复合低温冻存体系冷冻雪旺细胞的方法与流程

本发明属于细胞低温冻存技术领域，具体涉及一种冷冻雪旺细胞的方法。

背景技术：

神经的修复和再生一直是生物学和组织工程的研究热点，而雪旺细胞(schwanncell)在神经的再生方面起到了重要的作用。因此许多相关的的研究都需要用到雪旺细胞，那么如何体外大量的存储雪旺细胞就成了一大难题，而低温冻存是目前最常见且有效的保存方法。

低温冻存是将细胞置于在超低温(通常为-80℃或更低)环境中，抑制细胞的新陈代谢以达到长期储存的目的。目前，低温冻存技术已经成功应用到干细胞、血红细胞、肝细胞、精子、卵母细胞、骨骼细胞、皮肤、角膜等细胞和组织的保存过程中。关于细胞的低温冻存国内外已有相关文献报道。低温冻存的方法主要有程序化慢速冻存和玻璃化冻存两种，在冷冻过程中的损伤主要由如下两个的因素造成：(1)溶液损伤：降温过程中细胞外溶液中水先结晶，使得细胞外液渗透压加大，细胞内的水分会大量渗透到细胞外溶液中，导致细胞脱水急剧收缩，造成细胞损伤甚至死亡；(2)细胞内冰晶损伤：同样在降温过程中，当温度达到细胞内液的冰点时，细胞内液中的水会开始结晶，对细胞造成不可避免的损伤，而冷冻保护剂可以减少细胞内的含水量起到保护细胞的作用。现阶段致力于优化冷冻方案的研究，寻找到一种安全、有效、简便的低温冻存方法。

冷冻保护剂指在细胞或组织低温冻存时保护细胞或组织的免受损伤的物质。冷冻保护剂按照保护机理的不同可以分为渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂两种。渗透性冷冻保护剂(permeablecryoprotectants，pc)又称“胞内冷冻保护剂”，它可以渗透到细胞内部，一般是小分子物质，容易渗透进入细胞内，将细胞内的大部分水置换出来，降低细胞外溶液的电解质浓度，使细胞内外渗透压减小，避免细胞脱水过多，同时它还可以使细胞内部溶液达到玻璃化所需要的浓度。常用的渗透性冷冻保护剂有二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油等。非渗透性冷冻保护剂(impermeablecryoprotectants，ipc)又称“细胞外液冷冻保护剂”，这种冷冻保护剂主要是大分子物质，它不能渗透到细胞内部，而是在细胞外的溶液中提高其渗透压，降低冰点，减少冰晶的形成，从而达到保护细胞或组织的目的。常见的非渗透性冷冻保护剂有蔗糖、海藻糖、葡萄糖、聚二乙醇等大分子物质和糖类。非渗透性冷冻保护剂一般是生物相容性良好没有细胞毒性的物质，因此通常将其和渗透性冷冻保护剂共同作用，一方面可以减少渗透性冷冻保护剂的用量，另一方面可以提高细胞和组织的保护效果。

超分子凝胶是一种物理交联凝胶，它是由少量的低分子凝胶因子通过分子间的非共价作用在介质(水或有机溶剂)中自组装形成的。因此超分子凝胶一般具有良好的可降解性和触变性，且是可逆的；由于非共价键的活化能相对较低，在受到外界环境的刺激后，超分子凝胶容易做出相应的响应。如通过氢键作用形成的超分子凝胶具有温度响应性；通过静电作用形成的超分子凝胶对ph和电解质浓度敏感等。

超分子凝胶可用于制备复合材料、生物传感器、载药材料等领域。但鲜见将超分子凝胶体系用于细胞的低温冻存的报道。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种利用新型复合低温冻存体系冷冻雪旺细胞的方法，该体系能减小雪旺细胞在冻存过程中受到的损伤，提高其复苏后的存活率并维持细胞功能，从而起到有效的冷冻保护作用。

为达到上述目的，采用技术方案如下：

复合低温冻存体系冷冻雪旺细胞的方法，包括以下步骤：

1)将氨基酸类凝胶因子加热溶于细胞培养基中，过滤、除菌，用含有凝胶因子的细胞培养基制备细胞悬浮液；

2)在0-4℃下形成超分子凝胶；

3)滴加含有复合冷冻保护剂的细胞培养基，待体系达到溶胀平衡；所述复合冷冻保护剂是由渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的混合；

4)放入冻存管在程序冻存盒冷冻，再将冻存管移入液氮中冻存。

按上述方案，所述氨基酸类凝胶因子按以下方法制备而来：

以boc-l-酪氨酸甲酯通过烷基化反应制备得到十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯(bdte)；

十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯通过水解反应制备得到十二烷基-boc-l-酪氨酸(bdt)，即为所述的氨基酸类凝胶因子。

按上述方案，所述的细胞培养基为rpmi1640培养基中加入10vol％胎牛血清和1vol％双抗后制备成的细胞全培养基。

按上述方案，所述的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜，非渗透性冷冻保护剂为海藻糖，二者终浓度分别为7.5～8.5vol％和0.045～0.055mol/l。

按上述方案，步骤3先滴加含有非渗透性冷冻保护剂的细胞培养基，再滴加含有渗透性冷冻保护剂的细胞培养基。

运用于细胞低温冻存过程中冻存保护剂添加时的k-k模型，有两个基本假设：(1)细胞内液是理想稀溶液；(2)细胞膜是均匀半透膜。k-k模型可以用以下公式表示：

其中，vc表示细胞体积，lp表示细胞膜对于水的渗透系数，ps表示细胞膜对于冻存保护剂的渗透系数，ac表示细胞膜的表面积，r表示理想气体常数，t表示绝对温度，ns表示细胞内溶液的同渗重摩，表示细胞内外溶液的平均同渗重摩，mn表示非渗透液体的同渗重摩，σ表示反射系数；下标n表示溶质，s表示冻存保护剂，上标i表示细胞内，e表示细胞外。

由于氨基酸类凝胶因子自组装形成的超分子凝胶通常具有独特的三维网状结构，在滴加冷冻保护剂时，凝胶发生溶胀，随着冷冻保护剂的滴加，达到溶胀平衡，此时细胞被超分子凝胶所包裹，减小了细胞膜对水和冷冻保护剂的渗透系数，可以有效的减缓细胞体积的变化，减缓细胞内外渗透压的剧烈变化，使得渗透性冷冻保护剂dmso渗透速率降低，减小了冷冻保护剂的渗透损伤，且由于非渗透性冷冻保护剂海藻糖的存在，使得细胞外液渗透压提高，降低了冰点，减少冰晶的形成，海藻糖还能在细胞外形成一层保护膜，同时减小了细胞受到的渗透损伤和冰晶损伤；在降温和复温过程中，因为超分子凝胶体系在空间上的限制，冰晶的生长和再结晶受到了抑制，从而减小了冰晶损伤。

渗透性和非渗透性冷冻保护剂的共同使用，一方面可以降低有毒的渗透性冷冻保护剂dmso的用量，另一方面可以提高细胞的冷冻保护效果。

先滴加含有非渗透性冷冻保护剂的细胞培养基，再滴加含有渗透性冷冻保护剂的细胞培养基。滴加非渗透性冷冻保护剂后，一方面增加了细胞外溶液的渗透压，另一方面非渗透性冷冻保护剂在细胞外形成了一层保护膜，与凝胶共同保护细胞；在滴加渗透性冷冻保护剂时，由于细胞外液渗透压加大，更加利于冷冻保护剂渗透进入细胞，同时由于有凝胶和非渗透性冷冻保护剂所形成的的双层保护膜，大大降低了渗透性冷冻保护剂造成的渗透损伤。

氨基酸类凝胶因子自组装形成的超分子凝胶具有热可逆性，因此在复温过程中，温度达到相转变温度以上时，超分子凝胶从凝胶态转变为液态，通过离心即可和细胞分离，在不增加操作的同时不会影响复温后细胞的增殖和分化。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

氨基酸类凝胶因子自组装形成的超分子凝胶是一种物理交联凝胶，它是由少量的低分子凝胶因子通过分子间的非共价作用在介质(水、有机溶剂)中自组装形成的。因此超分子凝胶一般具有良好的可降解性和触变性，且是可逆的；由于非共价键的活化能相对较低，在受到外界环境的刺激后，超分子凝胶容易做出相应的响应。同时本发明所用的氨基酸类凝胶因子具有良好的生物相容性。

由于氨基酸类凝胶因子自组装形成的超分子凝胶独特的三维网状结构，在含有凝胶因子的细胞悬浮液形成凝胶后滴加冷冻保护剂，细胞被超分子凝胶所包裹，使得冷冻保护剂渗透速率降低，减缓了细胞体积的变化细胞内外渗透压的剧烈变化，减小了冷冻保护剂的渗透损伤，由于非渗透性冷冻保护剂的存在，同时减低了渗透损伤和冰晶损伤；在降温和复温过程中，因为凝胶体系在空间上的限制，冰晶的生长和再结晶受到了抑制，从而减小了冰晶损伤；超分子凝胶具有热可逆性，因此在复温过程中，温度达到相转变温度以上时，超分子凝胶从凝胶态转变为液态，通过离心即可和细胞分离，在不增加操作的同时不会影响复温后细胞的增殖和分化。

在超分子凝胶体系的基础上同时使用渗透性和非渗透性冷冻保护剂，其中非渗透性冷冻保护剂一般是生物相容性良好没有细胞毒性的物质，因此将其和渗透性冷冻保护剂共同作用，一方面可以减少渗透性冷冻保护剂的用量，另一方面可以提高细胞的保护效果，所以两种冷冻保护剂的联用可以在低温冻存过程中起到更好的保护效果。

附图说明

图1：超分子凝胶体系室温(25℃)下在载玻片上的微观形貌图；

图2：超分子凝胶体系的相转变温度与凝胶因子浓度的关系；

图3：复合低温冻存体系冰水浴(0～4℃)中在载玻片上的微观形貌图；

图4：复合低温冻存体系的dsc测试结果；

图5：对照组和实验组细胞的存活率对比；

图6：mtt检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明进行详细的描述。下面的实施例只是对本发明作进一步的解释说明，但并非穷举，不对本发明做任何限制。

实施例1

超分子凝胶的制备及其性能：

1、制备凝胶因子bdt：

(1)十二烷基-boc-l-酪氨酸甲酯(bdte)的合成(boc-l-酪氨酸甲酯烷基化)：

称取3.998g(0.0135mol)boc-l-酪氨酸甲酯置于25ml圆底烧瓶中，加入10mldmf，待原料完全溶解后，再加入3.7113gk2co3(0.027mol)作为缚酸剂，后加入4ml溴代十二烷(0.0167mol)，室温反应12h。反应结束后加20ml水洗涤，抽滤、洗涤滤饼、真空干燥24h后得到得白色固体。无水乙醇(20ml)重结晶1次，得纯净的白色固体。

(2)bdt的合成(bdte的水解反应)：

将0.5007g(0.0011mol)bdte置于25ml烧瓶中用10ml乙醇溶解，在冰水浴下逐滴加入1mol/l的naoh溶液1.7ml(0.0017mol)，在0℃左右反应1h，室温反应5h。在强烈搅拌下向反应体系中逐滴加入0.2mol/l的冰盐酸(25ml)溶液至ph为1～2，抽滤，真空干燥24h得0.4858g白色固体。

该凝胶因子可以自组装形成具有三维网状结构的超分子凝胶体系，细胞被其包裹，使得冷冻保护剂渗透速率降低，减小了冷冻保护剂的渗透损伤；在降温和复温过程中，冰晶的生长和再结晶受到了抑制，从而减小了冰晶损伤。

2.超分子凝胶形貌表征所需溶液：将5mgbdt加入到1mlrpmi1640培养基中，置于60℃水浴中溶解，待其完全溶解后，冷却至室温，将其滴在载玻片上，置于光学显微镜下观察微观形貌，图1即为超分子凝胶体系室温(25℃)下在载玻片上的微观形貌图，可以看到凝胶因子在细胞培养液rpmi1640中自组装形成具有三维网状结构的超分子凝胶，该结构可以在冷冻过程中包裹细胞，起到减少冰晶损伤的作用。

3.取一定量的bdt加入到1mlrpmi1640培养基中，置于60℃水浴中溶解，分别配置成1g/l、1.5g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、8g/l的bdt培养基溶液，并用落球法测定其相转变温度，测试结果如图2所示。bdt浓度在1g/l至5g/l时相转变温度急剧增加，在浓度达到5g/l后，增加趋于平缓。随着凝胶因子浓度的增加，纤维数量增加，相互缠绕的机会增多，形成更加致密的三维网状结构，使得超分子凝胶体系的热稳定性增强，从而使超分子凝胶体系的相转变温度随之增加。

实施例2

复合低温冻存体系的制备及其性能：

取实施例1所得bdt加入到1mlrpmi1640培养基中，置于60℃水浴中溶解，待其完全溶解后滴加一定量含有复合冷冻保护剂的rpmi1640培养基溶液，制备成复合低温冻存体系待用。配置的复合体系的最终浓度为1.5g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖，并在冰水浴(0～4℃)中使用光学显微镜观察其微观形貌，如图3所示。凝胶因子在含有复合冷冻保护剂的rpmi1640培养基溶液中形成的超分子凝胶的微观结构有所不同，但仍呈现三维网状结构，在渗透性冷冻保护剂渗透时，由于细胞被超分子凝胶包裹住，渗透保护剂的渗透速度会大大降低，从而减小的渗透性冷冻保护剂对细胞造成的损伤。

取3mg实施例1所得bdt加入到1mlrpmi1640培养基中，置于60℃水浴中溶解，待其完全溶解后分别滴加等体积(1ml)含有16vol％dmso和16vol％dmso、0.1mol/l海藻糖的rpmi1640培养基溶液，制备成最终浓度为1.5g/lbdt、8vol％dmso和1.5g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖的两种低温冻存体系，用于dsc测试。

测试结果如图4，表明1.5g/lbdt、8vol％dmso低温冻存体系和1.5g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖低温冻存体系的冰点分别为-18.9℃和-19.8℃，说明海藻糖的添加可以降低整个体系的冰点。

实施例3

雪旺细胞的冷冻过程：

1.细胞培养基体系的配置：细胞培养基体系的配置：在rpmi1640培养基，加入10vol％胎牛血清和1vol％双抗，制备成细胞的全培养基。将全培养基分为两份，一份中加入实施例1所得bdt凝胶因子(浓度为1.5g/l)在60℃下溶解，待其完全溶解后过滤除菌，另一份不做任何处理，分别分装后置于4℃备用。

2.冷冻保护剂体系的配置：在全培养基中分别加入16vol％dmso、32vol％dmso、0.2mol/l海藻糖，0.22μm滤膜过滤除菌，分别分装后置于4℃备用。

3.雪旺细胞的冷冻过程：将处于对数期的细胞用0.25％胰蛋白酶消化，分为三组1000r/m离心8min后去上清，对照组用全培养基吹散细胞，取0.5ml细胞悬浮液置于2ml冻存管中，在冰水浴(4℃)中平衡5min，待细胞悬浮液变为凝胶态后滴加等体积(0.5ml)的含16vol％dmso的全培养基，每滴加一两滴冻存管需晃动几下使dmso分散均匀，防止局部dmso浓度过大和溶解放热过多对细胞造成损伤。实验组分为两组，一组用含1.5g/lbdt的全培养基吹散细胞，取0.5ml细胞悬浮液置于2ml冻存管中，在冰水浴(4℃)下平衡5min，待细胞悬浮液变为凝胶态后滴加等体积(0.5ml)的含16vol％dmso的培养基；另一组在冰水浴(4℃)下平衡5min，待细胞悬浮液变为凝胶态后先滴加0.25ml含0.2mol/l海藻糖的全培养基，滴加完毕后再滴加0.25ml含32vol％dmso的全培养基，其他操作均相同，三组的冻存体系的最终浓度为对照组8vol％dmso，实验组0.75g/lbdt、8vol％dmso(bdt-dmso组)和0.75g/lbdt、8vol％dmso、0.05mol/l海藻糖(bdt-dmso-trehalose组)，冻存的细胞密度为1×10⁶cells/ml。在滴加完冷冻保护剂冻存体系达到溶胀平衡后将冻存管放置于程序降温盒中，降温盒置于-80℃的冰箱中，程序降温盒可以使降温速率保持在1℃/min。在-80℃冰箱中放置24h后，取出冻存盒，将三组冻存管移入到液氮中继续冷冻3天。

实施例4

雪旺细胞的复温过程：

在液氮中保存3天后，取出冻存管，在37℃恒温水浴中震荡5min，保证凝胶态转变为液态。将冻存管中细胞悬浮液移到离心管中，加入适量培养基1000r/m离心8min去上清，为了彻底除去细胞悬浮液中的凝胶因子和冷冻保护剂，此步骤重复两次。复温后，调整细胞密度为6000cells/ml，将细胞接种到96孔板中，置于37℃，5％co2的培养箱中培养，等待后续实验。上述所有操作均在洁净工作台中进行，保证严格的无菌环境。

实施例5

雪旺细胞的检测：

细胞存活率：使用细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测。对复温后的细胞进行荧光染色，并在荧光显微镜下观察，可以直观的看出细胞的存活情况。本实验采用hoechst33342和碘化丙啶(pi)双染色方法。hoechst33342可以穿透正常细胞的细胞膜，正常细胞与凋亡细胞均可被染色，染色后凋亡细胞的荧光反应会比正常细胞明显。碘化丙啶(pi)不能穿透细胞膜，因此正常细胞不能被pi染色，而对于坏死细胞，其细胞膜的完整性丧失，碘化丙啶(pi)可以进入细胞将其染色。因此正常细胞表现为蓝色荧光，坏死细胞表现为蓝色荧光+红色荧光，可以明显的区分细胞的死活。

复温后将雪旺细胞密度调整为6000cells/ml，每孔100μl接种到96孔板中，每组按冷冻方式不同分别接种六个孔，随后将96孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养3天后，吸走96孔板中的上清液，用pbs洗涤两次，然后每孔加入200μl配制好的染色液，放置于4℃的环境中孵育20-30min后在荧光显微镜下观察红色和蓝色荧光并拍照记录，雪旺细胞存活率结果如图5。

细胞的活性及增值：使用mtt比色法测试。mtt实验是一种检测细胞存活和生长的方法，mtt是一种显色剂，具体结构为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐，其显色原理为mtt能氧化活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，自身变为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。甲瓒能被二甲基亚砜(dmso)溶解，用酶标仪在特定波长下测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。在细胞数量及检测波长适宜时，吸光值的大小与细胞数成正比。

复温后将雪旺细胞密度调整为6000cells/ml，每孔100μl接种到96孔板中，每组按冷冻方式不同分别接种六个孔，接3块96孔板，随后将96孔板置于37℃，5％co2的培养箱中培养。分别于培养12h、1天、2天、3天、5天时取出一块96孔板，每孔加入20μl配置好的mtt溶液，接着放入37℃，5％co2的培养箱中培养。4h后取出96孔板，吸走上清液，每孔加入150μldmso，震荡5-10min，待紫色结晶充分溶解后，将96孔板置于酶标仪中，先用连续波长测定一个孔吸收曲线，找出吸收的峰值对应的波长，接着用该波长测定吸光度。在培养过程中，若96孔板中培养基颜色变成黄色需要及时换液保证细胞的生长环境。

测试结果如图6所示，在-80℃下冷冻24h后转移至液氮中继续冷冻3天复苏后细胞在12h、1天、2天、3天、5天的mtt检测结果。该方法冻存的雪旺细胞的形态与新鲜的雪旺细胞基本无差别，且存活率高达98.59％并能正常增殖，证明利用该新型复合低温冻存体系冻存的雪旺细胞能够保持其原有的生物学特性。采用本发明所提供的方法冷冻雪旺细胞后，在冻存过程中不仅减少了冻存保护剂的使用，降低了有毒试剂对细胞的毒害，而且改变了冷冻保护剂的添加方式，在形成凝胶后滴加冷冻保护剂使其达到溶胀平衡，减少了冷冻保护剂所造成的渗透损伤，同时冻存体系冰点的降低，减少了雪旺细胞受到的冷冻损伤；在复温过程中，由于氨基酸类凝胶因子自组装形成的超分子凝胶具有热可逆性，凝胶转变为液态，易于除去冷冻保护剂和氨基酸类凝胶因子，保证了雪旺细胞的完整性。