一种抗根肿病的甘蓝‑大白菜远缘杂种的创制方法与流程

本发明属于生物技术育种领域，涉及一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法。

背景技术：

根肿病是由根肿菌属芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起的、危害十字花科作物的一种传染性非常强的土壤病害，结球甘蓝(Brassica oleracea L.Var.Capitata,，2n＝2x＝CC＝18，简称甘蓝)是受其危害严重的寄主之一；目前生产上非常缺乏抗根肿病甘蓝品种。甘蓝对根肿病抗性属于数量性状遗传，由多基因控制，易受环境影响；而且主要是隐性基因，这就使得利用常规育种方法改良甘蓝根肿病抗性存在困难并且进展缓慢。国内外对大白菜抗根肿病的研究表明，大白菜对根肿病菌的侵染大多表现受显性单基因控制。其中位于A3连锁群的CRb基因对根肿菌生理小种2、4和8表现抗性，是一个优良的抗性基因。

技术实现要素：

本发明的目的是针对目前甘蓝资源遗传基础狭窄，抗根肿病资源缺乏这一现状，提供一套利用胚胎拯救获得甘蓝-大白菜远缘杂种的方法，创造一批抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种；同时为扩大甘蓝基因库，引进近缘种中优异的目标性状(基因)，形成一套甘蓝品种改良的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法，包括以下步骤：

(1)授粉方法：以抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本，配置杂交组合,采用人工剥蕾去雄重复授粉的方法，取父本新鲜花粉，涂抹在母本去雄的花蕾柱头上；

(2)胚珠培养：取授粉后10d的子房消毒灭菌，剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上,在环境25±0.5℃，光照强度50-100μmol·m^–2·s^–1，光照时长12-14h·d^–1条件下培养25～30d，所述的胚挽救培养基为：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(3)分化培养：待幼胚长至子叶形胚时，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(4)继代培养：20～30d后转入继代培养，继代培养基为：MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.90～5.95；

(5)生根培养：继代2周后接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.90～5.95；

(6)人工加倍：将修剪好的植株根部浸泡在配制的秋水仙素溶液中进行加倍，所述的处理条件为含2％二甲基亚砜浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18-20h，处理完毕后，将根部的秋水仙素残液冲洗干净，最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石的穴盘中；

(7)形态学鉴定：对幼苗营养生长阶段、生殖生长阶段的主要形态特征进行观察；

(8)细胞DNA相对含量测定：用流式细胞仪对后代加倍植株进行细胞DNA相对含量测定；

(9)根肿病抗性鉴定：通过菌土法接种鉴定和抗根肿病基因CRb的分子标记验证相结合鉴定根肿病抗性，将基质灭菌后，每克灭菌土中接种0.001g病根，然后直接将鉴定材料播于菌土中，于25-28℃下培养，2个月后拔出幼苗，洗净根部杂质，观察发病情况；同时，利用与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13对后代植株进行分子标记鉴定，当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。

其中，步骤(1)中所述的杂交组合的配置为：抗根肿病大白菜为母本，甘蓝为父本。其中母本为引进的1份对根肿病表现免疫、携带CRb基因的大白菜材料。

步骤(2)中子房消毒灭菌方法为：用75％(体积分数)的乙醇消毒1min，然后用7％(体积分数)的次氯酸钠灭菌15min，再用用无菌水冲洗3次，每次5min。

步骤(6)中秋水仙素溶液进行加倍处理时一定要没过根部。

步骤(6)中草炭土、珍珠岩和蛭石的体积比为8:1:1。

步骤(9)中所述的与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13上游引物序列为TGTTGATTGTGGATTTTTGTGA(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为CCAAACTAGCCAATAACCATTGTA(SEQ ID NO.2)。

步骤(9)中当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的313bp特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。

有益效果

本发明利用抗根肿病大白菜和甘蓝为材料，采用幼胚拯救技术进行甘蓝抗性改良，促进大白菜与甘蓝之间的遗传杂交，合并两个种的优异基因，获得了一批优异的种间新种质，为进一步渐渗转移利用抗根肿病基因、改良甘蓝品种奠定基础。本发明提供的一种大白菜与甘蓝远缘杂交新种质创制方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

(1)本发明利用的是携带CRb基因的大白菜抗源，经鉴定其对根肿病抗性达免疫水平，是一个非常理想的抗源材料。

(2)本发明在胚挽救的MS培养基添加了0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白，提高了胚胎拯救率和诱导率。

(3)本发明在人工加倍中使用的处理是含2％二甲基亚砜(DMSO)浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理18h，提高了种间杂种的加倍率。

附图说明

图1远缘杂种F₁形态学鉴定。

(a)甘蓝(左)、杂种F₁(中)、大白菜(右)营养生长期表型；(b)甘蓝(左)、杂种F₁(中)、大白菜(右)生殖生长期表型；(c)甘蓝(左)、杂种F₁(中)、大白菜(右)种子表型；

图2引物TCR13对远缘杂种F₁鉴定的扩增结果

1-4为母本大白菜，5-10和13-17携带CRb基因的真杂种，11-12为假杂种，18-19为父本甘蓝。箭头所示为与CRb基因连锁的抗病带型

具体实施方案

本发明所提供的一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法，通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容不局限于此：

1.甘蓝-大白菜种间杂交后代材料的获得

1.1材料选择

甘蓝为不同基因型的二倍体高代纯合材料，大白菜为抗根肿病的二倍体材料。

1.2幼胚拯救及杂种获得

(1)授粉方法：于塑料大棚内进行杂交，甘蓝和大白菜互为父母本进行杂交，在母本开花前1～2d剥蕾去雄,授以父本的花粉,套袋隔离。次日开始采用重复授粉法进行人工授粉(每天授粉一次，重复三次)。结果表明，以大白菜为母本的幼胚拯救率高于以甘蓝为母本。

(2)幼胚拯救：取授粉后7d、10d、12d的子房,用75％(体积分数)的乙醇消毒1min，然后用7％(体积分数)的次氯酸钠灭菌15min，再用用无菌水冲洗3次，每次5min。剥取子房中的胚珠接种到胚挽救培养基上在环境温度25±0.5℃，光照强度75μmol·m^–2·s^–1，光照时长14h的条件下培养28d。所述的胚挽救培养基处理为：0(CK，MS+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.95)、添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA、添加0.6g/L水解酪蛋白、添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白。结果表明,授粉后10d的子房，在MS培养基中添加0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白,pH为5.95时获得了最高的诱导率。

(3)分化培养：待幼胚长至子叶形胚时，接入分化培养基诱导不定芽分化，所述的分化培养基为：MS+0.1mg/L NAA+1mg/L 6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.95。

(4)继代培养：25d后转入继代培养，继代培养基为MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.95。

(5)生根培养：继代2周后接入生根培养基诱导生根，所述的生根培养基为：1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.95。

(6)利用秋水仙素进行人工染色体加倍

先将待处理的植株从生根培养基中取出，于自来水管下将根部冲洗干净，用剪子将根剪至1～2cm长，然后将修剪好的植株根部浸泡在配制的含2％二甲基亚砜(DMSO)浓度为0.4％的秋水仙素溶液中处理(秋水仙素溶液一定要没过根部)。每个处理4～5棵植株。处理时间为12h、18h、24h、30h。将处理的植株置于25℃、通风、光照条件下。结果表明，当处理时间为18h的时候，植株加倍率最高。处理完毕后，将植株从秋水仙素溶液中取走，于自来水管下将根部的秋水仙素的残液冲洗干净。最后定植于含有草炭土、珍珠岩和蛭石(8:1:1)的穴盘中。当植株长到4～5片叶后移栽到大田。

2.种间双二倍体杂种的鉴定

(1)形态学鉴定从F₁出苗至开花、结籽，对其主要形态特征进行观察并拍照，结果发现：F₁营养生长阶段的生长形态为生长势大于双亲，综合性状介于双亲之间；抽薹始期与大白菜相近，种株整个生长形态介于双亲之间，生长势大于双亲。自交授粉后收获的种子获得的种子黑褐色，比双亲的种子大，整体性状具有超亲优势。

(2)DNA相对含量的分析：用流式细胞仪对双亲和经形态学鉴定为远缘杂交种的F₁的叶片细胞DNA相对含量进行了定和比较。结果表明，双亲大白菜、甘蓝二倍体植株的细胞DNA高峰值均出现在横坐标200的相对位置上，而获得的后代植株的细胞DNA高峰值则均出现在400的相对位置上，这表明后代加倍植株的细胞DNA相对含量较其二倍体亲本增加了一倍，即后代植株的染色体已进行了加倍。

(3)根肿病抗性鉴定：通过菌土法接种鉴定和抗根肿病基因CRb的分子标记验证相结合鉴定根肿病抗性。将基质灭菌后，每克灭菌土中接种0.001g病根，然后直接将鉴定材料播于菌土中，于25-28℃下培养，2个月后拔出幼苗，洗净根部杂质，观察发病情况。同时，利用与大白菜抗根肿病CRb基因紧密连锁的SSR引物TCR13对后代加倍双二倍体植株进行分子标记鉴定。提取父母本及后代材料的DNA，然后进行经PCR扩增及6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离获得扩增谱带。当后代材料的扩增谱带中出现抗根肿病大白菜所具有的313bp特异条带时，即可判定其为携带CRb基因的真杂种。

综上所述，在大白菜和甘蓝进行杂交时，最好以大白菜为母本；在对授粉后10d的子房进行消毒后，将胚珠置于为：MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.6g/L水解酪蛋白+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.95中进行培养；待幼胚长至子叶形胚时，接入MS+0.1mg/L NAA+1mg/L6-BA+6g/L琼脂+28g/L蔗糖，pH为5.95。分化培养基中诱导不定芽分化；20-30d后转入MS+0.1mg/LNAA+0.2mg/L 6-BA+7g/L琼脂+25g/L蔗糖，pH为5.95的继代培养基中继代培养；继代2周后接入1/2MS+0.1mg/L NAA+0.1mg/L IBA+20g/L糖+7g/L琼脂，pH为5.95。生根培养基诱导生根；出苗前，将植株在秋水仙素浓度为0.4％的条件下处理18h进行人工加倍，然后使用形态学特征、流式细胞仪和根肿病抗性对其杂种进一步鉴定。

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种抗根肿病的甘蓝-大白菜远缘杂种的创制方法

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> TCR13上游引物序列

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<213> 人工序列

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<223> TCR13下游引物序列

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