本发明涉及吡硫锌(zincpyrithione)与食品准许的抗微生物剂的提供协同抗微生物作用的组合。食品准许的抗微生物剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶。这些组合对保护任何有生命或非生命的材料(例如食品、作物、植物、果实、木材、木制品、皮革、天然或合成纺织品、纤维、非纺织物、工业纺织品、增塑材料和非增塑热塑性塑料如聚丙烯、聚氯乙烯等、纸张、墙纸、绝缘材料、层压制品、氨基模塑化合物、油漆和涂料、织物、地面覆盖物、合成纤维如增塑聚合物、粗麻布、绳和纤维绳以及其他可生物降解材料)抵抗由于微生物如细菌、真菌、酵母、藻类等的作用而变质是有用的。本发明还涉及包括吡硫锌和食品准许的抗微生物剂的组合，该抗微生物剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶；其以相应比例提供协同抗微生物作用的组合物。
微生物在例如像酒精发酵、干酪成熟、面包烘烤、青霉素生产、废水净化、沼气生产等过程中是非常有用的、并且甚至是不可或缺的。然而，微生物也可能是有害的或高度危险的：通过引起传染性疾病，通过形成有毒的或致癌的代谢物以及通过攻击有价值的材料，干扰生产过程，或损害产品的品质。
抗微生物剂是能够控制微生物(即消除、杀死、或抑制微生物，或减少微生物例如细菌、真菌、酵母和藻类的生长或增殖)的广泛且多样的一组化合物。一组重要的抗微生物剂是杀细菌剂和杀真菌剂。由于细菌和真菌随处可见，它们的破坏活动(生物变质)基本上是不可避免的。尽管如此，可以借助于化合物(通过杀死细菌或者真菌或者抑制它们的发展来防止细菌或者真菌在相关部位增殖)来保护物品。
wo-2014/085740、ep-2,481,285和ep-2,468,095披露了用于在保护建筑材料，木材或纸张中使用的协同抗微生物组合物，该组合物包含吡硫锌和另外的抗微生物剂，即环草定，唑嘧磺草胺，双氯磺草胺或草甘膦。cn-104292585披露了包括吡硫锌和焦亚硫酸钠的驱虫剂组合物。
已经发现吡硫锌(下文称为组分(i))和选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶的食品准许的抗微生物剂(下文称为组分(ii))的组合在微生物控制上具有协同作用。
组分(i)，即吡硫锌，是在20世纪30年代首次报道的配位化合物。它的特征是通过氧和硫原子与锌结合的两个吡啶衍生的螯合配体。它的iupac名称是双(2-吡啶硫基)锌1,1’二氧化物并且由下式代表：
吡硫锌以其在治疗头皮屑和脂溢性皮炎中的用途而广为熟知。它也用于医疗应用中，例如治疗牛皮癣、湿疹、癣、足癣、特应性皮炎、癣和白癜风。
食品准许的抗微生物组分(ii)可以描述为“食品级”，即它们是可以被消耗而没有任何健康危害的抗微生物物质。食品准许的抗微生物剂通过它们的e号标签识别，该e号标签表明该物质被欧洲食品安全管理局批准用于在食品中使用。本发明的食品准许的抗微生物剂选自亚硫酸钠(e221)，亚硫酸氢钠(e222)，焦亚硫酸钠(e223)，焦亚硫酸钾(e224)，亚硫酸钾(e225)，亚硫酸钙(e226)，亚硫酸氢钙(e227)，亚硫酸氢钾(e228)，硝酸钠(e251)，硝酸钾(e252)，以及溶菌酶(e1105)。
在第一实施例中，该食品准许的抗微生物组分(ii)是选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、或亚硫酸氢钾、硝酸钠以及硝酸钾。
在第二个实施例中，食品准许的抗微生物组分(ii)是选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、以及亚硫酸氢钾、特别地亚硫酸钠。
在第三个实施例中，食品准许的抗微生物组分(ii)是选自硝酸钠和硝酸钾，特别地硝酸钠。
在第四个实施例中，食品准许的抗微生物组分(ii)是溶菌酶。
在第五个实施例中，食品准许的抗微生物组分(ii)是选自亚硫酸钠(ii-a)、亚硫酸氢钠(ii-c)和溶菌酶(ii-b)。
在第六个实施例中，食品准许的抗微生物组分(ii)是选自亚硫酸钠(ii-a)和溶菌酶(ii-b)。
在第七个实施例中，设想了以下任何组合：吡硫锌和亚硫酸钠；吡硫锌和亚硫酸氢钠；吡硫锌和焦亚硫酸钾；吡硫锌和亚硫酸钾；吡硫锌和亚硫酸钙；吡硫锌和亚硫酸氢钙；吡硫锌和亚硫酸氢钾；吡硫锌和硝酸钠；吡硫锌和硝酸钾；以及吡硫锌和溶菌酶。
本发明的组合具有抗广泛范围微生物例如细菌、真菌和酵母的抗微生物活性。细菌包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。
如在此使用的“控制”，被定义为包括微生物的消除、杀死、或抑制、或减少或抑制微生物例如细菌、真菌和酵母的生长或增殖。
本发明的组合在保护食品抵抗被微生物例如细菌、真菌、和酵母微生物攻击中是有用的。这可以通过将本发明的组合合结合到用于包装食品的材料中来完成。可替代地，这些食品包装材料可以用包括本发明的组合的组合物涂覆。
在一个实施例中，本发明涉及作为组分(i)的吡硫锌和作为组分(ii)的食品准许的抗微生物剂的组合用于通过用所述组合涂覆食品包装材料或在所述食品包装材料中结合所述组合以控制用该食品包装材料包装的食品上的微生物的生长的用途，该抗微生物剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶，其中组分(i)与组分(ii)的重量比在从4:1至1:4的范围内，以提供协同抗微生物作用。
在另一个实施例中，本发明还涉及一种控制用食品包装材料包装的食品上的微生物的生长的方法，该方法包括用作为组分(i)的吡硫锌和作为组分(ii)的的食品准许的抗微生物剂的组合涂覆所述食品包装材料或将其结合入所述食品包装材料中，该抗微生物剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶，其中组分(i)与组分(ii)的重量比在从4:1至1:4的范围内，以提供协同抗微生物作用。
食品包装材料可以是例如食品类被包裹在薄膜中的薄膜包装、塑料包裹、塑料袋类型包装、纸或纸聚合物复合片、塑料瓶或小瓶、玻璃瓶、纸板盒或纸箱。这些食品包装材料由例如纸、纸板、石蜡、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、交联或非交联的聚丙烯、乙烯-乙烯醇聚合物、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、和聚酰胺制造。
用包括根据本发明的作为组分(i)的吡硫锌和作为组分(ii)的食品准许的抗微生物剂的组合的组合物涂覆的食品包装材料，或结合了作为组分(i)的吡硫锌和作为组分(ii)的食品准许的抗微生物剂的组合的食品包装材料也是本发明的部分。
本发明的组合还在防止卫生问题像表面上不希望的细菌、真菌或藻类生长，安全问题像在封闭的水系统中存在军团菌、医院中的医院内感染、存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)，气味问题(像在纤维织物像袜子、毛巾、保护性制服、鞋内衬中或在过滤器中或地板覆盖物中)是有用的。本发明也可能保护用超卫生的聚合物涂覆的区域或物品，像用于制造电气装置如灯开关和开关板；卫生洁具如马桶座；以及门把手、扶手、婴儿换尿布台、电话以及需要最高水平的卫生保护的其他最终用途。
本发明的组合还在保存木材、木制品、皮革、天然或合成纺织品、纤维、非纺织物、工业纺织品、增塑材料和非增塑热塑性塑料如聚丙烯、聚氯乙烯等、纸张、墙纸、绝缘材料、层压制品、氨基模塑化合物、油漆和涂料、织物、地面覆盖物、合成纤维如增塑聚合物、粗麻布、绳和纤维绳以及可生物降解材料中是有用的，并且保护所述材料抵抗细菌或真菌的攻击和破坏。作为可以用根据本发明的组合物保存的木材或木制品，例如木制品如原木、木料、铁路枕木、电线杆，栅栏，木材覆盖物，柳条制品，窗和门，胶合板，刨花板，华夫板，木屑压合板，细木工制品，在暴露的环境的地面以上所使用的原木(如在接触地面或淡水或盐水环境中所使用的盖板和原木)，桥梁或通常在房屋建筑、建筑和木器中使用的木制品是被考虑的。除了可从用本发明的组合物处理中受益的木材以外的作为可生物降解材料包括纤维素材料如棉花。
在一个实施例中，本发明涉及控制在木材、木制品和可生物降解材料上微生物生长的方法，该方法包括将抗微生物有效量的组分(i)和组分(ii)的组合施加到木材、木制品、皮革、天然或合成纺织品、纤维、非纺织物、工业纺织品、增塑材料和非增塑热塑性塑料如聚丙烯、聚氯乙烯等、纸张、墙纸、绝缘材料、层压制品、氨基模塑化合物、油漆和涂料、织物、地面覆盖物、合成纤维如增塑聚合物、粗麻布、绳和纤维绳上，其中组分(i)与组分(ii)的重量比在从4:1至1:4的范围内，以提供协同抗微生物作用。
本发明的组合在若干工业生产(像与流体接触或涉及流体运输的垫片、管道和管材，在食品运输、加工或生产中使用的输送带、表面和塑料部件)以及医疗活动(像医疗设备和装置(像医用导管、起搏器、implant、外科手术设备和无菌纺织品))中控制微生物污染或生物膜形成也是有用的。
本发明的组合对控制表面上的细菌、真菌或藻类生长并由此引起所考虑材料的美学问题也是有用的。
本发明的组合对保护工程材料抵抗微生物也是有用的。旨在被保护的工程材料可以是可以被微生物侵染或分解的胶类、胶料、油漆和塑料物品、冷却润滑剂、含水液压流体和其他非生命材料。
在一个实施例中，本发明涉及一种在工业材料上控制微生物生长的方法，该方法包括将抗微生物有效量的组分(i)和组分(ii)的组合施加到待处理的工业材料上，其中组分(i)与组分(ii)的重量比在从4:1至1:4的范围内，提供协同抗微生物作用。
根据本发明的组合还可以用于保护植物、或植物部分，例如果实、花朵、花卉、叶子、茎、根、插条、植物的块茎、果实和种子。
在一个实施例中，本发明涉及一种在植物、植物部分、果实和种子上控制微生物生长的方法，该方法包括将抗微生物有效量的组分(i)和组分(ii)的组合施加到待处理的植物、植物部分、果实和种子上，其中组分(i)与组分(ii)的重量比在从4:1至1:4的范围内，以提供协同抗微生物作用。
当与包括单独的组分(i)或单独的组分(ii)作为活性成分的组合物相比时，包括组分(i)和组分(ii)的组合的本发明的组合物中的组分(i)和组分(ii)的相对比例是产生协同抗微生物作用的那些比例。可以使用如在实验1中所述的毒物平板试验(poisonplateassay)来测量协同抗微生物作用。在本发明的组合中组分(i)与组分(ii)的以重量计的量的具体比例在从4:1至1:4，或从3:1至1:3，或从2:1至1:2的范围内。
根据本发明的组合中的每种活性成分的量将使得获得协同的抗微生物作用。即用的组合物中的组分(i)和组分(ii)的浓度也取决于使用这些组合物的特定条件。特别地，预期即用的本发明的组合物包含在从10mg/l至10g/l范围内的组分(i)。组分(ii)以从10mg/l至10g/l范围内的量存在。
根据本发明的组合物包含以具有重量比为4:1-1:4，以提供协同的抗微生物作用的相应比例的组分(i)和组分(ii)的组合，以及此外一种或多种可接受的载体。
这些载体是与组分(i)和(ii)的组合物配制在一起的以便促进其应用/散播到待处理的场所，例如通过溶解、分散、或扩散所述组合物，和/或便于其储存、运输或处理而不损害其抗微生物效力的任何材料或物质。所述可接受的载体可以是固体或液体或已经被压缩以形成包括被描述为超临界流体的物理条件的液体的气体，即，本发明的组合物可适合地用作浓缩物、乳液、乳油、油混溶悬浮液浓缩物、油混溶性液体、可溶性浓缩物、溶液、颗粒剂、粉剂、喷雾剂、气雾剂、丸剂或散剂。
在许多情况下，有待直接使用的抗微生物组合物可以从浓缩物(例如像可乳化浓缩物，悬浮液浓缩物，或可溶性浓缩物)获得，当用水性或有机介质稀释时，这样的浓缩物旨在被如在本发明的定义中所使用的术语组合物来覆盖。这些浓缩物在使用前不久可以在喷雾罐中稀释成即用混合物。优选地，本发明的组合物包含按重量计从约0.01至95％的组分(i)和(ii)的组合。更优选地这个范围是按重量计从0.1至90％。最优选地这个范围是按重量计从1至80％，这取决于为特定应用目的所选择的制剂类型，如下文进一步详细解释的。
可乳化浓缩物是作为在水中稀释后以乳液形式应用的组分(i)和(ii)的液体均匀制剂。悬浮液浓缩物是旨在于使用前用水稀释的在流体中的活性成分的稳定的悬浮液。可溶性浓缩物是在水中稀释后作为活性成分的真溶液应用的均匀液体制剂。
在另一个实施例中，本发明还涉及仅包含两种抗微生物成分(即作为组分(i)的吡硫锌和作为组分(ii)的选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶的食品准许的抗微生物剂)，不存在其他抗微生物成分的组合以及一种或多种载体的组合物。这也适用于如在本发明中所述的处理方法。因此，还涵盖了包含吡硫锌作为组分(i)和作为组分(ii)的的食品准许的抗微生物剂，不存在其他抗微生物成分的组合，以及一种或多种载体的组合物，该抗微生物剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶，其中组分(i)与组分(ii)的重量比在从4:1至1:4的范围内，以提供协同抗微生物作用。在这些抗微生物组合物中的组分(i)与组分(ii)的以重量计的量的合适的比例在在从4:1至1:4，或从3:1至1:3，或从2:1至1:2范围内。在下文描述了载体。
针对致植物病的微生物的收获的作物的收获后处理可以防止或减少某些收获后储存病症，例如像晒焦、枯萎、软化、衰败病、皮孔斑、苦陷病、褐变、水心病、维管破裂等。
根据本发明的抗微生物组合物可以在作物，特别是果实的收获后处理中使用。在后者情况下，将果实喷洒或浸入或浸泡到液体配制品中，或者果实可用蜡状组合物包衣。后者的蜡状组合物便利地通过将悬浮液浓缩物与合适的蜡充分混合来制备。用于喷雾，浸渍或浸泡应用的配制品可以通过用水性介质稀释浓缩物例如像可乳化的浓缩物，悬浮液浓缩物或可溶性液体来制备。这种浓缩物在大多数情况下由活性成分，分散剂或悬浮剂(表面活性剂)，增稠剂，少量有机溶剂，润湿剂，任选的一些防冻剂和水组成。
本发明的抗微生物组合物也可以用于保护种子抵抗微生物。为了那种效果，可以将本发明的抗微生物组合物涂覆在种子上，在这种情况下，谷物种子用活性成分的液体组合物连续地浸泡，或者如果将它们用先前组合的组合物包衣。也可以使用例如旋转盘式雾化器将组合物喷雾或雾化到种子上。
组分(i)和(ii)的组合优选以组合物的形式应用，其中两种所述组分紧密混合，以确保同时给予到待保护的材料上。组分(i)和(ii)的给予或应用也可以是“顺序组合”的给予或应用，即组分(i)和一种或多种组分(ii)在相同的地方交替地或顺序地给予或应用，以这样的方式，它们将必然在待处理的场所混合在一起。这将实现，即如果在短时间内(例如，在少于24小时，优选少于12小时)进行连续给予或应用。在木材保存的情况下，木材通常在单独的应用之间需要干燥，因此，在相继应用之间的时间可能会扩大到几周直到用于第一处理的溶剂已经蒸发和/或木材达到木材湿度含量再次适用于抗微生物制剂的应用。这个可替代的方法可以例如通过使用合适的单个包装来进行，所述单个包装包括至少一个填充有包括活性组分(i)的制剂的容器和至少一个填充有包括活性组分(ii)的制剂的容器。因此，本发明还涵盖一种产品，包含：
-(a)包括吡硫锌，或其盐作为组(i)的组合物；和
-(b)包括作为组分(ii)选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钾、亚硫酸钾、亚硫酸钙、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钾、硝酸钠、硝酸钾、以及溶菌酶的食品准许的抗微生物剂的组合物；
作为用于同时或顺序使用的组合，其中所述组合物(a)和(b)是以具有组分(i)和组分(ii)的重量比从4:1至1:4的范围的相应比例，以提供协同的抗微生物作用。这些产品可以由包括单独的容器的适合的包装组成，其中每个容器包括组分(i)或组分(ii)，优选地以配制的形式。一般而言，这些配制形式具有与对于含有两种活性成分的配制品所述的相同的组合物。
用于在本发明的组合物中使用的适当的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于配制品领域中已知的合适的物质，例如像天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、表面活性剂、润湿剂、粘合剂、增稠剂、粘结剂、肥料或防冻剂。
组分(i)和(ii)以未改性的形式使用，或优选地与配制品领域中常规使用的佐剂一起使用。因此，它们按照本领域已知的程序配制成可乳化的浓缩物，直接可喷雾的或可稀释的溶液，稀释乳剂，可湿性粉剂，可溶性粉剂，粉剂，颗粒剂，以及在例如聚合物物质中的封装剂。如同组合物的性质一样，根据预期的目的和普遍的环境来选择应用方法，例如喷雾、雾化、撒粉、分散、倾倒、产生烟雾和热雾化(thermonebulisation)。
配制品(即包括活性成分和，在适当的情况下，固体或液体佐剂的组合物、制剂或混合物)以已知的方式(例如，通过均匀混合和/或研磨活性成分与增充剂，例如溶剂，固体载体和，在适当的情况下，表面活性化合物(表面活性剂))来制备。
合适的溶剂是芳族烃，优选地含有8至12个碳原子的馏分，例如二甲基苯混合物或取代的萘，邻苯二甲酸酯如邻苯二甲酸二丁酯或邻苯二甲酸二辛酯；脂肪族或脂环族烃如环己烷或石蜡；醇和二醇以及它们的醚和酯，如乙醇，乙二醇，乙二醇单甲醚或单乙醚；酮类如环己酮；强极性溶剂如n-甲基-2-吡咯烷酮，二甲基亚砜或二甲基甲酰胺；以及植物油或环氧化植物油如环氧化椰子油或大豆油；或水。
用于例如粉剂和可分散性粉剂的固体载体通常是天然矿物填料，如方解石、滑石、高岭土、蒙脱土或绿坡缕石。为了改进物理性质，还可能加入高度分散的硅酸或高度分散的吸收性聚合物。合适的颗粒状吸收性载体是多孔型的，例如浮石、碎砖、海泡石或膨润土；并且合适的非吸收性载体是以下材料如方解石或沙。此外，可以使用许多无机或有机性质的预先颗粒化的材料，例如，尤其是白云石或粉碎的植物残渣。
用于本发明组合物中的合适的表面活性化合物是具有良好的乳化，分散和润湿性能的非离子型、阳离子型和/或阴离子型表面活性剂。术语“表面活性剂”也应被理解为包含表面活性剂的混合物。
用于本发明的组合物中的适当的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于本领域中已知的用于制备用于处理植物或它们的部位，或用于处理植物产品，特别是用于处理木材的制剂的合适的物质，例如像天然的或再生的矿物质、溶剂、分散剂、表面活性剂、润湿剂、粘合剂、增稠剂、粘结剂、肥料、防冻剂、驱虫剂、着色添加剂、缓蚀剂、防水剂、干燥剂、稳定剂和其他活性成分。
合适的阴离子表面活性剂可以是水溶性肥皂和水溶性合成表面活性化合物。
合适的皂类是高级脂肪酸(c10-c22)的碱金属盐，碱土金属盐或未取代的或取代的铵盐，例如，油酸或硬脂酸的，或可以从例如椰子油或牛脂油获得的天然脂肪酸混合物的钠盐或钾盐。此外，还可以提及脂肪酸甲基牛磺酸盐。
然而，更频繁地使用所谓的合成的表面活性剂，特别地脂肪磺酸盐，脂肪硫酸盐，磺化苯并咪唑衍生物或烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或硫酸盐通常为碱金属盐，碱土金属盐或未取代或取代的铵盐形式，并且包含具有从8至22个碳原子的烷基，所述烷基还包括衍生自酰基的基团，例如木素磺酸，十二烷基硫酸盐或从天然脂肪酸获得的脂肪醇硫酸盐的混合物的钠或钙盐。这些化合物还包括脂肪醇/环氧乙烷加合物的硫酸酯和磺酸的盐。磺化苯并咪唑衍生物优选地包含2个磺酸基团和一个含有8至22个碳原子的脂肪酸基团。烷基芳基磺酸盐的实例是十二烷基苯磺酸，二丁基萘磺酸，或萘磺酸/甲醛缩合产物的钠盐、钙盐或三乙醇胺盐。相应的磷酸盐也是合适的，例如，具有4至14摩尔的环氧乙烷的对-壬基酚的加合物的磷酸酯，或磷脂的盐。
非离子表面活性剂优选地为脂族醇或脂环族醇，或者饱和或不饱和脂肪酸和烷基酚的聚二醇醚衍生物，所述衍生物在(脂族)烃部分中含有3至10个二醇醚基团和8至20个碳原子，以及在烷基酚的烷基部分中含有6至18个碳原子。
另外的合适的非离子表面活性剂是聚环氧乙烷与聚丙二醇、在烷基链中含有1至10个碳原子的乙二胺聚丙二醇的水溶性加合物，该加合物含有20至250个乙二醇醚基团和10至100个丙二醇醚基团。这些化合物通常每个丙二醇单元含有1至5个乙二醇单元。
非离子表面活性剂的代表性实例是壬基酚-聚乙氧基乙醇、蓖麻油聚乙二醇醚、聚丙烯/聚环氧乙烷加合物、三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇。聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯，例如聚氧乙烯脱水山梨醇三油酸酯也是合适的非离子表面活性剂。
实验部分
实验1：毒物平板试验
组分(i)的名称：吡硫锌
组分(ii)的名称：亚硫酸钠(ii-a)
溶菌酶(ii-b)
储备溶液：在无菌去离子水中8000ppm。
在以上测试组合中，产品a是组分(i)，即吡硫锌，并且产品b是组分(ii)，即亚硫酸钠(ii-a)或溶菌酶(ii-b)。
总活性的浓度系列：按以下1/3步长增加的24个浓度的系列：0.27-0.35-0.47-0.63-0.84-1.13-1.50-2.00-2.67-3.56-4.75-6.33-8.44-11.25-15.00-20.00-26.70-35.60-47.46-63.28-84.38-112.50-150.00-200.00ppm。
培养基：细菌：营养肉汤(3g牛肉提取物和5g蛋白胨在1升去离子水中，ph＝6.8.)。
实验装置：含有300μlpf接种物加每孔0.75μl400x浓度的测试化合物的储备溶液的96孔板。
测试生物的种类：大肠杆菌lmg8063
金黄色葡萄球菌lmg8195/atcc6538p
接种物：将营养培养基用正在活跃地生长的测试细菌的液体培养物接种。
培养条件：28℃，70％相对湿度，在黑暗中孵育。
评估：接种后7天
协同作用计算：记录mic值(以ppm总活性成分计的最小抑制浓度)，并使用协同指数方法(kull，f.c.，p.c.eismann,h.d.sylvestrowicz,和r.l.mayer(1961)“季铵化合物和长链脂肪酸的混合物作为抗真菌剂”appliedmicrobiology[应用微生物学]9:538-541；还参见steinberg,d.c.(2000)“测量协同作用”cosmetics&toiletries[化妆品&化妆用具]115(11):59-62)计算协同作用。
其中：
·qa是化合物a以ppm的浓度，单独作用，产生终点(例如mic)，
·qa是化合物a以ppm的浓度，在混合物中，产生终点(例如mic)，
·qb是化合物b以ppm的浓度，单独作用，产生终点(例如mic)，
·qb是化合物b以ppm的浓度，在混合物中，产生终点(例如mic)，
当协同指数比1.0大时，表明了拮抗作用。当si等于1.0时，表明了加合作用。当si少于1.0时，证明了写协同作用。
表1：针对大肠杆菌测试mic值(以ppm计的最小抑制浓度)和吡硫锌(组分(i))与亚硫酸钠(ii-a)的组合的协同指数
表2：针对金黄色葡萄球菌测试mic值(以ppm计的最小抑制浓度)和吡硫锌(组分(i))与溶菌酶(ii-b)的组合的协同指数
实验2:毒物平板试验
组分(i)的名称：吡硫锌
组分(ii)的名称：亚硫酸氢钠(ii-c)
储备溶液：在无菌去离子水中8000ppm。
在以上测试组合中，产品a是组分(i)，即吡硫锌，并且产品b是组分(ii)，即亚硫酸氢钠(ii-c)。
总活性的浓度系列：按以下1/3步长增加的24个浓度的系列：0.27-0.35-0.47-0.63-0.84-1.13-1.50-2.00-2.67-3.56-4.75-6.33-8.44-11.25-15.00-20.00-26.70-35.60-47.46-63.28-84.38-112.50-150.00-200.00ppm。
培养基：半强度马铃薯葡萄糖肉汤(2g马铃薯浸液和10g蛋白胨葡萄糖在1升去离子水中)
实验装置：含有300μlpf接种物加每孔0.75μl400x浓度的测试化合物的储备溶液的96孔板。
测试生物的种类：酿酒酵母cbs8803
接种物：将营养培养基用正在活跃地生长的测试细菌的液体培养物接种。
培养条件：28℃，70％相对湿度，在黑暗中孵育。
评估：接种后7天
协同计算：如实验1的方法
表3：针对酿酒酵母测试mic值(以ppm计的最小抑制浓度)和吡硫锌(组分(i))与亚硫酸氢钠(ii-c)的组合的协同指数。