利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法与流程

本发明涉及一种利用组培苗叶片再生不定芽途径快速繁育羊踯躅的方法，属于农业生物技术领域。

背景技术：

羊踯躅(Rhododendron molle(Blume)G.Don)，又名闹羊花、黄杜鹃、黄色映山红，隶属于杜鹃花科杜鹃花属羊踯躅亚属落叶灌木，是中国羊踯躅亚属中仅有的一个原生种。羊踯躅是有待开发的优良的园林绿化树种，可引种驯化成为露地栽培的园艺观赏植物，是杜鹃花色品种改良的重要资源。同时它也是珍稀濒危药用植物，全株器官均含有多种活性成分，花、根、果实等均可供药用，具有祛湿、除风、解痛等功效，可用于治疗风湿、顽癣和疼痛等症；对农作物虫害的防治也有一定的作用，是开发绿色农药的植物源。羊踯躅主要是通过种子、扦插等方式繁殖。然而羊踯躅种子细小难采集，且种子萌发率较低，种子苗生长缓慢，距开花结果的时间较长；以扦插、嫁接方式繁殖又存在生根率及移栽成活率极低等问题，使其开发及利用受到极大限制。因此，亟待采取有效的方法对羊踯躅加以繁殖，使之能够规模化生产，满足人们日益增长的需求。

利用植物组织培养技术繁殖羊踯躅可以不受季节和环境条件等因素的影响，并能得到大规模整齐的瓶苗，且繁殖系数高，是解决上述难题的重要途径。国内羊踯躅组织培养快繁技术研究是通过剪取羊踯躅的枝条获得无菌组培苗，进一步通过剪取组培苗的茎节，诱导和培养嫩茎段腋芽丛生的方式建立羊踯躅离体培养和植株再生体系，芽丛的增殖率为4-5倍以上(顾宏辉,袁群英,朱春艳,朱丹华.羊踯躅的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2006,42(4):683；顾地周,陆爽,巴春影,李媛媛.羊踯躅嫩茎离体培养和植株再生[J].山东农业大学学报(自然科学版),2010,43(4):574-578)；以诱导和培养嫩茎段腋芽丛生的方式建立的快繁体系不能作为农杆菌介导的遗传转化体系对羊踯躅进行遗传改良。

技术实现要素：

针对上述问题，本申请以羊踯躅组培苗顶生第三至第五个叶片为外植体材料，通过筛选不同的叶片切割方式、暗培养时间及细胞分裂素和生长素组合，提高叶片不定芽的诱导率和不定芽数目，建立高频率植株再生技术体系，本发明是这样实现的：

一种利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法，其具体步骤如下：

A)在超净工作台上剪取羊踯躅无菌组培苗顶生第三到第五个叶片(该叶片不太老也不太嫩，成熟度适中))，对叶片垂直于主脉切割一刀并去除叶柄和叶稍；

B)将叶片置于不定芽诱导培养基上，暗培养10-15天后进行光照培养，同时观察叶片，可发现光照培养13-16天左右，切口处开始出现不定芽；

C)光照培养35天后，将带不定芽的叶片转到不定芽生长培养基上进行继代培养，30d后形成幼苗；

D)将幼苗切下，转移到成苗和生根培养基上，进行成苗和生根培养，30d后，幼苗即发育成具有根、茎和叶的完整再生植株。

WPM培养基：由WPM大量元素(990mg/L K₂SO₄、180.5mg/L MgSO₄、400mg/L NH₄NO₃、170mg/L KH₂PO₄、471mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O和72.5mg/L CaCl₂)、WPM微量元素(0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、22.3mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、6.2mg/LH₃BO₃和36.7mg/L FeNa-EDTA)与WPM有机物(100mg/L肌醇、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L烟酸和2.0mg/L甘氨酸)组成，8g/L的琼脂粉作为固化剂。

不定芽诱导培养基：向WPM培养基中加入终浓度为1.0mg/L的细胞分裂素噻苯隆TDZ、终浓度为1.0mg/L的生长素吲哚乙酸IAA、终浓度为30g/L的蔗糖，高压灭菌，氢氧化钠或盐酸调整pH值至5.8；

不定芽生长培养基：WPM培养基中加入终浓度为1.0mg/L的细胞分裂素玉米素ZT、终浓度为0.1-0.5mg/L的生长素吲哚丁酸IBA、终浓度为30g/L蔗糖，高压灭菌，氢氧化钠或盐酸调整pH值至5.8；

成苗和生根培养基：按照1/2WPM培养基(即WPM培养基中各元素、有机物添加量减半)，加入终浓度为10-12.5mg/L的生长素吲哚丁酸IBA、终浓度为15g/L的蔗糖、终浓度为0.3g/L的活性炭，高压灭菌，氢氧化钠或盐酸调整pH值至5.8。

进一步，本发明所述利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法中，步骤B)所述光照培养是指：光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为25±2℃。

进一步，本发明所述利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法中，步骤D)所述成苗和生根培养培养是指：光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为25±2℃。

进一步，本发明所述利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法中，无菌组培苗叶片暗处理后不定芽的诱导产生、成苗和生根培养均在光照条件下进行，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为25±2℃。

进一步，本发明所述利用组培苗叶片再生不定芽快速繁育羊踯躅的方法中，步骤A)所述组培苗是这样获得的：剪取当年羊踯躅带有4～6个侧芽的新发枝条3～5cm，通过组织培养方法(顾宏辉,袁群英,朱春艳,朱丹华.羊踯躅的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2006,42(4):683))获得羊踯躅无菌组培苗。

本发明在前人研究基础上，采用羊踯躅组培快繁中丢弃不用的叶片为材料，通过诱导叶片直接再生不定芽建立了羊踯躅的快速繁殖体系，增殖系数提高到7倍以上；通过采用羊踯躅无菌组培苗叶片诱导直接再生不定芽，避免了羊踯躅组织培养过程中外植体需要灭菌、污染率高等问题；通过解决叶片再生不定芽的叶片切割方式、暗培养时间、最适宜培养基组分以及不定芽生长和组培苗生根等关键技术问题，建立了羊踯躅快速、高效的繁殖体系，最终实现羊踯躅在短时间内大量、快速、高质量的繁殖，有效地满足人们对羊踯躅日益增长的需求；同时这个快速繁殖体系也可以作为农杆菌介导的遗传转化体系对羊踯躅进行遗传改良，具有较大的科研价值和经济价值。

附图说明

图1为组培苗叶片诱导产生不定芽示意图片。

图2为不定芽伸长示意图片。

图3为不定芽长成幼苗示意图片。

图4为组培苗生根培养示意图片。

具体实施方式

下面将结合附图实施例详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。

实施例涉及材料来源：

羊踯躅地栽苗由江苏省农业科学院园艺研究所观赏植物与茶研究室提供；

蔗糖、琼脂、生长素吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid，简称IAA)、吲哚丁酸(3-indolebutyric acid，简称IBA)和细胞分裂素玉米素(Zeatin，简称ZT)均购自南京鼎国生物技术有限公司；

细胞分裂素噻苯隆(Thidiazuron)简称TDZ，购于南京生兴生物技术有限公司；

实施例涉及的培养基：

WPM培养基：由WPM大量元素(990mg/L K₂SO₄、180.5mg/L MgSO₄、400mg/L NH₄NO₃、170mg/L KH₂PO₄、471mg/LCa(NO₃)₂·4H₂O和72.5mg/L CaCl₂)、WPM微量元素(0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、22.3mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L CuSO₄·5H₂O、6.2mg/LH₃BO₃和36.7mg/L FeNa-EDTA)与WPM有机物(100mg/L肌醇、1.0mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸吡哆醇、0.5mg/L烟酸和2.0mg/L甘氨酸)组成，8g/L的琼脂粉作为固化剂。(该培养基为木本植物组织培养中常用的培养基，也可参见LloydGB,McCownBH.Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel,Kalmia latifolia,by use of shoot-tip culture[J].Comb.Proc.Int.Plant Prop.Soc.,1980,30:421-426制备方法)；

不定芽诱导培养基：WPM培养基中加入终浓度为1.0mg/L的细胞分裂素噻苯隆TDZ、终浓度为1.0mg/L的生长素吲哚乙酸IAA、终浓度为30g/L的蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整pH值至5.8，高压灭菌；

不定芽生长培养基：WPM培养基中加入终浓度为1.0mg/L的细胞分裂素玉米素(ZT)、终浓度为0.1-0.5mg/L的生长素吲哚丁酸(IBA)、终浓度为30g/L蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整pH值至5.8，高压灭菌；

成苗和生根培养基：按照1/2WPM培养基(即WPM培养基中各元素、有机物添加量减半)，加入终浓度为10-12.5mg/L的生长素吲哚丁酸IBA、终浓度为15g/L的蔗糖、终浓度为0.3g/L的活性炭，氢氧化钠或盐酸调整pH值至5.8，高压灭菌；

Aderson培养基：由Aderson大量元素、Aderson微量元素和Aderson有机物组成(具体参见Anderson WC.A revised tissue culture medium for shoot multiplication of Rhododendron[J].J.Amer.Soc.Hort Sci..,1984,109:343-4347)。

实施例1

1、羊踯躅无菌组培苗的获得与增殖

剪取羊踯躅3～5cm长，当年新发枝条(带有4～6个侧芽)，应用组织培养方法(顾宏辉,袁群英,朱春艳,朱丹华.羊踯躅的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2006,42(4):683)获得无菌苗并对其进行增殖培养。

2、叶片切割方式对叶片直接再生不定芽的影响

剪取步骤1中羊踯躅无菌组培苗顶生第三至第五个叶片，分别采取以下四种处理方式：

(1)不切割；

(2)垂直于主脉切割一刀；

(3)垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍；

(4)垂直于主脉切割两刀并去叶柄和叶稍。

分别将经过这四种不同方式处理的叶片接种在不定芽诱导培养基上，培养室温度为25±2℃(该温度为暗培养和光培养温度)，暗培养10天后进行光照培养，光照培养35d(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；)后统计叶片不定芽诱导率和不定芽数，其结果如表1所示：

表1不同切割方式对叶片直接再生不定芽的影响

表1结果表明，在光照培养35天调查时，第(1)和第(2)种叶片切割方式的叶片很少有不定芽再生；而采用第(3)种方式，即垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式有效地提高了叶片直接再生不定芽的频率，且不定芽主要发生在叶片切口处(如图1所示)，叶片再生不定芽百分率达86.2％，平均再生芽数4.7个/叶片；而采用第(4)种方法叶片再生率显著降低，主要原因可能是切口过多导致叶片死亡率增加，从而降低了其再生频率。

3、基本培养基类型对叶片直接再生不定芽的影响

剪取步骤1中羊踯躅无菌组培苗顶生第三至第五个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于WPM培养基和Aderson培养基中，并分别附加终浓度TDZ 0.2mg/L+IAA 1.0mg/L的激素组合，培养室温度为25±2℃，暗培养10天后进行光照培养(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d)，35d后统计叶片诱导率和不定芽数，结果如表2所示：

表2不同培养基对叶片直接再生不定芽的影响

由表2可见，叶片外植体在WPM培养基上的再生率和再生芽数与Anderson培养基没有显著差异，但Anderson培养基上叶片再生的不定芽叶色偏黄，质量不如WPM培养基上的不定芽。

4、暗培养时间对叶片直接再生不定芽的影响

剪取步骤1中羊踯躅无菌组培苗顶生第三至第五个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于WPM培养基中(加入终浓度为0.2mg/L的TDZ和终浓度为1.0mg/L的IAA)，分别进行0天、5天、10天、15天和20天五个时间点的暗培处理。处理完后将其置于光照环境中继续培养35d后统计叶片诱导率和不定芽数。处理结果如表3所示：

表3暗培养时间对叶片直接再生的影响

表3结果表明暗培养对羊踯躅不定芽再生有一定促进作用；暗培养为10-15天，叶片的再生频率和平均再生芽数均显著高于其它处理。因此，叶片外植体最佳的暗培养时间为10-15天。

5、不同植物生长调节剂对叶片直接再生不定芽的影响

剪取步骤1中羊踯躅无菌组培苗顶生第三至第五个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于包含不同激素组合的WPM培养基上：不同浓度TDZ(分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L和1.0mg/L)与IAA(1.0mg/L和2.0mg/L)的完全随机组合，结果如表4所示：

表4不同激素配比对叶片直接再生的影响

表4结果可见，在基本培养基(WPM)和培养条件相同的情况下，接种于激素配比终浓度为TDZ 1.0mg/L+IAA 1.0mg/L培养基(因此选择其作为不定芽诱导培养基，并加入蔗糖，给植物提供能量)上的叶片外植体再生率和分化芽数最高，显著高于其它激素配比。

6、不定芽伸长生长：

将在不定芽诱导培养基暗培养(培养方式同上述暗培养)10天后的叶片继续进行光照培养(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为25±2℃)35天产生不定芽的叶片转到不定芽生长培养基上进行继代(如图2所示)，30d后形成幼苗(如图3所示)。

7、成苗和生根培养

将步骤6培养30d天后形成的幼苗切下转移到成苗和生根培养基上，培养30d后，幼苗发育成具有根、茎和叶的完整小植株(如图4所示)，生根率达95％以上。

成苗后如果不适宜大田栽培，可以移入温房栽培，待机再移出。

实施例2

1、羊踯躅、江南春早和胭脂蜜3个杜鹃品种无菌组培苗的获得与增殖

分别剪取羊踯躅、江南春早和胭脂蜜3～5cm长，当年新发枝条(带有4～6个侧芽)，应用组织培养方法(顾宏辉,袁群英,朱春艳,朱丹华.羊踯躅的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2006,42(4):683)获得无菌苗并对其进行增殖培养。

2、羊踯躅、江南春早和胭脂蜜3个杜鹃品种对本发明的平行试验

不定芽诱导培养基：WPM培养基中加入终浓度为1.0mg/L的细胞分裂素噻苯隆TDZ、终浓度为1.0mg/L的生长素吲哚乙酸IAA、终浓度为30g/L的蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整pH值至5.8，高压灭菌；

分别剪取步骤1中羊踯躅、江南春早和胭脂蜜无菌组培苗顶生第三至第五个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于不定芽诱导培养基上，培养室温度为25±2℃，暗培养10天后进行光照培养(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d)，35d后统计叶片诱导率和不定芽数，结果如表5所示：

表5羊踯躅、江南春早和胭脂蜜3个杜鹃品种对本发明的平行试验

表5显示杜鹃品种江南春早组培苗叶片直接再生不定芽的频率仅为30％，而杜鹃品种胭脂蜜组培苗叶片不能产生不定芽。表5结果表明本发明的叶片切割方式、暗培养时间及不定芽诱导培养基只适用于杜鹃品种羊踯躅，对杜鹃品种江南春早和胭脂蜜并不适用，进而证明本发明不适宜其他同类产品，为羊踯躅专属快速繁殖方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干修改和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。