本发明涉及坛紫菜，尤其是涉及一种坛紫菜双单倍体(Double haploid)育种的方法。
背景技术：
坛紫菜(Pyropia haitanensis)是我国紫菜人工栽培的两个主要种类之一，原产于我国福建沿海，是我国特有的暖温带性种类。自上世纪60年代全人工栽培取得成功以来，坛紫菜的栽培面积不断扩大，目前已成为我国南方沿海海水养殖的主要对象之一，其产量占全国紫菜总产量的75％以上，创造了极其可观的经济效益。随着坛紫菜产业的发展，对良种的需要更为迫切和多元化，传统的坛紫菜育种方法包括选择育种、诱变育种、杂交育种等，均需要经过多代的遗传纯化，才能获得性状稳定遗传的优良品系，耗费的时间长，效率低。
坛紫菜的生活史可以分为形态结构完全不同的两个世代：叶状体世代和丝状体世代。叶状体世代为单倍体，是海上人工栽培和收获的对象；而丝状体世代则为双倍体，是室内人工育苗的对象，可以作为种质材料长期保存。坛紫菜生活史世代交替的减数分裂过程发生于丝状体放散的壳孢子的第一次和第二次分裂时期，随后产生的4个子细胞继续分裂，最终发育成为一株由2～4块遗传组成不同的藻块嵌合而成的叶状体(Yan XH,Li L and Agura Y.Genetic analysis of the position of meiosis in Porphyra haitanensis Chang et Zheng(Bangiales,Rhodophyta).Journal of Applied Phycology,2005,17:467-473；ZhangY,Yan XH and Aruga Y.The sex and sex determination in Pyropia haitanensis(Bangiales,Rhodophyta).PloS one,2013,8(8):e73414.)。因此，在传统的坛紫菜杂交育种中，所获得的杂交子代个体均为嵌合体，不能作为一个个体进行多代纯化，必须通过其它方法分离各个藻块后，再进行多代纯化，但通常的杂交子代嵌合体各个藻块间没有明显的区分标记，无法单独分离各个藻块。色素突变体的采用为这个问题的解决提供了有效的方法，将具不同颜色的坛紫菜藻体杂交后，在杂交子代嵌合体上就可以明显地区分出不同颜色的藻块，从而根据颜色的不同就可以分离各个藻块。
双单倍体(Double haploid)是指单倍体细胞经人工或自发染色体加倍后形成的二倍体细胞。采用诱导双单倍体的方法进行育种可以快速地获得基因纯合的个体；此外，由于双单倍体不存在基因间的显隐性作用，一些由隐性基因决定的性状也可以得到充分利用，因此双单倍体诱导是育种中加速种质材料纯化、缩短育种年限的有效途径，在植物的人工育种中已经被广泛应用，但在大型海藻育种中尚未见到报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供可在较短时间内选育出具有各种优良性状的纯系，显著缩短坛紫菜育种年限的一种坛紫菜双单倍体育种的方法。
本发明包括以下步骤：
1)选择杂交亲本；
在步骤1)中，所述选择杂交亲本，应选择各具不同优良性状、不同性别的坛紫菜纯系藻体作为杂交亲本，且两个亲本藻体的颜色应能明显区分。
2)分别促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子，收集壳孢子于消毒海水中培养以获得亲本叶状体；
在步骤2)中，所述分别促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子可用充气加水流刺激法分别促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子；所述培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。
3)培养亲本叶状体后，分别选择健康的雌雄叶状体作为亲本，进行杂交实验；
在步骤3)中，所述培养亲本叶状体可培养50d。
4)进行雌雄叶状体的混合培养，再去掉雄性叶状体，保留雌性叶状体进行单棵培养，直至果孢子放出为止；
在步骤4)中，所述进行雌雄叶状体的混合培养可按1︰1的比例进行雌雄叶状体的混合培养；所述再去掉雄性叶状体，可2周后再去掉雄性叶状体；所述单棵培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。
5)将收集到的果孢子单个培养于试管中，直至萌发成杂合丝状体，再将丝状体藻落打碎后，继续培养；
在步骤5)中，所述继续培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000～2000Lx，12L:12D。
6)待杂合丝状体长至足够量时，取出部分丝状体进行促熟，并促使成熟的杂合丝状体释放壳孢子，收集到的壳孢子经筛绢过滤后，置于培养瓶中培养，获得F1代叶状体；
在步骤6)中，所述促熟的培养条件可为：温度28±1℃、光强1000Lx，光周期8L：14D；所述促使成熟的杂合丝状体释放壳孢子可用充气加水流刺激法促使成熟的杂合丝状体释放壳孢子；所述筛绢可采用网孔为50μm的筛绢；所述培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。
7)F1代叶状体培养后，挑出叶状体，于解剖镜下观察，分别取各个不同颜色的藻块放置于葡萄糖溶液中浸泡，再转移至海螺酶溶液中酶解，观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞或多细胞团时，挑取单个细胞置于96孔板的F1培养液中培养；
在步骤7)中，所述F1代叶状体培养，可培养30d；所述分别取各个不同颜色的藻块放置于葡萄糖溶液中浸泡，可用打孔器分别取各个不同颜色的藻块放置于2mol/L的葡萄糖溶液中浸泡10min；所述酶解的酶液配方可为：0.12g海螺酶+1.27g甘露醇+2.2mg无水CaCl2+2.4mgMgSO4+10ml盐度为37的消毒海水，pH调至6.0～6.2；所述酶解的条件可为：黑暗振荡，温度为27℃，酶解时间为1～2h；所述观察细胞解离状况，可每隔30min观察细胞解离状况；所述FI培养液的配方可为：NaNO3 2.125×10-2g，KI4.2×10-4g，NaH2PO4 3×10-3g，柠檬酸铁1.3×10-4g，Tris 3.028×10-2g，VB1 2.5×10-7g，HBO3 1.546×10-2g，VB2 5.0×10-7g，加消毒海水定容至500ml，培养液使用前需高温消毒(90～95℃；所述培养条件可为：温度21±1℃、光强1000～2000Lx，光周期12L：12D。
8)用消毒海水更换1/2F1培养液，直至培养液恢复为正常的消毒海水，再继续培养，即可看到96孔板中单倍体的单细胞被诱导成了双倍体的纯系丝状体，即双单倍体诱导成功；
在步骤8)中，所述用消毒海水更换1/2F1培养液，可每隔12h用消毒海水更换1/2F1培养液，连续更换3～4次；所述继续培养的条件可为光照1000～2000Lx，12L:12D，温度20±1℃，每7d更换一次消毒海水，培养20～30d。
9)将96孔板中的纯系丝状体分别吸出置于广口瓶中静水扩大培养，并作为种质保存；
在步骤9)中，所述扩大培养的条件可为：温度21±1℃、光强1000～2000Lx，光周期12L：12D。
10)待纯系丝状体长至足够量时，取出部分丝状体进行促熟，待丝状体成熟后，促使成熟的纯系丝状体放散壳孢子，收集壳孢子于消毒海水中培养，获得F2代纯系叶状体；
在步骤10)中，所述促熟的培养条件可为：温度28±1℃、光强1000Lx，光周期8L：14D；所述促使成熟的纯系丝状体放散壳孢子，可用充气加水流刺激法促使成熟的纯系丝状体放散壳孢子；所述收集壳孢子于消毒海水中培养的条件可为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D。
11)对F2代纯系叶状体进行性状测定和评价，从中挑选出符合育种预期的纯系经中试应用确认性状稳定后，即完成坛紫菜双单倍体育种。
本发明采用色素突变体和野生色型藻体杂交，并通过DH诱导进行谈紫菜育种，可在较短时间内选育出具有各种优良性状的纯系，显著缩短坛紫菜育种年限的一种坛紫菜双单倍体育种的方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
1、以福建省坛紫菜种质资源库保存的具高壳孢子放散量，但生长速度慢，对高温敏感的坛紫菜野生型纯系YSⅢ(♂)和经过人工诱变选育的具有高产、耐高温性状的红色型坛紫菜纯系RTPM(♀)作为杂交亲本。
2、用充气加水流刺激法分别促使两亲本成熟的纯系丝状体放散壳孢子，收集壳孢子于消毒海水中培养以获得亲本叶状体(培养条件为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D)。
3、培养亲本叶状体50d后，分别选择健康的雌雄叶状体作为亲本，进行杂交实验。
4、以1︰1的比例进行雌雄叶状体的混合培养，2周后去掉雄性叶状体，保留雌性叶状体进行单棵培养，直至果孢子放出为止(培养条件为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D)。
5、将收集到的果孢子单个培养于试管中，直至萌发成杂合丝状体，当丝状体藻落生长到一定大小时，用组织粉碎机将其打碎后，继续培养(培养条件为：温度20±1℃，光照1000～2000Lx，12L:12D)。
6、待杂合丝状体长至足够量时，取出部分丝状体进行促熟(促熟的培养条件为：温度28±1℃、光强1000Lx，光周期8L：14D)，并用充气加水流刺激法促使成熟的杂合丝状体释放壳孢子，收集到的壳孢子经筛绢(网孔50μm)过滤后，置于500ml培养瓶中培养，获得F1代叶状体(培养条件为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D)。
7、F1代叶状体培养30d后，挑出叶状体，于解剖镜下仔细观察，用打孔器分别取各个不同颜色的藻块(一共取了96个藻块)放置于2mol/L的葡萄糖溶液中浸泡10min，然后再转移至海螺酶溶液中酶解(酶液配方：0.12g海螺酶+1.27g甘露醇+2.2mg无水CaCl2+2.4mgMgSO4+10ml盐度为37的消毒海水，pH调至6.0～6.2)，酶解条件：黑暗振荡，温度为27℃，酶解时间为1～2h；酶解期间每隔30min观察细胞解离状况，当在显微镜下观察到藻体碎片游离出大量单细胞或多细胞团时，用显微操作器挑取单个细胞置于96孔板的F1培养液中培养(FI培养液配方：NaNO3 2.125×10-2g，KI4.2×10-4g，NaH2PO4 3×10-3g，柠檬酸铁1.3×10-4g，Tris 3.028×10-2g，VB1 2.5×10-7g，HBO3 1.546×10-2g，VB2 5.0×10-7g，加消毒海水定容至500ml，培养液使用前需高温消毒(90～95℃))。培养条件为：温度21±1℃、光强1000～2000Lx，光周期12L：12D。
8、每隔12h用消毒海水更换1/2F1培养液，连续更换4次，使培养液恢复为正常的消毒海水。接着，继续置于正常培养条件(光照1000～2000Lx，12L:12D，温度20±1℃，每7d更换一次消毒海水)培养25d，即可看到96孔板中有75个单倍体的单细胞被诱导成了双倍体的纯系丝状体，另有21个单细胞没有诱导成功。
9、将96孔板中诱导成功的纯系丝状体分别吸出置于125ml广口瓶中静水扩大培养(培养条件为：温度21±1℃、光强1000～2000Lx，光周期12L：12D)，并作为种质保存。
10、待各个纯系丝状体长至足够量时，取出部分丝状体进行促熟(促熟的培养条件为：温度28±1℃、光强1000Lx，光周期8L：14D)，待丝状体成熟后，用充气加水流刺激法促使成熟的纯系丝状体放散壳孢子，收集壳孢子于消毒海水中培养以获得F2代纯系叶状体(培养条件为：温度20±1℃，光照1000Lx，12L:12D)。
11、对各个纯系的F2代叶状体进行性状测定和评价，从中挑选出了一个具有壳孢子放散量大、生长速度快、耐高温能力强的的纯系Z-81，经中试应用确认Z-81的性状稳定性后即完成了Z-81双单倍体育种的过程。