：MS+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8；
(3)生根培养：将步骤(2)继代培养长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根，接种后先在28℃条件下全暗培养5天，然后置于每天光照14小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养7天即开始生根，生根率可达100％。所述的生根培养基为：1/2MS+1.0mg/L IBA+1.5mg/L GGR(注：双吉尔-GGR，购自北京艾比蒂研究开发中心)+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8；
(4)炼苗移栽：将长至6～8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗3天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中，移栽成活率为98％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。