一种蕨类孢子灭菌及接种方法与流程

文档序号:11071008阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种蕨类孢子的消毒及接种方法,其特征在于该方法先收集蕨类孢子,把蕨类孢子叶装入硫酸纸袋中,标记代号后置于通风干燥处,待孢子自由脱落;把DNA纯化柱,规格:吸附柱1ml、收集管2ml、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用;用对折过的硫酸纸收集脱落在纸袋中的孢子,简单的去除杂质碎叶、环带、鳞毛后沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中,盖好盖子,放入收集管中,并做好标记,放置于离心管架上;在无菌条件下,加入600μl 75%乙醇,倒立纯化柱1-2次,之后200-1200rpm离心20s;从加乙醇开始,直到完成离心,整个操作过程控制在25-35s内;倒弃收集管中废液,在无菌条件下加入600μl无菌水,反复吸打溶液使孢子悬浊,充分漂洗孢子,然后200-1200rpm离心20s,重复1-2次,洗脱乙醇;倒弃收集管中废液,在无菌条件下加入600μl 0.1-0.2%氯化汞灭菌2-4min或2%次氯酸钠消毒6-8min,反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌,然后200-1200rpm离心20s;倒弃收集管中废液,在无菌条件下加入600μl无菌水,反复吸打使孢子悬浊,充分漂洗孢子,然后200-1200rpm离心20s,此操作重复3-4次,使消毒液彻底洗脱;再向离心之后的吸附柱中添加600μl无菌水,反复吸打使之呈孢子悬浊液,吸取100μl孢子悬浊液接种到培养基上,实现接种。

2.一种蕨类孢子的消毒及接种方法,其特征在于该方法包括下述步骤:

步骤1:收集孢子,把蕨类孢子叶片装入硫酸纸袋中,标记代号后置于通风干燥处,等孢子自由脱落;

步骤2:把DNA纯化柱,规格:吸附柱1ml,收集管2ml、1ml枪头、纯净水在121℃高温灭菌20-30min备用;

步骤3:在对折过的硫酸纸片上铺一层擦镜纸,把自由脱落在硫酸纸袋中的孢子倒在擦镜纸上,轻微抖动擦镜纸进行简单的过滤,孢子可以通过擦镜纸的孔隙,而碎叶、环带、鳞毛等杂质会留在擦镜纸上达到简单过滤的目的,然后把过滤后的孢子沿着折痕倒入已灭菌的吸附柱中,盖好盖子,放入收集管中,做好标记,放置于离心管架上;

步骤4:在无菌操作台上,打开吸附柱盖,用1ml移液枪加入600μl 75%乙醇,盖好盖子消毒30s,期间倒立纯化柱1-2次,在孢子消毒的同时,吸附柱内部也得到灭菌,然后200-1200rpm离心20s,加乙醇,倒立纯化柱,离心完成尽量控制在30s内;

步骤5:取出吸附柱,倒弃收集管中废液。吸附柱放回收集管中,放置于离心管架上。在无菌操作台中,打开吸附柱盖,用1ml移液枪加入600μl无菌水,反复吸打溶液充分漂洗孢子,然后200-1200rpm离心20s,重复1-2次;

步骤6:取出吸附柱,倒弃收集管中废液,吸附柱放回收集管中,放置于离心管架,在无菌操作台中,打开吸附柱盖,用1ml移液枪加入600μl 0.1-0.2%氯化汞灭菌2-4min或2%次氯酸钠消毒6-8min,反复吸打溶液使孢子悬浊充分灭菌,然后200-1200rpm离心20s;

步骤7:取出吸附柱,倒弃收集管中废液,吸附柱放回收集管中,放置于离心管架上,在无菌操作台中,打开吸附柱盖,此时吸附柱及孢子已经过乙醇,氯化汞或次氯酸钠消毒处于无菌状态,用1ml移液枪加入600μl无菌水,反复吸打使孢子悬浊,充分漂洗孢子,然后200-1200rpm离心20s;

步骤8:重复步骤7,3-4次;

步骤9:用1ml移液枪取600μl无菌水加入吸附柱中,反复吸打使之呈孢子悬浊液,吸取100μl孢子悬浊液接种到培养基上;

步骤10:把培养物移到温度25±2℃暗培养3-5天,再移至光照条件培养2周后孢子萌发。

3.权利要求1或2所述的一种蕨类孢子的消毒及接种方法在蕨类离体保存过程中的应用。

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