一种培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统的制作方法

本发明涉及同位素标记技术领域，尤其涉及一种培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统。

背景技术：

近年来，作物秸秆所含的碳、氮元素在土壤中的循环过程已成为植物营养学、土壤学的研究热点之一。同位素示踪技术是研究作物秸秆在土壤中分解和转化过程的关键技术，能够有效揭示秸秆元素的释放规律和有机养分的生物有效性。被稳定性同位素氮(¹⁵n)标记的作物秸秆施入土壤中，通过测定土壤不同组分中¹⁵n丰度的变化，就能准确计算秸秆¹⁵n养分向土壤、植物转移的数量，以及通过气体、淋溶等途径损失的比例。同样，利用稳定性同位素碳(¹³c)示踪，结合现代分子生物学方法，诞生了一系列稳定性同位素探针技术(sip)，用以研究和描述秸秆碳的分解去向，以及通过生化作用合成生物大分子的生物过程，从而进一步地揭示了秸秆分解的微生物学机制。然而，秸秆碳、氮转化是一个相互联系的循环过程，二者同时发生，转化机理紧密联系、不可分割。因此，研究秸秆碳、氮转化过程的基础和前提就是获得高丰度的同位素碳、氮双标记植物样品。

已有的植物同位素标记技术均以单一元素标记为主。中国发明专利cn200610019742.4、cn201310513820.6以及实用新型专利cn201420736248.x均公开了一种二氧化碳同位素(¹³c-co2)的标记装置，且以土壤培养的植物为标记对象，不涉及同时标记两种同位素；尽管发明专利cn201410342182.0公开了一种同位素茎秆双标记示踪方法，但此方法主要利用¹³c-葡萄糖和¹⁵n-尿素直接注入植物体内，主要用于研究根系分泌物，此标记方法不属于植物正常的同化作用范畴，与植物通过正常的光合作用同化二氧化碳和通过正常的根系吸收同化氮素相比有巨大差异。

大部分同位素标记方法以土壤为培养基质，由于土壤本身含有大量的普通碳原子(¹²c)，通过微生物呼吸作用，这些碳原子会以¹²c-co2形态大量释放到空气中被植物吸收利用，导致被标记的植物样品的¹³c丰度降低。在研究作物秸秆分解过程中，低丰度的同位素植物样品无法实现在分子水平上(如dna水平)对碳原子进行示踪；此外，以土壤为培养基质进行¹⁵n标记时，土壤中大量的普通氮原子(¹⁴n)也会被植物吸收，造成植物体¹⁵n丰度过低。因此，选择适当的培养方式是获得高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的前提条件。

已有的植物同位素标记技术很难实现整个植物生育期的连续循环标记，造成同位素浪费严重，标记成本高，例如，¹³c-co2脉冲标记过程中，当密闭空间被定时打开时大量的¹³c-co2释放；又如水培条件下营养液中的¹⁵n养分无法循环利用，旧营养液中大量的¹⁵n丢弃浪费。连续循环标记的技术难点在于密闭环境中的空气湿度会不断加大，导致植物生长环境恶化，霉菌等病害加剧，植物生长受阻，导致植物同位素标记失败；如何实现稳定同位素碳、氮的连续循环标记是获得高丰度双标记植物样品的关键所在。

目前，本领域对上述问题并未提供系统化的解决方案。然而，获得高丰度双标记植物样品是研究植物残体碳、氮分解过程与机理的必须材料。因此，亟需一种低成本、高效率、一体化的培养同位素碳、氮双标记植物的循环系统。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本发明提供一种培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统，用于解决现有同位素标记技术不能实现同位素碳、氮双标记的循环培养，不能获得高丰度的双标记植物样品的问题。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本发明提供一种培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统，包括密闭培养室、co2注射器、气体平衡装置、营养液注射器以及营养液循环系统；所述密闭培养室包括上部的透明罩和下部的底座，所述底座与所述透明罩连接，所述透明罩内设有半导体冷凝除湿装置，所述透明罩外密封连接所述co2注射器和所述气体平衡装置；所述营养液循环系统包括培养盆、储液室、外排蠕动泵、紫外灭菌装置、循环蠕动泵以及汇合池，所述培养盆、储液室、外排蠕动泵、紫外灭菌装置、循环蠕动泵以及汇合池依次连接形成循环回路；所述汇合池还连接所述半导体冷凝除湿装置和所述营养液注射器；所述培养盆和所述储液室从上到下依次设于所述底座内，所述培养盆的顶部连通所述透明罩，所述培养盆内设有石英砂，所述石英砂中置入已催芽的植物种子。

其中，所述培养盆与所述储液室通过导流管连通，所述储液室内设有第一浮球液位开关。

其中，所述紫外灭菌装置包括紫外灭菌室，所述紫外灭菌室内设有紫外灯和第二浮球液位开关，所述第二浮球液位开关的下限水位高于所述紫外灭菌室的底部。

其中，半导体冷凝除湿装置包括箱体，所述箱体内设有依次连接的散热器、半导体制冷片和冷凝器。

其中，所述箱体内还设有风扇，所述风扇安装于靠近所述散热器的位置处，所述箱体的侧壁上开设通风孔。

其中，所述箱体的底部设有靠近所述冷凝器的漏斗，所述箱体依次连通所述漏斗和所述汇合池。

其中，所述透明罩和所述底座均为开口端设有凸缘的筒形件，所述透明罩的凸缘与所述底座的凸缘相互对应连接，所述透明罩的凸缘与所述底座的凸缘之间设有硅胶垫，用以实现所述透明罩与所述底座的密封连接。

其中，所述气体平衡装置包括气体平衡罐，所述气体平衡罐内设有横向设置的活塞，所述气体平衡罐上设有连通所述透明罩的开口，所述开口位于所述活塞的下部。

其中，所述储液区密封连接有废液注射器。

其中，所述透明罩内设有co2红外传感器。

(三)有益效果

本发明提供的一种培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统，相比于现有技术具有以下特点：

1、本发明的培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统，通过密闭培养室、气体平衡装置以及营养液循环系统的有机结合，实现了碳、氮同位素的同时标记，能够实现氮同位素的循环利用，且该系统整体密封，无普通¹²c和¹⁴n的污染，使得培养得到的双标记植物碳、氮同位素丰度很高。

2、在营养液循环系统中设有紫外灭菌装置，能够使得营养液中的¹⁵n通过紫外线灭菌后循环利用，且不改变氮素形态，不影响植物的吸收，通过¹⁵n-营养液被植物二次利用，提高了同位素利用率，降低标记成本；

3、在培养区内设置作为培养基质石英砂，能够解决土壤培养过程中土壤呼吸作用产生¹²c-co2以及水培中液体吸收大量¹³c-co2的问题，从而避免土壤培养和水培过程中对植物同位素丰度降低的影响；

4、通过在透明罩内的半导体冷凝除湿装置，能够解决密闭条件下培养室湿度过大的问题；通过将半导体冷凝除湿装置与营养液循环系统连接，能够将冷凝水通过汇合池，进入装有石英砂的培养区，能够提高水分利用率，减少浇水频次；通过半导体冷凝除湿装置中的风扇，能够促进密闭培养室中气体流动，加速co2混匀，提高作物利用率。

附图说明

图1为本发明提供的培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统的组成示意图；

图2为本发明提供的营养液循环系统的结构图；

图3为本发明提供的密闭培养室的结构图；

图中，1：密闭培养室；101：透明罩；102：底座；2：co2注射器；3：气体平衡装置；301：气体平衡罐；302：活塞；4：营养液注射器；5：半导体冷凝除湿装置；501：箱体；502：散热器；503：半导体制冷片；504：冷凝器；505：风扇；6：培养盆；7：储液室；8：外排蠕动泵；9：紫外灭菌装置；901：紫外灭菌室；902：紫外灯；10：循环蠕动泵；11：汇合池；12：石英砂；13：植物；14：导流管；15：第一浮球液位开关；16：第二浮球液位开关；17：漏斗；18：硅胶垫；19：废液注射器；20：co2红外传感器；21：橡皮塞。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供一种培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统，用于解决现有同位素标记技术不能实现同位素碳、氮双标记的循环培养，不能获得高丰度的双标记植物样品的问题。

如图1-3所示，本发明实施例中提供一种培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统，包括密闭培养室1、co2注射器2、气体平衡装置3、营养液注射器4以及营养液循环系统；密闭培养室1包括上部的透明罩101和下部的底座102，底座102连接透明罩101，形成完全密闭的培养室1，透明罩101内设有半导体冷凝除湿装置5，在植物样品的培养过程中，可以每间隔一段时间利用半导体冷凝除湿装置对密闭培养室1内进行除湿，透明罩101外密封连接co2注射器2和气体平衡装置3，co2注射器2可以向密闭培养室1内注入¹³c-co2，从而提供植物需要标记的¹³c-co2；透明罩101通过管道连接外部的气体平衡装置3，能够确保连续向密闭培养室1中加入¹³c-co2后密闭培养室1内的大气压保持正常，并在密闭培养室1温度降低，气体体积缩小时，气体平衡装置3中的气体可以及时回流至密闭培养室1内，使得¹³c-co2能够被充分利用。此外，营养液循环系统包括培养盆6、储液室7、外排蠕动泵8、紫外灭菌装置9、循环蠕动泵10以及汇合池11，培养盆6、储液室7、外排蠕动泵8、紫外灭菌装置9、循环蠕动泵10以及汇合池11依次连接形成循环回路；汇合池11还连接半导体冷凝除湿装置5和营养液注射器4；培养盆6和储液室7从上到下依次设于底座102内，培养盆6的顶部连通透明罩101，培养盆6内设有石英砂12，石英砂12中置有植物13，在培养盆6内设置作为培养基质石英砂，能够解决土壤培养过程中土壤呼吸作用产生¹²c-co2以及水培中液体吸收大量¹³c-co2的问题，从而避免土壤培养和水培过程中对植物同位素丰度降低的影响；植物13在光照透过透明罩101的情况下，植物13的叶子通过光合作用吸收co2注射器2注入密闭培养室1内的¹³c-co2，从而实现同位素碳的标记；植物13的根系吸收由汇合池11流入培养盆6中的¹⁵n-营养液，从而实现同位素氮的标记；营养液循环系统中，营养液注射器4能够向汇合池11中注入新营养液，从而向植物提供¹⁵n；¹⁵n-营养液由汇合池11进入培养盆6，培养盆6中过多的¹⁵n-营养液流入储液室7内，当储液室7内的¹⁵n-营养液过多时，¹⁵n-营养液在外排蠕动泵8的作用下进入紫外灭菌装置9进行灭菌，灭菌后的¹⁵n-营养液在循环蠕动泵10的作用下再次汇入汇合池11，通过该营养液循环系统能够解决密闭条件下不能频繁更换营养液的问题，在营养液循环系统中设有紫外灭菌装置9，能够使得营养液中的¹⁵n通过紫外线灭菌后循环利用，且不改变氮素形态，不影响植物的吸收，通过¹⁵n-营养液被植物二次利用，提高了同位素利用率，降低标记成本；半导体冷凝除湿装置利用半导体制冷片的peltier效应，能够使得空气中部分水分凝结成水，冷凝水通过管道汇入汇合池11，通过汇合池11进入培养盆6中，实现密闭培养室1内的水-汽良性循环，既能够降低密闭培养室1内空气湿度，又能够使冷凝水被植物二次利用，提高水分利用率，减少植物培养过程中的浇水频次，该半导体冷凝除湿装置的除湿过程属于物理除湿，不引入其他有害化学物质，且体积小，功耗低，散热小，能够持续工作。

本发明的培养高丰度同位素碳、氮双标记植物样品的循环系统，通过密闭培养室、气体平衡装置以及营养液循环系统的有机结合，实现了碳、氮同位素的同时标记，且能够实现碳、氮同位素的循环利用，该系统整体密封，无普通¹²c和¹⁴n的污染，使得培养得到的双标记植物碳、氮同位素丰度很高。该循环培养系统效率高、易于操作、成本低；植物的整个标记过程完全密闭，能够实现连续标记，防止¹³c-co2泄露，¹⁵n-营养液能够循环利用；通过半导体冷凝除湿装置能够严格控制湿度，促进植物生长，降低标记成本。

本实施例中，如图2所示，培养盆6与储液室7通过导流管14连通，储液室7内设有第一浮球液位开关15。具体的，培养盆6底部与储液室7顶部通过直径为1cm的导流管14连接，石英砂12中的液体渗透至培养盆6的底部，通过导流管14进入到储液室7；储液室7体积为1.5l，内置有小型浮球液位开关，即第一浮球液位开关15，其上、下限水位之间的空间的体积为1l；储液室7通过排水管与外置紫外灭菌装置9连接，排水管加装外排蠕动泵8；当储液室7中液体升至上限水位，第一浮球液位开关15启动外排蠕动泵8工作，外排蠕动泵8设置流速为50ml/min，将储液室7中的液体抽至紫外灭菌装置9中，当储液室7中液体降至下限水位，第一浮球液位开关15关闭外排蠕动泵8。

本实施例中，紫外灭菌装置9包括紫外灭菌室901，紫外灭菌室901内设有紫外灯902和第二浮球液位开关16，第二浮球液位开关16的下限水位b高于紫外灭菌室901的底部。具体的，紫外灭菌室901为暗室，其内装有紫外灯902，可以理解的是，紫外灯902可以设置为多根，本实施例中，紫外灭菌室901内加装2根紫外灯902，其辐射的253.7nm紫外线强度不得低于70uw/cm2；紫外灭菌室901内置有小型浮球液位开关，即第二浮球液位开关16，第二浮球液位开关16的上、下限水位a、b之间的空间的体积为0.5l，第二浮球液位开关16的下限水位b与紫外灭菌室902底部之间的空间体积为0.5l；当紫外灭菌室中液体升至上限水位a，第二浮球液位开关16启动循环蠕动泵10工作，将紫外灭菌室901中的¹⁵n-营养液抽至汇合池11，最后返回至装有石英砂12培养基质的培养盆6，当紫外灭菌室901中液体降至下限水位b，第二浮球液位开关16关闭循环蠕动泵10；第二浮球液位开关16的下限水位b与紫外灭菌室901的底部留有0.5l的空间，能够确保紫外灭菌室901中始终有液体处于灭菌状态。

本实施例中，半导体冷凝除湿装置5包括箱体501，箱体501内设有依次连接的散热器502、半导体制冷片503和冷凝器504。

本实施例中，箱体501内还设有风扇505，风扇505安装于靠近散热器502的位置处，箱体501的侧壁上开设通风孔。

本实施例中，箱体501的底部设有靠近冷凝器504的漏斗17，箱体501依次连通漏斗17和汇合池11。

通过半导体制冷片503的peltier效应，使得靠近冷凝器504的一侧吸热制冷，靠近散热器502的一侧放热，潮湿空气通过冷凝器504时，空气中的部分水分凝结成水，冷凝水通过漏斗17流至汇合池11中，通过汇合池11返回至培养盆6中，风扇505设于散热器502的一侧，由于箱体501的侧壁上开设通风孔，在风扇505的作用下，能够加速密闭培养室1中的空气流动，使得密闭培养室1内的空气湿度快速下降；此外，风扇505的作用下，能够加速密闭培养室1内气体流动，促进植物对¹³c-co2的同化利用，提高植物体的¹³c丰度。

半导体冷凝除湿装置5的最大除湿量为500ml/24h，工作时间设定为：每间隔3小时半导体冷凝除湿装置5工作1小时；当连续标记后，密闭培养室1的空气湿度高达100％，风扇启动，带动密闭培养室1内的气体流动，潮湿空气经过冷凝器504内管道，利用半导体制冷片的peltier效应，使得空气中部分水分凝结成水，冷凝水通过漏斗17和排水管返回至装有石英砂12基质的培养盆6。

本实施例中，如图3所示，为了便于透明罩和底座的连接后形成密闭的密闭培养室1以及方便对密闭培养室1进行拆卸，方便置入培养盆6和储液室7，并方便在植物13培养完成后，取出植物13，透明罩101和底座102均为开口端设有凸缘的筒形件，透明罩101的凸缘与底座102的凸缘位置对应后进行连接，并在透明罩101的凸缘与底座102的凸缘之间设有硅胶垫18，能够保证透明罩101的凸缘与底座102的凸缘的密封性，透明罩101的凸缘和底座102的凸缘上均分布多个螺孔，通过螺栓穿过螺孔，实现透明罩101的凸缘与底座102的凸缘的连接。

用螺栓连接前，在底座102中放入培养盆6，培养盆6的外直经与底座6的内径相等；培养盆6中放入石英砂12，石英砂12在使用前需要400℃高温灭菌4h，冷却后浇入0.5倍的霍格兰营养液使其含水量饱和，石英砂12的加入后，其表层与培养盆6的上沿相距3cm即可；石英砂12中加入已催芽的植物种子，掩埋深度为2cm，种子催芽前使用95％的乙醇浸泡3分钟，然后使用5％的次氯酸钠浸泡8分钟，然后使用灭菌水冲洗3次。

本实施例中，气体平衡装置3包括气体平衡罐301，气体平衡罐301内设有横向设置的活塞302，气体平衡罐301上设有连通透明罩101的开口，开口位于活塞302的下部。

密闭培养室1通过管道外连气体平衡装置3，气体平衡罐301中有能够自由上下移动的活塞302，导管入口位于活塞302的下方；气体平衡罐301的体积大于2l；当持续向密闭培养室1加入¹³c-co2后，其内部气压增加，使得密闭培养室1中的多余气体向气体平衡装置3中移动，活塞302向上移动；反之，当密闭培养室1中的温度降低或植物吸收¹³c-co2等因素引发气压降低，活塞302向下移动，气体平衡装置3中的气体向密闭培养室1移动，保持密闭培养室1内的正常大气压。

本实施例中，储液室7密封连接有废液注射器19，营养液循环利用过程中，当循环营养液中的¹⁵n养分被植物13逐渐吸收后，通过储液室7外连的废液注射器19将废弃营养液从储液室7中抽出，并通过连接汇合池11的营养液注射器4将新的营养液加入至装有石英砂12基质的培养盆6。

本实施例中，透明罩101内设有co2红外传感器20。透明罩101和底座102密封后，利用三通阀的co2注射器20向密闭培养室1中定量注入¹³c-co2，利用co2红外传感器20探测密闭培养室1内co2的浓度，密闭培养室1内的co2浓度维持在300ppm－600ppm，确保植物13不会奢侈吸收¹³c-co2；其中，co2红外传感器20的探头位于密闭培养室1的内部，co2红外传感器20的显示屏位于密闭培养室1的外部，探头和显示屏二者的连接线通过橡皮塞21穿过透明罩1，co2红外传感器20的检测范围为1-2000ppm,精度为1％。此外，透明罩101的材料可选用透明的有机玻璃，底座102的材料可选用pvc。

本实施例中，汇合池11设置在透明罩101内，且该循环系统的连接均通过管道连接，如：营养液循环系统通过管道连接，半导体冷凝除湿装置5与汇合池11通过管道连接，透明罩101与气体平衡装置3通过管道连接。为了严格保证密闭培养室1的密闭性，所有注射器和管道均通过针头穿过橡皮塞21与密闭培养室1内部管道连接。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。