本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种褐变率低的蝴蝶兰组培方法。
背景技术：
蝴蝶兰是当前国际花坛的名花，属于兰科蝴蝶兰属植物，原产地主要是亚热带、热带，天然分布在大洋洲、亚洲。蝴蝶兰具有观赏期长、色泽丰富、花色秀丽以及体态优美轻盈等特点，也被人们称为“洋兰皇后”，在兰科植物中是一种最普及、最广泛的栽培种类，具有很高的商业价值，是国际四大观赏热带兰的一种。蝴蝶兰是单茎性气生兰，侧枝发育非常少，因此很难常规进行分株繁殖，而且很少形成种子，种子发育也比较困难，基本上在自然条件下萌发的难度比较大，因此蝴蝶兰高效繁殖的主要手段就是组织培养。
但是在蝴蝶兰组织培养过程中，褐变现象严重困扰着蝴蝶兰的种苗生产，褐变产物不仅使蝴蝶兰外植体、细胞、培养基褐变，而且抑制蝴蝶兰外植体正常的生理生化反应，抑制原球茎的启动、生长以及蝴蝶兰小苗的再生，严重影响着蝴蝶兰外植体的进一步分化，最后甚至导致蝴蝶兰外植体的死亡。蝴蝶兰在组培过程中出现的褐变现象，是蝴蝶兰外植体在组织培养时，蝴蝶兰外植体从自身表面向培养基中释放了一些褐色物质，使培养基逐渐变成褐色，褐色的培养基会抑制蝴蝶兰外植体的活力，影响相关酶的活性，又反过来对蝴蝶兰的外植体产生毒害，严重时会影响蝴蝶兰外植体的进一步分化，最后导致蝴蝶兰外植体褐变死亡的现象。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种褐变率低的蝴蝶兰组培方法，从而降低蝴蝶兰在组培过程中的褐变率，增大了成苗率，增加了工作效率。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种褐变率低的蝴蝶兰组培方法，包括以下步骤：
(1)材料选取：选取生长期为45d且无病虫害长势良好的蝴蝶兰花梗，采用花梗为外植体进行组织培养；
(2)材料制作：将花梗切成带腋芽的3cm节段，节上平切，节下呈45°斜切；
(3)材料消毒：用软刷毛将选取的蝴蝶兰花梗在水池中进行初步清洗，去除表面的泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗60min，用蜡封蝴蝶兰花梗伤口，将蝴蝶兰花梗置于超净工作台上用经高温灭菌过的体积分数为75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗5次，然后用质量分数为0.1％的氯化汞溶液加4～5滴吐温-20消毒12min，消毒后用无菌水冲洗6～8次，用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中备用；
(4)材料预处理：将消毒后的蝴蝶兰花梗进行高温处理，温度为45℃，时间为10min，然后无菌条件下常温放置48h；
(5)诱导培养：将预处理后的蝴蝶兰花梗，接种在诱导培养基中进行培养，先进行7d的暗培养，然后每天增加2小时的光照时间进行光培养，直到每天光照时间为12h/d为止，光照强度为1300～1500lx；前7～14d采用低温培养，培养温度为15～25℃，低温培养后，采用常温培养，培养温度为25～28℃；所述诱导培养基为：MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+10～15％椰汁+290～310mg/L柠檬酸+1～2g/L活性炭，pH值为5.4～5.5；
(6)增殖培养：将诱导培养后的蝴蝶兰花梗转移至增殖培养基中，先进行7d的暗培养，然后每天增加2小时的光照时间进行光培养，直到每天光照时间为12h/d为止，光照强度为1300～1500lx；前7～14d采用低温培养，培养温度为15～25℃，低温培养后，采用常温培养，培养温度为25～28℃；所述增殖培养基为：MS+1～2mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+10～15％椰汁+290～310mg/L柠檬酸+1～2g/L活性炭，pH值为5.4～5.5；
(7)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入生根培养基中，所述生根培养基为：MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+10～15％椰汁+8～12％香蕉汁+7～10％土豆泥，pH值为5.4～5.5；培养条件：培养温度25～28℃，光照时间为13h/d，光照强度为1300～1500lx；
(8)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。
如上所述的一种褐变率低的蝴蝶兰组培方法，进一步说明为，所述诱导培养基为：MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L琼脂+13％椰汁+300mg/L柠檬酸+1.5g/L活性炭。
如上所述的一种褐变率低的蝴蝶兰组培方法，进一步说明为，所述增殖培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L琼脂+13％椰汁+300mg/L柠檬酸+1.5g/L活性炭。
如上所述的一种褐变率低的蝴蝶兰组培方法，进一步说明为，所述生根培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L琼脂+13％椰汁+10％香蕉汁+9％土豆泥。
本发明的有益效果是：通过采用本方法使组培过程中褐变率低，苗株成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养蝴蝶兰提供了技术支持。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施方式做进一步的阐述。
如图1所示，本发明提供的一种褐变率低的蝴蝶兰组培方法，包括以下步骤：材料选取、材料制作、材料消毒、材料预处理、诱导培养、增殖培养、壮苗生根和移栽，通过本方法能够降低蝴蝶兰在组培过程中的褐变率，增大成苗率，
下面对方法中的每个步骤做详细阐述。
(1)材料选取：选取生长期为45d且无病虫害长势良好的蝴蝶兰花梗，采用花梗为外植体进行组织培养；采用无病虫害长势良好的蝴蝶兰花梗能够降低苗株的发病率，保证在组培过程中不受其他因素的干扰，增加外植体成活率。选用生长期不同的蝴蝶兰花梗对组培过程中褐变现象也会有一定的影响，表1为不同生长期的蝴蝶兰花梗组织培养过程中的褐变影响：
表1不同生长期的蝴蝶兰花梗组织培养过程中的褐变影响
将表1中不同生长期的花梗放置在相同的培养基中进行培养，外部培养条件均一致，从表1中可以看出生长期为30d的蝴蝶兰花梗褐变率较其他组偏低，45d次之，随着蝴蝶兰花梗生长期的增加，褐变率也相应增加，说明蝴蝶兰花梗组织培养的褐变率和它的生长期有着密切关系，但是由于生长期为30d的蝴蝶兰花梗组织成熟度不高，使组织培养后的外植体生长状况较差，所以从褐变率和生长状况两方面因素综合考虑，选用生长期为45d且无病虫害长势良好的蝴蝶兰花梗作为外植体。
(2)材料制作：将花梗切成带腋芽的3cm节段，节上平切，节下呈45°斜切；
表2不同长度的节段在组织培养中的褐化表现
将表2中不同长度的花梗节段放置在相同的培养基中进行培养，外部培养条件均一致，接种数一致，从表2中可以看出外植体进行不同长度的切段进行组织培养时，长度为3cm的节段褐变率最低，随着时间的增加，褐变增长速率也较慢，而长度较小的两组，褐变率及其增长速率与3cm长度一组相比都偏大，这种现象说明了蝴蝶兰花梗作为外植体切取使不易太小，切取的外植体越小，切面与体积的比率越大，对蝴蝶兰外植体的伤害也就越大，从而导致褐变程度也越大，同时切段过小，也容易造成死芽现象。而随着切取长度的增加，褐变率也增加，由于节段的增加，使的蝴蝶兰外植体不易灭菌，带菌率高，也增加了蝴蝶兰组织培养过程中的褐变率。因此将花梗切成带腋芽的3cm节段，能有效降低褐变率。节下呈45°斜切，可以将外植体向下插在培养基上，同时增大切面，可以提高吸收效果。
(3)材料消毒：用软刷毛将选取的蝴蝶兰花梗在水池中进行初步清洗，去除表面的泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗60min，用蜡封蝴蝶兰花梗伤口，将蝴蝶兰花梗置于超净工作台上用经高温灭菌过的体积分数为75％的酒精消毒30s，再用无菌水冲洗5次，然后用质量分数为0.1％的氯化汞溶液加4～5滴吐温-20消毒12min，消毒后用无菌水冲洗6～8次，用消毒滤纸吸干表面水分后放置于培养皿中备用；
表3不同消毒时间处理后的外植体在组织培养中的褐变现象
将表3中消毒时间不同的花梗节段放置在相同的培养基中进行培养，外部培养条件均一致，接种数一致，从表3中可以看出消毒12min的一组褐变率及褐变率增长的速率值最低，其他组与之比较都有些偏大，所以采用质量分数为0.1％的氯化汞溶液加4～5滴吐温-20消毒12min能有效抑制褐变现象的发生。
(4)材料预处理：将消毒后的蝴蝶兰花梗进行高温处理，温度为45℃，时间为10min，然后无菌条件下常温放置48h；采用短时间的高温处理能够使其内的多酚氧化酶失去活性，从而达到在蝴蝶兰组织培养过程中抗褐变的目的。
(5)诱导培养：将预处理后的蝴蝶兰花梗，接种在诱导培养基中进行培养，先进行7d的暗培养，然后每天增加2小时的光照时间进行光培养，直到每天光照时间为12h/d为止，光照强度为1300～1500lx，即刚开始时的前7d为暗培养，然后第8d采用2小时的光照培养，第9d采用4小时的光照培养，第10d采用6小时的光照培养，第11d采用8小时的光照培养，第12d采用10小时的光照培养，第13d采用12小时的光照培养，第14d还是采用12小时的光照培养，往后都采用12h/d的光照培养；通过一段时间的暗培养能够降低褐变率，如果暗培养时间过高，又会使培养后的苗株发黄，不易生长，所以采用7d的暗培养。通过阶梯式的增加光照时间，能使外植体逐渐适应环境，从而减轻对外植体的危害。
前7～14d采用低温培养，培养温度为15～25℃，低温培养后，采用常温培养，培养温度为25～28℃，采用一段时间的低温培养，能够降低多酚氧化酶的活性，抑制褐变现象的产生；所述诱导培养基为：MS+0.4～0.8mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+10～15％椰汁+290～310mg/L柠檬酸+1～2g/L活性炭，pH值为5.4～5.5，表4为诱导培养基的多种实施例：
柠檬酸作为抗氧化剂的同时，也调节培养基的pH值，活性炭作为吸附剂能有效抑制褐变的发生，琼脂用量越大，培养基硬度也就越大，不利于养分的吸收，琼脂用量太小，培养基不易凝固，添加椰汁能有效抑制褐变的产生，所述MS基础培养基为现有技术，这里不做具体阐述。作为优选，所述诱导培养基为：MS+0.6mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L琼脂+13％椰汁+300mg/L柠檬酸+1.5g/L活性炭，即为表4中培养基1的成分及用量。
(6)增殖培养：将诱导培养后的蝴蝶兰花梗转移至增殖培养基中，先进行7d的暗培养，然后每天增加2小时的光照时间进行光培养，直到每天光照时间为12h/d为止，光照强度为1300～1500lx；前7～14d采用低温培养，培养温度为15～25℃，同理和诱导培养步骤中一致，先暗培养，在通过阶梯式的增加光照时间，低温培养后，采用常温培养，培养温度为25～28℃；所述增殖培养基为：MS+1～2mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+10～15％椰汁+290～310mg/L柠檬酸+1～2g/L活性炭，pH值为5.4～5.5；表5为增殖培养基的多种实施例：
作为优选，所述增殖培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L琼脂+13％椰汁+300mg/L柠檬酸+1.5g/L活性炭，即为表5中培养基7的成分及用量。
(7)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上、外植体上有明显突起的小苗转入生根培养基中，所述生根培养基为：MS+1.4～1.6mg/L 6-BA+0.05～0.08mg/L NAA+10～15g/L蔗糖+6～8g/L琼脂+10～15％椰汁+8～12％香蕉汁+7～10％土豆泥，pH值为5.4～5.5；培养条件：培养温度25～28℃，光照时间为13h/d，光照强度为1300～1500lx；表6为生根培养基的多种实施例：
作为优选，所述生根培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.07mg/L NAA+13g/L蔗糖+7g/L琼脂+13％椰汁+10％香蕉汁+9％土豆泥，即为表6中培养基13的成分及用量。
(8)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。通过采用本方法使组培过程中褐变率低，苗株成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养蝴蝶兰提供了技术支持。
本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。