本发明属于生物技术育种领域，具体涉及一种克服陆地棉-特纳氏棉双二倍体与陆地棉杂交不亲和性的胚拯救方法。
背景技术：
棉花(Gossypium spp.)是世界上最重要的经济作物和纺织原料。中国不仅是产棉大国，也是消费大国。其中种植面积最广泛的是陆地棉，占总的植棉面积的90％以上。但是陆地棉品种遗传基础非常狭窄，采用传统的育种手段进行品种间杂交，难以取得育种上的重大进展。
特纳氏棉具有苞叶早落,皮棉无杂屑、抗虫,耐盐等优良性状，若能将苞叶早落性状转育到栽培棉中，方便机械采摘，促进棉产业的发展。特纳氏棉与陆地棉杂交容易，获得的杂种通过秋水仙素加倍处理获得了异源六倍体(双二倍体)。人工合成的陆地棉-特纳氏棉双二倍体高度不育(雌雄均不育)，与陆地棉回交难以获得杂交种子，即存在高度不亲和性。
特纳氏棉(G.turneri Fryx)是棉属D染色体组中最近发现的一个二倍体野生棉，起源于墨西哥，其染色体组成是D12D12(2n＝2X＝DD＝26)，1986年由法国引入我国，具有苞叶早落,皮棉无杂屑、抗虫,耐盐等优良性状。若能将苞叶早落性状转育到栽培棉中，不但可以拓宽栽培棉的遗传基础，丰富栽培棉的基因资源，而且利用其优良特性一旦培育出品种，将提高其抗逆性(抗虫耐盐)，方便机械采摘，大力促进棉产业的发展。目前由于特纳氏棉与栽培棉种间存在种间障碍，国内对其研究较少，王坤波等1993年只是对特纳氏棉的核型进行了分析，没有对该棉种的利用研究报道。南京农业大学利用该棉种为父本，在海南实现了陆地棉与特纳氏棉的杂交，在南京通过秋水仙素对杂种进行了加倍，获得了人工合成的陆地棉-特纳氏棉双二倍体。但是人工合成的双二倍体表现雌雄均高度不育。南京农业大学利用其分别作父本和母本，采用常规杂交方法，与陆地棉进行多年大量杂交也没有得到真实的杂交后代，该双二倍体与陆地棉存在的杂交不亲和性成了特纳氏棉优异基因向陆地棉转移的最大障碍，其主要表现是在杂种胚的发育过程中，由于杂交不亲和性，幼胚3-5天就发生夭折，导致无法获得杂交后代。
技术实现要素：
为了解决上述陆地棉-特纳氏棉双二倍体与陆地棉杂交不亲和性的技术问题，本发明提供了一种克服陆地棉-特纳氏棉双二倍体与陆地棉杂交不亲和性的胚拯救技术方法，该技术同时也能克服其他野生棉与陆地棉远缘杂交的不亲和性，实现野生棉基因资源育种利用的可能性。该方法能够得到陆地棉-特纳氏棉双二倍体与陆地棉的真实杂种，快速实现特纳氏棉优异性状在栽培种陆地棉品种改良上的育种利用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种克服陆地棉-特纳氏棉双二倍体与陆地棉杂交不亲和性的胚拯救方法，包括以下步骤：
1)陆地棉与陆地棉-特纳氏棉双二倍体杂交：以陆地棉为母本，将其开花前一天下午人工去雄，并防止外源花粉污染授粉，开花当天授以人工合成的陆地棉-特纳氏棉双二倍体的花粉；
2)滴涂赤霉素：授粉当天开始在苞叶处滴涂赤霉素水溶液；
3)胚珠培养：取授粉后3天的杂交铃清洗消毒后取出胚珠接种于初始培养基上进行暗培养，暗培养60天后将胚珠转移到萌发培养基MSB上进行光培养；光培养30天后将胚珠中的胚剥离放在生长培养基上萌发；15天后放在生根培养基上生根，2天后将幼苗转移到幼苗培养基上培养；
所述的初始培养基为：MSB+10g/L蔗糖+1.9g/L KNO3+0.5mg/L KT+300mg/L CH；
所述的萌发培养基为：MSB培养基
所述的生长培养基为：MSB+1.0mg/L KT；
所述的生根培养基为：MSB+0.5mg/L NAA+1.0g/L AC；
所述的幼苗培养基为：添加30g/L葡萄糖代替30g/L蔗糖的MSB；
4)幼苗嫁接：将步骤3)中培养的幼苗嫁接到海岛棉砧木上。
上述的方法，其在于所述赤霉素水溶液的浓度为50ppm，连续滴涂3天。
上述的方法，其在于步骤3)中所述清洗消毒的过程为：用肥皂清洗杂交铃表面，然后流水冲洗2小时，将冲洗后的杂交铃用70％酒精灭菌1分钟后，置于含有1ml/L吐温20的3％的次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，取出，无菌水冲洗干净。
上述的方法，其在于步骤3)中所述暗培养的条件为：26±2℃，30天继代一次。
上述的方法，其在于步骤3)胚珠培养整个过程的条件为：16小时光照8小时黑暗，温度是26±2℃，光照强度是1600～2000lux。
上述的方法，其在于步骤3)中所述杂交铃的取样时间为上午10点到12点。
本发明优选技术方案的详细过程：
1)陆地棉与陆地棉-特纳氏棉双二倍体杂交：以陆地棉为母本，将其开花前一天下午人工去雄(不能破坏花药，去雄彻底，防止陆地棉自身花粉污染)，并套上4-6厘米的吸管防止外源花粉污染授粉，开花当天授以人工合成的陆地棉-特纳氏棉双二倍体的花粉；
2)滴涂赤霉素(GA3)：授粉当天在苞叶内外滴涂50ppm的赤霉素水溶液，连续3天；挂牌标识，以示与其他棉铃区别；
3)胚珠培养：取授粉后3天的杂交铃；取样时间是上午10点到12点；用肥皂清洗铃表面，然后流水冲洗2小时，将冲洗后的铃用70％酒精灭菌1分钟后，置于含有1ml/L吐温20的3％的次氯酸钠溶液中10分钟，取出，无菌水冲洗3次；在超净工作台上用消毒后的手术刀沿棉铃的四个心皮连接处切开，取健康正常的胚珠接种于初始培养基(MSB+10g/L蔗糖+1.9g/L KNO3+300mg/L酸水解干乳酪(CH)+0.5mg/L KT)的组培瓶中避光暗培养；60天后将胚珠转移到萌发培养基MSB中；又30天后将胚珠中的胚剥离放在生长培养基(MSB+1.0mg/L细胞分裂素(KT))中萌发；15天后放在MSB添加0.5mg/L萘乙酸(NAA)，1.0g/L活性炭(AC)中生根；2天后幼苗放在添加30g/L葡萄糖代替30g/L蔗糖的MSB中；培养室的条件是16小时光照8小时黑暗，温度是26±2℃，光照强度是1600～2000lux；
4)幼苗嫁接：将培养瓶中的幼苗用剪刀剪掉子叶节以上的部分嫁接到生长健壮的海岛棉砧木上；
5)杂交种鉴定：对获得的幼苗进行形态学、SSR分子标记、细胞学鉴定。
对上述实验方案进一步阐述：
1.在本发明中，所述的滴涂50ppm赤霉素，授粉后早晚各一次，每次用滴管滴1到2滴于苞叶内外，连续3天。
2.在本发明中，所述的取样是3天的杂交铃，是胚发育的较早阶段，有效地避免了胚的过早夭折导致幼胚拯救失败的难题。
3.在本发明中，所述的幼苗嫁接，胚拯救得到的幼苗较弱，生活力差，通过嫁接可有效提高幼苗的成活率。
4.本发明中，所述的初始培养基是在两种胚拯救培养基筛选和预备试验基础上，根据幼胚生长的情况进行多次试验，调整自己设计的培养基配方，最后筛选而来的。取3天陆地棉与陆地棉-特纳氏棉杂交胚珠各100粒放在三种初始培养基中：
培养基I：MSB+10g/L蔗糖+1.9g/LKNO3；
培养基II：MSB+10g/L蔗糖+1.9g/L KNO3+250mg/L CH+1.0mg/L吲哚乙酸(IAA)+0.2mg/L KT；
培养基III：MSB+10g/L蔗糖+1.9g/L KNO3+300mg/L CH+0.5mg/L KT；
通过30天的培养，胚珠在培养基I中，愈伤褐化；在培养基II中，产生大量愈伤；在培养基III中，愈伤少，正常生长；从而筛选出适合胚珠初始的培养基MSB+10g/L蔗糖+1.9g/L KNO3+300mg/L CH+0.5mg/L KT。
5.本发明中，所述的幼苗培养基中的蔗糖30g/L由葡萄糖30g/L代替。
本发明的有益效果：
本发明所提供的“一种克服陆地棉-特纳氏棉双二倍体与陆地棉杂交不亲和的胚拯救方法”，有效地防止铃过早脱落，有效地避免了幼胚的过早夭折，成功地获得了陆地棉-特纳氏棉双二倍体与陆地棉的杂交后代，获得了陆地棉-特纳氏棉的五倍体(倍半二倍体)材料，其育性较双二倍体有了较大提高，并将该五倍体成功与陆地棉亲本进行了回交，得到了回交后代群体，为实现该棉种的育种利用奠定了基础。
具体实施方式
实施例1：一种胚拯救克服陆地棉与陆地棉-特纳氏棉双二倍体杂交困难的方法
材料种植：陆地棉(TM-1)和人工合成的陆地棉-特纳氏棉双二倍体(来自于陆地棉与特纳氏棉杂交，得三倍体F1杂种，将种子经秋水仙素处理，染色体加倍后的双二倍体)种植于南京农业大学牌楼基地。
1)陆地棉与陆地棉-特纳氏棉双二倍体杂交：
以陆地棉为母本，将其开花前一天下午3点到6点手工去雄，并罩上4-6厘米的吸管防止外援花粉污染授粉。在开花当天的上午10点到12点授以人工合成的陆地棉-特纳氏棉双二倍体的花粉。
2)滴涂植物激素赤霉素：
授粉当天在杂交花的苞叶内外连续3天滴涂50ppm赤霉素水溶液防止脱落。早晚各一次，每次滴1～2滴。
3)胚珠培养：
取样与清洗消毒：于晴天的10点到12点取授粉后3天的杂交铃放在冰盒里带回实验室，用肥皂清洗杂交铃的表面，然后流水冲洗2小时，将冲洗后的铃在超净工作台上用70％酒精灭菌1分钟后，置于含有1ml/L吐温20的3％的次氯酸钠溶液中浸泡10分钟，取出，无菌水冲洗3次，保证铃表面彻底消毒。
胚拯救过程：杂交铃经过清洗消毒后，在超净工作台上用手术刀沿铃的四个裂痕切开，将胚珠接种于初始培养基(MSB添加蔗糖10g/L、1.9g/L KNO3、0.5mg/L KT、300mg/LCH，PH5.8)的组培瓶中，每个组培瓶放5粒胚珠，避光培养，温度是26±2℃，30天继代一次，共培养60天；60天后将胚珠转移到胚珠萌发培养基MSB，PH5.8中进行光培养，条件是16小时光照8小时黑暗，温度是26±2℃，光照强度是1600～2000lux；30天后将胚珠中的胚剥离放在培养基(MSB添加KT1.0mg/L，PH5.8)中促进茎和叶子的生长；15天后放在生根培养基(MSB添加0.5mg/L NAA，1.0g/L活性炭(AC)，PH5.8)中生根；2天后幼苗放在苗培养基(MSB PH5.8添加葡萄糖30g/L代替蔗糖30g/L)；培养室的条件是16小时光照8小时黑暗，温度是26±2℃，光照强度是1600～2000lux。
4)幼苗嫁接：
将步骤3)中培养的幼苗嫁接到海岛棉砧木上，待幼苗在苗培养基上长到5cm到8cm高时，用灭菌的剪刀在超净工作台上剪取幼苗子叶节以上的部位，嫁接到海岛棉砧木上。由于胚拯救的苗较纤弱，不易移栽成活，采用嫁接技术可使成活率达到90％以上。
5)杂交种鉴定：
利用形态学、细胞学和SSR分子标记对杂种进行鉴定，形态学方面陆地棉-特纳氏棉双二倍体花黄色花药，柱头较长；陆地棉白色花药，柱头较短；陆地棉×陆地棉-特纳氏棉六倍体杂交种黄色花药，柱头也较长；陆地棉的染色体为52条，陆地棉-特纳氏棉六倍体染色体为78条，对陆地棉×陆地棉-特纳氏棉六倍体花粉母细胞减数分裂中期进行观察染色体为65条；对陆地棉、特纳氏棉、陆地棉-特纳氏棉三倍体、陆地棉-特纳氏棉六倍体和陆地棉×陆地棉-特纳氏棉六倍体就行SSR分子标记检测，陆地棉×陆地棉-特纳氏棉六倍体中含有特纳氏棉的DNA扩增产物；三种方法都证明杂种是真实杂种。