一种提高水蛭体内水蛭甲素含量的方法与流程

本发明涉及一种提高水蛭体内水蛭甲素含量的方法，属于农副产品养殖领域。通过模拟冬眠环境使水蛭活体处于冬眠状态，从而提高了水蛭体内水蛭甲素的含量，可为市场提供更优质的水蛭药材。

背景技术：

水蛭为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，夏、秋两季捕捉，用沸水烫死，晒干或低温干燥，其味咸、苦，性平，归肝经，有小毒。中医认为，水蛭具有破血通经，逐瘀消瘕的作用，在治疗中风偏瘫、跌打损伤、癥瘕痞块、血瘀经闭，以及高血压、血瘀、闭经等方面具有显著的疗效。现代研究表明，水蛭不仅具有抗凝、溶栓、抗纤维化的作用，而且还可以改善局部血液循环、提高免疫力、改善肾功能、促进血管新生等，对肿瘤细胞也有一定抑制及杀灭作用，在临床上有着广泛的应用。

研究表明，水蛭中主要含有两类成分，一类是以水蛭素为代表的多肽及蛋白类大分子成分，另一类是蝶啶类等小分子活性成分。近年来，国内外许多学者对水蛭的药理作用及活性成分进行了深入研究，但这些研究多数集中在水蛭素类的多肽成分，对水蛭中小分子活性成分的研究鲜有报道。水蛭素在干燥状态下稳定存在，但在80℃下加热15min后即被破坏，且水蛭素仅存在于水蛭的唾液腺中，含量甚微。

应该注意到，临床使用的水蛭大多为干品及其炮制品，炮制方法包括清炒、砂烫、石灰炒、滑石粉烫、蜜炙、米炒等。研究表明，水蛭在炮制或干燥过程中水蛭素已被破坏，水蛭素仅存在其鲜品中，因此中药水蛭所具有的破血逐瘀作用，是否建立在水蛭素的基础上，尚需深入研究。基于此，发明人对水蛭中的小分子成分进行了研究，发现了具有抗缺氧活性的蝶啶类杂环新化合物，水蛭甲素即是其中一个代表。

《中国药典》2015年版一部规定水蛭的捕捉时间为夏、秋二季，用沸水烫死，晒干或低温干燥。发明人意外发现，捕捉后的活体水蛭经低温冷藏后，其水蛭甲素含量会大幅升高，究其原因是水蛭在环境温度低于10℃时会进入冬眠状态，冬眠状态的活体水蛭在受到外界低温刺激的情况下，机体在本能地适应外部环境的过程中，其体内水蛭甲素含量也会升高。为提高夏、秋二季捕捉的水蛭中水蛭甲素含量，发明人采用人工冬眠的方法，提高了水蛭中水蛭甲素的含量，可为市场提供更优质的水蛭药材。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高水蛭中水蛭甲素含量的方法，具体是将水蛭置于低温清水中，使水蛭人工冬眠，以提高水蛭体内水蛭甲素含量。动物的冬眠行为是一项对付不利环境的保护性行动，引起动物冬眠的主要因素是环境温度的降低。当周围环境温度在15℃以下时，即可引起变温动物的冬眠现象。

本发明一种提高水蛭体内水蛭甲素含量的方法，包括以下步骤：

1)将活体水蛭置于低温清水中人工冬眠；

2)每隔3-8天更换一次低温清水。

优选地，步骤1)所述水蛭为水蛭科动物蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)、水蛭科动物日本医蛭(Hirudo nipponica Whitman)。

优选地，步骤1)所述低温清水的温度为0℃～10℃，最优为0℃～5℃时。

优选地，步骤1)所述人工冬眠的时间为5～90天，最佳为15～45天。

步骤2)中，所述每隔3-8天更换一次低温清水是指同温度的低温清水，目的是提供充足的氧气，保证水蛭的存活。

优选地，步骤2)每隔5天更换一次低温清水。

与现有技术相比，本发明方法打破了自然条件的限制，首次采用人工冬眠的方式刺激活体水蛭产生更多的有效成分，尤其是产生更多的水蛭甲素。用本方法对活体水蛭进行人工冬眠后，其水蛭干品中水蛭甲素的含量比没有经过人工冬眠的同一批次水蛭干品最多可提高0.178mg/g，从而大幅提高了水蛭药材的品质。本发明水蛭人工冬眠方法操作简单，成本低廉，条件可控，具很强的实用性。

附图说明

图1为水蛭甲素对照品的高效液相色谱图；

图2为水蛭样品的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1 蚂蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、蚂蝗人工冬眠

1)将活体蚂蝗置于5℃的清水中人工冬眠30天；

2)每隔3天更换一次温度为5℃的清水。

将冬眠后的蚂蝗加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.05％三氟乙酸溶液＝8：92为流动相；检测波长为354nm。理论板数按水蛭甲素峰计算应不低于3000。

对照品溶液的制备 精密称取于60℃干燥至恒重的水蛭甲素对照品适量，精密称定，用流动相制成每1ml约含0.005mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备 取本品适量，打粉过40目筛，称取2.0g，置于50ml容量瓶中，加入50％甲醇定容至刻度，超声(功率250W，频率50kHz)提取30min，冷却后用甲醇补足损失，离心(10000rpm)10min，滤过，取续滤液，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算，即得。水蛭甲素对照品及样品测定的HPLC图谱分别见图1、图2。

经测定，样品中水蛭甲素的含量为0.297mg/g。

实施例2 日本医蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、日本医蛭人工冬眠

1)将活体日本医蛭置于0℃的清水中人工冬眠5天；

2)每隔3天更换一次温度为0℃的清水。

将冬眠后的日本医蛭加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.172mg/g。

实施例3 日本医蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、日本医蛭人工冬眠

1)将活体日本医蛭置于2℃的清水中人工冬眠10天；

2)每隔4天更换一次温度为2℃的清水。

将冬眠后的日本医蛭加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.213mg/g。

实施例4 蚂蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、蚂蝗人工冬眠

1)将活体蚂蝗置于4℃的清水中人工冬眠30天；

2)每隔5天更换一次温度为4℃的清水。

将冬眠后的蚂蝗加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.301mg/g。

实施例5 蚂蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、蚂蝗人工冬眠

1)将活体蚂蝗置于3℃的清水中人工冬眠12天；

2)每隔4天更换一次温度为3℃的清水。

将冬眠后的蚂蝗加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.238mg/g。

实施例6 日本医蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、日本医蛭人工冬眠

1)将活体日本医蛭置于7℃的清水中人工冬眠30天；

2)每隔6天更换一次温度为7℃的清水。

将冬眠后的日本医蛭加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.312mg/g。

实施例7 蚂蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、蚂蝗人工冬眠

1)将活体蚂蝗置于10℃的清水中人工冬眠45天；

2)每隔7天更换一次温度为10℃的清水。

将冬眠后的蚂蝗加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.338mg/g。

实施例8 日本医蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、日本医蛭人工冬眠

1)将活体日本医蛭置于6℃的清水中人工冬眠40天；

2)每隔3天更换一次温度为6℃的清水。

将冬眠后的日本医蛭加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.326mg/g。

实施例9 日本医蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、日本医蛭人工冬眠

1)将活体日本医蛭置于9℃的清水中人工冬眠50天；

2)每隔8天更换一次温度为9℃的清水。

将冬眠后的日本医蛭加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.342mg/g。

实施例10 蚂蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、蚂蝗人工冬眠

1)将活体蚂蝗置于10℃的清水中人工冬眠75天；

2)每隔5天更换一次温度为10℃的清水。

将冬眠后的蚂蝗加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.356mg/g。

实施例11 蚂蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、蚂蝗人工冬眠

1)将活体蚂蝗置于5℃的清水中人工冬眠80天；

2)每隔4天更换一次温度为5℃的清水。

将冬眠后的蚂蝗加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.362mg/g。

实施例12 蚂蝗人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、蚂蝗人工冬眠

1)将活体蚂蝗置于8℃的清水中人工冬眠90天；

2)每隔3天更换一次温度为8℃的清水。

将冬眠后的蚂蝗加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.367mg/g。

实施例13 日本医蛭人工冬眠及水蛭甲素含量的测定

1、日本医蛭人工冬眠

1)将活体活体日本医蛭置于10℃的清水中人工冬眠60天；

2)每隔5天更换一次温度为10℃的清水。

将冬眠后的日本医蛭加工成干品，备用。

2、水蛭甲素含量的测定

按实施例1所述的HPLC条件进行测定，样品中水蛭甲素的含量为0.350mg/g。

实施例14 不同人工冬眠时间蚂蝗中水蛭甲素含量比较

1、试验材料

同一批活体蚂蝗，平均分成7份，每份1.0kg。

2、试验方法

将上述活体蚂蝗分别放于4℃清水中人工冬眠0天、10天、20天、30天、40天、50

天和60天，每隔6天更换一次温度为4℃的清水，人工冬眠结束按相同的方法加工成

干品，备用。

3、水蛭甲素含量的测定

取上述7份蚂蝗干品样品，每份随机抽取3份平行样，按实施例1所述的HPLC条件测定其水蛭甲素的含量，结果见表1。

表1不同人工冬眠时间蚂蝗中水蛭甲素含量比较

由表1可以看出，人冬眠时间越长，指标成分水蛭甲素的含量越高，但在40天以后提高的速度放缓，考虑生产效率及生产时间成本，一般人工冬眠时间控制在60天(2个月)以内比较适宜。

实施例15 不同人工冬眠时间日本医蛭中水蛭甲素含量比较

1、试验材料

同一批活体日本医蛭，平均分成7份，每份1.0kg。

2、试验方法

将上述活体日本医蛭分别放于7℃清水中人工冬眠0天、5天、10天、20天、30天、60天和80天，每隔4天更换一次温度为7℃的清水，人工冬眠结束按相同的方法加工成干品，备用。

3、水蛭甲素含量的测定

取上述7份日本医蛭干品样品，每份随机抽取3份平行样，按实施例1所述的HPLC条件测定其水蛭甲素的含量，结果见表2。

表2不同人工冬眠时间日本医蛭中水蛭甲素含量比较

由表2可以看出，人冬眠时间越长，指标成分水蛭甲素的含量越高，但在40天以后提高的速度放缓，考虑生产效率及生产时间成本，一般人工冬眠时间控制在60天(2个月)以内比较适宜。