本发明涉及植物组织培养与快速繁殖方法，具体涉及一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法。
背景技术：
杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用植物，以其干燥假鳞茎入药。杜鹃兰假鳞茎含有生物碱、黄烷酮类、苷元、菲类等成分，内用具有抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等功效，外用可治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等。
杜鹃兰自然有性繁殖困难，在长期演化过程中适应了假鳞茎的营养繁殖，逐年产生的假鳞茎形成假鳞茎串，但每年仅由最新的假鳞茎发芽长成新植株、形成一个新假鳞茎，故繁殖系数极低。在人工种植中，可将假鳞茎串分株繁殖，虽在一定程度上提高了繁殖系数，但依然无法实现其规模化生产。通过人工授粉虽可获得种子，但其种胚败育，难以自然萌发成苗。加之人们长期的掠夺式采挖，导致杜鹃兰野生资源日渐枯竭，研究其有效的繁殖技术迫在眉睫。
技术实现要素：
本发明提供了一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法，该方法能够有效地提高杜鹃兰的繁殖系数，缩短其生长周期，为实现其工厂化育苗与药材规模化生产奠定了基础。
本发明采用的技术方案：首先以杜鹃兰种子无菌萌发获得的原球茎作为外植体材料，然后通过组织培养获得适于诱导芽簇的原球茎，再通过对基本培养基、蔗糖浓度、植物生长调节物质等的筛选及优化，建立原球茎诱导芽簇的适宜条件，最后以芽簇增殖培养批量生产试管苗，经炼苗、移栽，获得大量健壮的杜鹃兰植株。
具体步骤如下：
步骤1：采用人工授粉获得的杜鹃兰种子经培养基无菌萌发获得的原球茎为外植体；
步骤2：将步骤1中的外植体接种于原球茎增殖培养基上，置于温度15℃、光照时间12h·d-1、光照强度2000 lx的光照培养箱内培养，40d后原球茎颜色由白色转为黄绿色，形成簇状原球茎且表面有白色毛状物；
步骤3：挑选步骤2中生长健壮的原球茎，以不含蔗糖1/4MS、1/2MS或MS为基本培养基，分别添加TDZ 1.5～2.5mg·L-1+NAA0.1～0.3mg·L-1+蔗糖10～30g·L-1进行培养，培养温度为(25±2)℃，其他培养条件同步骤2，30d后原球茎分化形成芽簇；
步骤4：将步骤3中诱导形成的芽簇分割成两部分，一部分是芽簇中未分化的原球茎，将其接入步骤3中芽簇诱导培养基中继续诱导芽簇形成；另一部分是基部明显膨大且具有分化成苗趋势的原球茎，将其接入生根培养基进行生根培养，30d后形成具有3～5条长为2～3cm根的健壮杜鹃兰幼苗，培养条件同步骤3；
步骤5：将步骤4中成功诱导生根的健壮杜鹃兰幼苗转至炼苗室，3～5d后，打开封口膜取出幼苗，洗净幼苗根上附着的培养基，并吸干水分，然后用800倍多菌灵溶液浸泡其根5min，移栽到苗床上，喷水保湿，2个月后移栽上盆，即获得生长健壮的杜鹃兰植株。
作为优选方案，步骤3中选取生长健壮的原球茎，以不含蔗糖的1/4MS为基本培养基，外加TDZ 1.5mg·L-1+NAA 0.3mg·L-1+蔗糖20g·L-1，培养温度为(25±2)℃。
本发明达到的有益效果：
由于杜鹃兰自然繁殖方式为假鳞茎营养繁殖，其生长周期长、繁殖系数低、种质退化严重等问题，无法满足其药材市场的需求。本发明通过原球茎诱导芽簇，在短时间内培育出大量生长健壮可供移栽的杜鹃兰幼苗，为实现杜鹃兰工厂化育苗与药材规模化生产奠定了基础。
附图说明
图1展示了杜鹃兰原球茎诱导芽簇形成的过程；图1中，A：原球茎；B：增殖的原球茎；C：原球茎分化形成的芽簇；D：芽簇分化形成的早期试管苗；E：生根的试管苗。
具体实施方式
实施例1：原球茎增殖培养
本发明中的植物材料杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don.)Makino]采自贵州省黔东南州，盆栽后通过人工授粉获得种子，将种子经培养基无菌萌发得到原球茎。
将种子萌发的原球茎作为外植体，接种于1/2MS基本培养基+6-BA 1.0mg·L-1+IBA 1.0mg·L-1+活性炭0.5g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂5.5g·L-1的增殖培养基上培养。培养周期40d，每隔10d观察记录一次原球茎的生长情况，培养温度15℃。培养约15d后原球茎由白色变为黄绿色，培养40d后原球茎增殖现象明显，形成簇状原球茎且原球茎表面有许多白色毛状物。
实施例2：芽簇诱导培养
选取实施例1中生长势好的簇状原球茎，接种于添加不同种类及浓度的植物生长调节物质、不同浓度蔗糖及不同基本培养基1/4MS、1/2MS或MS，采用TDZ、NAA、蔗糖、基本培养基4因素3水平正交试验，除培养温度为(25±2)℃外，其他培养条件同实施例1。30d后统计芽簇诱导增殖系数(其中，芽簇增殖系数＝接种后芽数/接种前芽数)，考查不同处理对原球茎诱导芽簇形成的影响。结论：原球茎诱导芽簇培养基以1/4MS+TDZ 1.5mg·L-1+NAA 0.3mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂5.5g·L-1效果较好(表1)，在该培养基中原球茎分化程度高，且分化形成的芽簇颜色鲜绿，长势好。
表1不同处理组合对杜鹃兰原球茎诱导芽簇的影响
注：表中不同大写字母表示两者具有极显著差异(P<0.01)。
实施例3：芽簇增殖继代培养
将实施例2中诱导形成的芽簇分割成两部分，一部分是芽簇中未分化的原球茎，将其接入上述实施例2中芽簇诱导培养基中继续芽簇诱导形成，30d后未分化原球茎基部萌发出新芽点，且有部分新芽叶片开始伸展，可进行重新分割继代培养；另一部分是有明显膨大的假鳞茎且具有分化成苗趋势的原球茎，将这部分材料接入生根培养基1/4 MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+活性炭0.5g·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂5.5g·L-1中进行生根培养，15d后叶片展开、有根冒出，直至30d后长出3～5条长为2～3cm根的健壮杜鹃兰幼苗，培养条件同实施例2。
实施例4：炼苗移栽
将实施例3中成功诱导生根的健壮杜鹃兰幼苗转至炼苗室，3～5d后，打开封口膜取出幼苗，洗净幼苗根上附着的培养基，并吸干水分，然后用800倍多菌灵溶液浸泡其根5min，移栽到苗床上，喷水保湿，2个月后移栽上盆，即获得生长健壮的杜鹃兰植株。
本发明较好地解决了杜鹃兰种苗繁殖系数低、生长缓慢、生产周期长等问题，为实现其工厂化育苗与药材规模化生产奠定了良好的基础。应当指出的是：对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些变形和改进都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。