本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种用于鉴定陆地棉早熟性的ssr标记的开发及其应用。
背景技术：
：：棉花是世界上非常重要的一种经济作物，在国民经济和社会发展中占有重要地位。但是，由于我国的基本国情是人多地少，粮棉争地矛盾非常突出，植棉面积不断减少，而传统的一年一熟制植棉方式限制了棉花生产的发展。因此，生产上迫切需要适合两熟或多熟种植的早熟、丰产、优质棉花新品种。在四个棉花栽培种之中，陆地棉(gossypiumhirsutum)年产量占棉花总产量的95％以上。短季棉是陆地棉的一种类型，其最突出的特征是生育期较短，早熟性较好。早熟性是多个复杂性状的综合表现，涉及开花期(ft)、全生育期(wgp)、花铃期(fbp)、果枝始节(nffb)、果枝始节高度(hnffb)和株高(ph)等多个数量性状，受多个基因控制，遗传机理复杂且易受环境因素影响。传统的育种方法是通过选配具有相对性状的品种、品系进行杂交，在后代选择优良单株，再培育早熟品种。但是这种育种方法进展缓慢、效率较低，很难满足生产的需要。分子标记辅助选择(marker-assistedselection,mas)是一种选择效率高、目的性强、节省时间的新型辅助育种方法。这种方法所需的首要条件是获得与目标性状紧密关联的分子标记。因此，开发与陆地棉早熟性紧密相关的分子标记，是将mas用于早熟性棉花新品种选育的关键，对促进棉花新品种选育、保证棉花生产在国民经济中的地位具有重要意义。连锁分析是目前研究植物数量性状基因型的主要方法之一，通过双亲杂交建立作图群体，对群体性状进行高精度的表型鉴定，并进行高密度分子连锁图谱的绘制，再对遗传图谱和表型性状进行连锁分析，发掘与目标性状相关的遗传连锁区段并定位qtl位点。简单重复序列(simplesequencerepeat，ssr)是植物基因组中广泛存在的分子标记，其检测技术操作简单，结果可重复性高，是用于遗传图谱构建、qtl定位的重要标记之一，也是应用于mas最为广泛的标记。在前人的研究报道中，利用两个f2群体连锁分析已定位了生育期、苗期、蕾期、花铃期、果枝始节、果枝始节高度和霜前花率等与陆地棉早熟性状相关的qtl位点(li,etal.qtlanalysisforearly-maturingtraitsincottonusingtwouplandcotton(gossypiumhirsutuml.)crosses.breedingscience,2013,63:154-163)。但是，到目前为止，还没有获得鉴定或辅助鉴定棉花早熟性可靠的分子标记，生产中也没有通过mas开展相关的早熟棉育种工作。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定棉花早熟性的引物对。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定棉花早熟性的引物对，可为能够扩增得到如下dna片段的引物对：所述dna片段是以棉花基因组dna为模板，采用序列表中序列1和序列2所示引物对进行pcr扩增所得的dna片段。具体的，所述引物对由序列表中序列1和序列2所示的两条单链dna组成。制备所述引物对的方法也属于本发明的保护范围。本发明所提供的制备所述引物对的方法具体可包括将所述引物对中的两条单链dna分别单独包装的步骤。本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定棉花早熟性的试剂盒。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定棉花早熟性的试剂盒，可含有所述引物对和如下中的至少一种：dntp、dna聚合酶和pcr扩增缓冲液。所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法，包括将引物对和如下中的至少一种分别单独包装的步骤：dntp、dna聚合酶和pcr扩增缓冲液。本发明的第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为早熟棉花品种的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为早熟棉花品种的方法，具体可包括如下步骤：(a1)以待测棉花的基因组dna为模板，采用所述引物对分别进行pcr扩增，得到pcr产物。(a2)将所述pcr产物进行电泳，根据电泳结果按照如下确定所述待测棉花是否为早熟棉花品种：若所述pcr产物的电泳条带的带型与参照带型a相同，则所述待测棉花为或候选为早熟棉花品种；反之，则所述待测棉花不为或候选不为早熟棉花品种。所述参照带型a为以棉花品种‘中36’的基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳所得的带型。本发明的第四个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为晚熟棉花品种的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测棉花是否为晚熟棉花品种的方法，具体可包括如下步骤：(b1)以待测棉花的基因组dna为模板，采用所述引物对分别进行pcr扩增，得到pcr产物；(b2)将所述pcr产物进行电泳，根据电泳结果按照如下确定所述待测棉花是否为晚熟棉花品种：若所述pcr产物的电泳条带的带型与参照带型b相同，则所述待测棉花为或候选为晚熟棉花品种；反之，则所述待测棉花不为或候选不为晚熟棉花品种；所述参照带型b为以棉花品系‘g2005’的基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳所得的带型。本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测棉花早熟性的方法。本发明所提供的鉴定或辅助鉴定待测棉花早熟性的方法，可包括如下步骤：(a1)以待测棉花的基因组dna为模板，采用所述引物对分别进行pcr扩增，得到pcr产物；(a2)将所述pcr产物进行电泳，根据电泳结果按照如下确定所述待测棉花的早熟性：电泳条带的带型与参照带型a相同的待测棉花比或候选比电泳条带的带型与参照带型b相同的待测棉花早熟；所述参照带型a为以棉花品种‘中36’的基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳所得的带型；所述参照带型b为以棉花品系‘g2005’的基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳所得的带型。本发明的第六个目的是提供棉花培育方法。本发明所提供的棉花培育方法，可为如下(a)或(b)：(a)一种培育早熟棉花品种的方法，是选取符合如下条件的棉花作为亲本进行育种：以基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳，电泳条带的带型与参照带型a相同；所述参照带型a为以棉花品种‘中36’的基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳所得的带型；(b)一种培育晚熟棉花品种的方法，是选取符合如下条件的棉花作为亲本进行育种：以基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳，电泳条带的带型与参照带型b相同；所述参照带型b为以棉花品系‘g2005’的基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增，将所得pcr产物进行电泳所得的带型。在上述各方法中，所述电泳具体可为聚丙烯酰胺凝胶电泳，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳中，所述聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8％(质量百分含量)。本发明的第七个目的是提供一种与棉花早熟性相关的分子标记。本发明所提供的与棉花早熟性相关的分子标记，为以棉花基因组dna为模板，采用所述引物对进行pcr扩增所得的dna片段。所述引物对或所述试剂盒或所述分子标记在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：(1)鉴定或辅助鉴定棉花早熟性；(2)棉花育种。在本发明中，所述棉花具体为陆地棉。所述早熟性可体现为如下任一性状：开花期(ft)、全生育期(wgp)、花铃期(fbp)、果枝始节(nffb)、果枝始节高度(hnffb)和株高(ph)。本发明针对陆地棉d3染色体上定位的qtl位点(qft-d3-3)开发目标区间内的分子标记，获得与目标qtl紧密连锁的ssr分子标记，从而用于棉花早熟性的选择应用，为早熟棉品种的培育奠定基础。附图说明图1为重组自交系群体的qtl定位结果。图2为重组自交系群体三环境开花期差异。2013ft，2013年开花期数据，单位为天。**表示在p<0.01水平上差异极显著。early表示早熟亚群，late表示晚熟亚群。图3为实施例3中早熟自然群体的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图4为实施例4中陆地棉自然群体的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图5为实施例4中119份陆地棉性状分群差异分析结果。e表示早熟亚群，l表示晚熟亚群；ay表示安阳；shz表示石河子；ay-14表示2014年安阳统计数据。**表示在p<0.01水平上差异极显著。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。棉花品种‘中36’和棉花品系‘g2005’：记载于“贾晓昀,庞朝友,魏恒玲等.晚播对陆地棉两个主要产量构成因子的影响.石河子大学学报:自然科学版,2016年2月”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。实施例1、棉花早熟性相关ssr标记的获得及相关引物设计与检测方法发明人所在团队定位到了一个与早熟性关系非常密切的染色体区段，位于d3染色体，其中一个非常突出的qtl位点(qft-d3-3)在2011-2015五个环境内都能检测到，而且贡献率在20％左右，因此该位点存在与早熟性关系非常密切的基因；基于所定位到的关键染色体区段(图1)，进一步在该区段内进行引物筛选，在亲本材料——棉花品种‘中36’和棉花品系‘g2005’之间查找多态性ssr标记，最终获得棉花早熟性相关ssr标记，记为d03_1348。1、棉花早熟性相关ssr标记d03_1348相关引物对合成于苏州金唯智生物科技有限公司合成用于早熟性鉴定的引物对如下：引物f：5’-aatagagccagccggttgtt-3’(序列1)；引物r：5’-ccttccttccctcttcttcctc-3’(序列2)。2、提取测试材料的基因组dna取幼嫩的陆地棉叶片按照ctab法(patersonah,brubakercl,wendeljf.arapidmethodforextractionofcotton(gossypiumspp.)genomiednasuitableforrflpandpcranalysis.plantmolrep,1993,11:122-127)。3、pcr扩增以测试材料的基因组dna为模板，用步骤1合成的引物对进行pcr扩增，获得pcr扩增产物。pcr扩增的反应体系(10μl)：ddh2o4.7μl、dna模板(30ng·μl-1)3μl、引物f(10μmol·l-1)0.5μl、引物r(10μmol·l-1)0.5μl、10×buffer(含15mm的mg2+)1μl、10mmdntp0.2μl和5u/μl的taq酶0.1μl(北京全式金生物技术有限公司产品)。pcr扩增的反应条件为：95℃5min；95℃30s、58℃45s、72℃1min，30个循环；72℃5min；4℃保存。4、电泳检测基因型向10μl上述pcr产物中加入2μl上样缓冲液，混匀；在8％聚丙烯酰胺凝胶中点入2μl，电泳55min，电压180v，停止电泳(溴酚蓝电泳至凝胶底部)；将胶浸入固定液(10％乙醇，0.5％乙酸)中固定10min，去离子水漂洗3min，然后用0.1％agno3染色10～15min，用去离子水漂洗1次(不得超过5s)，最后用显色液(2％naoh，0.04％na2co3，0.4％甲醛)显色，条带清晰即可停止。上样缓冲液为98％去离子甲酰胺、10mmol·l-1edta(ph8.0)、0.25％二甲苯氰和0.25％溴酚蓝。电泳缓冲液为1×tbe。实施例2、遗传分离群体的早熟性鉴定本发明首先以包含192个株系的重组自交系群体为材料进行实验，该群体的杂交亲本为棉花品种‘中36’和棉花品系‘g2005’。其中，‘中36’是早熟品种，‘g2005’是一个晚熟株系，两者均为陆地棉材料。于2013-2015年调查群体的开花期(ft)，并通过实施例1中给出的引物对以及相应的pcr、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法鉴定群体及亲本的。将群体的表型数据与基因型结合，依据‘中36’和‘g2005’纯合基因型(将经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后带型与‘中36’一致的记为cc基因型，与‘g2005’一致的记为gg基因型)，将192个株系进行分群(即cc基因型群为早熟亚群，gg基因型群为晚熟亚群)，计算分群后各自群体的开花期平均值。鉴定结果发现，d03_1348可将此重组自交系群体的开花期分为差异极显著的两个纯合群体(图2，表1)。表1重组自交系群体性状分群差异分析注：ft，floweringtiming；2013ft，2013年开花期数据，单位为天。**表示在p<0.01水平上差异极显著。实施例3、早熟自然群体的标记验证本发明以88份早熟材料为对象，对d03_1348进行验证。材料名称及来源见表2，部分材料记载于文献“韩永亮，路正营，李世云，杨玉枫，崔红印.早熟棉品种的灰色关联分析.安徽农业科学，2015，43(8)：37-38”。以d03_1348为标记，以‘中36’和‘g2005’为参照，对88份早熟材料进行基因型鉴定。具体操作及结果判定参见实施例1和2。鉴定结果发现，88份早熟材料中的70份具有与‘中36’相同的基因型，12份的基因型与‘g2005’的相同，5份为杂合带型，1份未扩增出产物(图3)。可见，约80％的早熟材料得到与‘中36’相同基因型条带，该结果证明d03_1348在鉴定早熟性方面具有可靠的作用。表288份早熟棉材料名称、基因型及来源实施例4、陆地棉自然群体的早熟性鉴定本发明选取119份陆地棉材料为研究对象进行早熟性鉴定，该群体包含有早熟、中熟、晚熟材料，于2014、2015年在安阳和石河子进行早熟相关性状调查(14ay，15ay，14shz)。同时以d03_1348为标记，以‘中36’和‘g2005’为参照，对119份材料进行基因型鉴定。结果显示：在该自然群体中，有44份的基因型与‘中36’相同，69份的基因型与‘g2005’相同，4份杂合基因型，2份未得到扩增产物或带型不明确(图4)。依据纯合基因型，将自然群体分为分别含有44份(i)和69份(ii)材料的两个亚群，计算两个亚群的开花期，并分析其差异显著性。结果发现，两亚群在所调查的所有早熟相关性状的数据中均存在极显著差异(图5，表3)。以2015年安阳数据为例，第i亚群(早熟亚群)的开花期均在75天以内，第ii亚群(晚熟亚群)中63.38％材料的开花期都大于75天；第i亚群(早熟亚群)中88.37％材料的全生育期小于120天，第ii亚群(晚熟亚群)中78.87％材料的全生育期大于120天；第i亚群(早熟亚群)中90.7％材料的花铃期小于50天，第ii亚群(晚熟亚群)中61.97％材料的花铃期大于50天；第i亚群(早熟亚群)中95.35％材料的果枝始节在6个节位以内，第ii亚群(晚熟亚群)中71.83％材料的果枝始节大于6个节位；第i亚群(早熟亚群)中86.05％材料的果枝始节高度小于16厘米，第ii亚群(晚熟亚群)中73.24％材料的果枝始节高度大于16厘米；第i亚群(早熟亚群)中72.09％材料的霜前花率大于70％，第ii亚群(晚熟亚群)中83.1％材料的霜前花率小于70％。本试验证明，d03_1348在区分陆地棉早熟性方面的作用非常显著。各环境的田间统计数据为：表4，2014年安阳统计数据；表5，2014年石河子统计数据；表6，2015安阳统计数据。表4-表6中，基因型一栏“-”表示未扩增出条带。表3119份陆地棉性状分群差异分析表42014年安阳播种材料统计数据表52014年石河子播种材料统计数据表62015年安阳播种材料统计数据<110>中国农业科学院棉花研究所<120>用于鉴定陆地棉早熟性的ssr标记的开发及其应用<130>gncln170880<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1aatagagccagccggttgtt20<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2ccttccttccctcttcttcctc22当前第1页12当前第1页12