一种大蒜素缓解苹果连作障碍的方法与流程

本发明涉及一种大蒜素缓解苹果连作障碍的方法，属于果树栽培学领域。

(二)

背景技术：

连作障碍是指同一作物或近缘作物连续种植以后，即使在正常管理的情况下，也会产生产量降低、品质变劣、生育状况变差的现象。苹果连作障碍具有普遍性，是生产中的一大难题，给果农造成巨大的经济损失，严重制约了果树生产的可持续发展。研究表明，在多数地区，与土传真菌有关的生物因素是造成连作障碍的主要原因。化学杀菌剂熏蒸土壤一直以来都是防治连作障碍最有效的措施，但是因其污染环境，逐渐被禁止使用。因此研制环境友好型植物源熏蒸剂来防控苹果连作障碍具有重要意义。

生物熏蒸剂既能有效的抑制和杀灭土壤中的有害病原菌，又能在土壤中快速降解。因此用生物熏蒸剂进行土壤消毒和生长期防治，没有任何农药残留和污染，可以替代很多种化学农药，从源头上确保质量安全。大蒜是百合科葱属植物，研究表明大蒜素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、链球菌、克雷白杆菌、植物炭疽病和疫病病菌等均有明显抑制作用，因此我们考虑将其作为一种生物熏蒸剂，探索其在苹果连作障碍中的应用效果。目前对大蒜素的提取方法主要有：超声波提取、溶剂振荡萃取法、水蒸气蒸馏法、超临界CO₂萃取法、真空微波辅助萃取法等。但这些提取大蒜素的方法有的耗时长，有的操作复杂，并且都存在提取效率低的问题。因此，研究简易快捷、高效环保的提取大蒜素的工艺并将所得大蒜素用于减轻苹果连作障碍，可有利于推动苹果产业的发展，对有效防控苹果连作障碍具有实践意义。

(三)

技术实现要素：

针对上述现象，本发明提供了一种大蒜素缓解苹果连作障碍的方法；具体涉及一种高效、快捷、简单易行的提取大蒜素的方法，并将所得大蒜素应用于缓解苹果连作障碍。

本发明技术方案如下：

一种大蒜素缓解苹果连作障碍的方法，是在每年苹果连作建园时，春季栽植苹果幼树时，向每棵苹果幼树的定植穴内施用浓度为25mg/mL的大蒜素提取液；每棵幼树的施用量为其定植穴内土壤体积比的1/8，分三次施加：第一次为春季栽植苹果幼苗前两周施加(3月上旬)，施用量为每棵幼树的定植穴內土壤体积比的1/16；第二次为苹果幼树生长初期(6月上旬)，施用量为每棵幼树的定植穴內土壤体积比的1/32；第三次为苹果幼树生长中期(7月下旬)，施用量为每棵幼树的定植穴內土壤体积比的1/32。

所述大蒜提取液制备步骤如下：

1)大蒜去皮清洗，切成0.1～0.4cm的碎丁，室温下放置5～15min进行酶解，使蒜氨酸向大蒜素转化；

2)将切碎酶解好的大蒜放入快速溶剂萃取仪(ASE)中进行萃取得到萃取液；

萃取条件为：萃取溶剂为无水乙醇，压力9.80～11.20Mpa，萃取温度40～50℃，静态萃取时间4～10min，循环萃取次数2～4次，冲洗体积50～70％，吹扫时间150～200s；

3)旋蒸浓缩：将步骤2)中得到的萃取液采用旋转蒸发仪，在45℃条件下蒸发浓缩至萃取液体积比的1/20～1/10，然后以12000g速度离心，取上清液得到大蒜素提取母液，按照公式(1)计算母液浓度(单位g/mL)，4℃保存；

4)大蒜素提取母液中按体积比加入去离子水稀释大蒜素提取母液，得到浓度为25mg/mL的大蒜素提取液。

本发明的特点及有益效果：

本发明有两个明显的优势：一是短时间内极大的提高了大蒜素萃取液的提取效率；二是大蒜素提取液可显著提高连作条件下苹果幼苗生长发育，最终起到减轻苹果连作障碍的效果。利用本发明提取的大蒜提取液和施用方法，经验证，能有效提高连作条件下苹果幼苗生长发育，降低苹果连作土壤中尖孢镰刀菌的数量，明显减轻苹果连作障碍现象。

(四)附图说明

图1为本发明高效快速制备大蒜素提取液及其在苹果连作障碍中的使用方法流程图。

图2为实施例1中不同提取方法对大蒜素提取效率的影响。

图2说明本发明方法即快速溶剂萃取仪ASE法制备的大蒜素提取液抑菌效果最好。

图3为实施例2中不同提取溶剂对大蒜素提取效率的影响。

图3说明本发明选用乙醇作为萃取溶剂，制备的大蒜素提取液抑菌效果最好。

图4为实施例3中不同提取温度对大蒜素提取效率的影响。

图4说明萃取温度为50℃时，制备的大蒜素提取液抑菌效果最好。

图5为实施例4中不同提取时间对大蒜素提取效率的影响。

图5说明萃取时间5min时，所得大蒜素提取液抑菌效果最好。

(五)具体实施方式

实施例1：

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室温下放置10min进行酶解，酶解好的大蒜分别用本发明的快速溶剂萃取仪法、超声波萃取法和溶剂震荡萃取法进行大蒜素的提取测定，每种测定方法平行提取测定3次。由图2可以看出，本发明方法对大蒜素的提取效率显著高于超声波萃取法和溶剂震荡萃取法，本方法的提取效率是超声波萃取法的1.29倍，是溶剂震荡萃取法的1.63倍。而且，用不同方法的提取液做抑菌试验，发现，本发明方法制备的大蒜素提取液抑菌效果最好。

使用时将本实施例所得的大蒜素提取母液按体积比加入去离子水，获得浓度为100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液，备用。

然后称取马铃薯葡萄糖琼脂46.0g，加入1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌20min，培养基冷至45℃左右加入浓度为100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液中，制得含有不同浓度的大蒜素提取液培养皿，然后放上直径为8mm的供试病原真菌尖孢镰刀菌菌种，以不加大蒜提取液的为对照，倒扣培养皿，封口膜密封，置于28℃恒温培养箱中黑暗培养，10天后测量菌落扩展直径，称取菌丝鲜重，并计算提取物对菌丝生长的抑制率，结果见表1：

表1 大蒜提取液对菌丝生物量影响

抑菌率(％)＝(对照皿菌落直径一处理皿菌落直径)/对照皿菌落直径×100％结果发现，培养10天后测量菌落直径和鲜重，可以看出，大蒜素提取液能明显抑制尖孢镰刀菌菌落生长，当大蒜提取液使用浓度为100mg/mL时，抑制率达到了100％。这个抑菌试验证明本发明方法制得的大蒜素提取液具有抑制引起苹果连作障碍病原菌的功效。

实施例2

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室温下放置10min进行酶解，酶解好的大蒜放入快速溶剂萃取仪ASE中，分别用无水乙醇、甲醇和水作为萃取剂，在压力为10.1Mpa，萃取温度为50℃，静态萃取时间为5min，循环萃取3次，冲洗体积为65％，吹扫时间为180s的条件下进行萃取。由图3可以看出，无水乙醇对大蒜素的提取效率显著高于甲醇和水，分别是甲醇、水提取效率的1.9倍和6.4倍。因此，本发明方法选无水乙醇作为溶剂。

使用时将本实施例所得的大蒜素提取母液按体积比加入去离子水，获得浓度为50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液，备用。

2015年12月1日，将经过层积、催芽的苹果砧木—平邑甜茶种子播种于育苗盘育苗，至幼苗长至第2片真叶时，取长势基本一致的幼苗移栽，进行温室试验。试验设4个处理，每处理10盆，每盆内装连作土壤1kg，并定植2株幼苗。盆中连作土壤分别作如下处理：以未处理的连作土为对照(CK)；10mg/L的大蒜提取液处理的土壤(T1)；25mg/L的大蒜提取液处理的土壤(T2)；50mg/L的大蒜提取液处理的土壤(T3)。移栽幼苗前1周，每1kg连作土壤，浇灌50mL不同浓度的大蒜提取液，连作土壤对照用50mL去离子水替代。生长30天，再次各处理浇灌50mL不同浓度的大蒜素提取液，连作土壤对照用50mL去离子水替代。生长60天后，对盆栽平邑甜茶幼苗生物量及土壤中尖孢镰刀菌数量进行了测定，结果如表2。

表2 大蒜提取液对苹果幼苗生长及土壤中尖孢镰刀菌数量的影响

从表2可以看出，连作土壤中添加25mg/mL的大蒜提取液，则苹果幼苗的株高和鲜重分别提高47％和48％，土壤中的有害真菌，尖孢镰刀菌的数量则降低了65％，施加高浓度的大蒜素提取液虽然对土壤中的病原菌灭杀效果好，但是对苹果幼苗的生长也有抑制作用，综合来看，连作土壤中添加25mg/mL的大蒜素提取液，效果最佳。

实施例3

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室温下放置10min进行酶解，使蒜氨酸向大蒜素转化。将切碎酶解好的大蒜放入快速溶剂萃取仪(ASE)中，萃取温度分别为30、40、50、60、70、80℃，用无水乙醇作为萃取剂，在压力为10.1Mpa，静态萃取时间为5min，循环萃取3次，冲洗体积为65％，吹扫时间为180s的条件下进行萃取，每个温度平行提取测定3次。由图4可以看出，萃取温度为50℃时候，大蒜素的提取效率最高。而且，用不同温度下的提取液做抑菌试验，发现萃取温度50℃所得大蒜素提取液抑菌效果最好。

使用时将本实施例所得的大蒜素提取母液按体积比加入去离子水，获得浓度为50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL的大蒜素提取液，备用。

2016年3月4日，将经过层积、催芽的苹果砧木—平邑甜茶种子播种于育苗盘育苗，至幼苗长至第6片真叶时，取长势基本一致的幼苗移栽，于山东农业大学南校区苹果中心试验站进行盆栽试验。试验设三个处理，每处理10盆，每盆内装连作土壤6kg，并定植2株幼苗。盆中连作土壤分别作如下处理：以未处理的连作土为对照(CK)；10mg/L的大蒜提取液处理的土壤(T1)；25mg/L的大蒜提取液处理的土壤(T2)；50mg/L的大蒜提取液处理的土壤(T3)。移栽幼苗前一周，每1kg连作土壤，浇灌50mL不同浓度的大蒜提取液，连作土壤对照用50mL去离子水替代；生长一个月后，再次不同处理再次浇灌50mL处理液。正常水肥管理，生长120天后，对盆栽平邑甜茶幼苗生物量及土壤中尖孢镰刀菌数量进行了测定，结果如表3。

表3 大蒜提取液对苹果幼苗生长及土壤中尖孢镰刀菌数量的影响

从表3可以看出，连作土壤中添加25mg/mL的大蒜素提取液，则苹果幼苗的株高和鲜重分别提高51％和108％，而土壤中的有害真菌，尖孢镰刀菌的数量则降低了42％。施加高浓度50mg/mL的大蒜素提取液虽然对土壤中的病原菌灭杀效果好，但是对苹果幼苗的生长也有抑制作用，综合来看，连作土壤中添加25mg/mL的大蒜素提取液，效果最佳。

实施例4

大蒜去皮清洗，切成0.2cm的碎丁，室温下放置10min进行酶解，使蒜氨酸向大蒜素转化。将切碎酶解好的大蒜放入快速溶剂萃取仪(ASE)中，萃取温度分别为30、40、50、60、70、80℃，用无水乙醇作为萃取剂，在压力为10.1Mpa，静态萃取时间从1min到15min，循环萃取3次，冲洗体积为65％，吹扫时间为180s的条件下进行萃取，每个时间平行提取测定3次。由图5可以看出，时间为5min时候，大蒜素的提取效率最高。而且，用不同时间的提取液做抑菌试验，发现，本发明方法选定的时间5min所得大蒜素提取液抑菌效果最好。

使用时将本实施例所得的大蒜素提取母液按体积比加入去离子水，获得浓度为25mg/mL的大蒜素提取液，备用。

山东省蒙阴南麻村两亩老龄苹果连作连作建园时，先去掉老龄树，每亩撒施7500-8500kg充分发酵的农家肥、深翻果园，深度为40cm，捡出残根。试验设为2个处理，一亩地土壤使用本发明方法获得的大蒜素提取液处理(T)；一亩地不做处理按常规种植苹果幼苗作为对照(CK)；处理(T)操作如下：春季栽植苹果幼苗时，挖出的每个定植穴连作土壤正常回填，幼树定植前2周，在定植穴内浇灌穴内土壤体积1/16、浓度为25mg/mL的大蒜素提取液。幼树生长初期，6月上旬，第二次施加浓度为25mg/mL的大蒜素提取液，施加量为定植穴内土壤体积的1/32；幼树生长中期，7月下旬，第三次施加浓度为25mg/mL的大蒜素提取液，施加量为定植穴内土壤体积的1/32；幼树生长期间，正常水肥管理。结果发现，用本发明方法处理土壤后，幼树生长量比不作处理的连作土壤(对照)中幼树增加67％。