一种强抑草作用真菌用作除草剂的方法与流程

本发明属于农作物病害防治领域，具体涉及一种强抑草作用真菌用作除草剂的方法。

背景技术：

农作物病害是指在生长发育过程中，遭遇到致病微生物的侵染或在不良环境因素的影响，正常的生理代谢受到干扰，生理机能、内部组织结构和外部形态出现异常。植物病害的种类多样，根据病原来区分主要包括真菌病害和细菌病害。真菌病害的主要症状是坏死、腐烂和萎蔫，少数为畸形。在病斑上常有霉状物、粉状物、粒状物等病征，这是真菌病害有别于其它病害的重要标志，也是田间诊断的重要依据。一般细菌病害的症状主要有坏死、腐烂、萎蔫和瘤肿等，并时常有菌脓溢出。田间细菌病害的症状有如下特点：一是受害组织表面常为水渍状或油渍状；二是在潮湿条件下，病部有黄褐色或乳白色、胶粘、似水珠状的菌脓；三是腐烂型病害患部常有恶臭味。

农作物病害的形成主要包括3个因素分别为寄主、病原菌和环境。对于病原菌的防治也要从这3方面入手。目前对于农作物病害的主要方法包括：1、抗病品种的选育；2、对田间栽培加强管理；3、使用药剂进行防治。

杂草危害是影响农作物产量提高的一个重要因素，据有关报道指出，每年杂草给美国带来的损失大约2亿美元，约是水稻潜在产量的17%。在泰国，每年因为杂草的危害导致水稻产量减少25%～75%。而且杂草的存在也会个病原菌提供寄主，使农作物感染病原菌。目前对于杂草的防治主要依靠的是使用化学除草剂或者是生物除草剂。化学除草剂特点在于用见效快，但是由于长期、大量的使用化学药物，会对生态环境造成一定的污染，这种污染可以通过食物链食物网、人为活动、动物迁徙和气候因素造成更深层的影响；生物除草剂的优点在于没有残留，但其缺点在于大多数的生物除草剂具有专一性。

桉树（eucalyptusspp）是在我国是备受欢迎的一种经济植物，单在中国的南方就有17个省种植，面积超过4.5万公顷；中国是仅次于巴西的世界第二大桉树种植国。桉树因其具有较强的化感作用其根际微生物也会存在与化感相关的一些微生物。本发明从桉树根际筛选到的一种真菌其对菊科的莴苣、禾本科的狼尾巴草还有豆科的紫花苜蓿的生长都有很强的抑制作用，其克服了生物除草剂由于其专业性带来的使用不方便的问题。为减少化学除草剂的使用提供帮助。

技术实现要素：

本发明提供一种强抑草作用真菌用作除草剂的方法，该真菌为黑曲霉属hqm1菌株；将该真菌用于抑草具有环境安全、环境相容性好，在土壤中无残留等优点。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种强抑草作用真菌用作除草剂的方法，其应用步骤如下：

（1）取菌株hqm1进行发酵培养；

（2）取发酵液稀释1-100倍；

（3）将稀释发酵液浇于种子或植株周围即可。

其中，步骤（1）中所述菌株为黑曲霉属hqm1菌株。

本发明的优点在于：

该真菌菌株用于抑草具有环境安全、环境相容性好，在土壤中无残留等优点；对杂草狼尾巴草和紫花苜蓿根长和株高都有很强的抑制率，且在低浓度下对杂草的根系具有强的抑制作用，可以运用到田间杂草防治。

附图说明

图1菌株hqm1形态图；a为真菌菌株fjfafu-bxg01菌株分生孢子图(10×20)，b为真菌菌株fjfafu-bxg01菌落图。

图2菌株hqm1-itsi区目的条带电泳图；a为dl10000dnamarkerlane标准电泳条带示意图；b泳道1为dl10000dnamarker，泳道2为真菌菌株hqm1-itsi区目的条带。

图3菌株hqm1利用nj法（邻接法）构建的发育树。

图4不同浓度菌株hqm1发酵液对紫花苜蓿生长的影响；a为发酵液十倍稀释液对紫花苜蓿生长的影响，b为空白对照。

图5a：菌株hqm1发酵液对紫花苜蓿根系的影响；图5b：菌株hqm1发酵液对紫花苜蓿株高的影响。

具体实施方式

实施例1

菌株hqm1发酵液的抑草能力生物测试

在组培瓶中各放一张滤纸，分别取稀释50倍的发酵液5ml加入到组培瓶中，每个组培瓶中播入5粒刚冒白的莴苣，蒸馏水做对照，并将其置28℃恒温培养箱中培养，每个实验设置3次重复。培养3d后测定莴苣的根长和株高。抑制率计算按公式：ir=（1-tr/ck）×100%。其中，ir：抑制率(inhibitionrate)；tr：处理(treatment)；ck：对照(control)。

再分别以紫花苜蓿和狼尾巴草为实验对象，发酵液稀释50倍的抑草能力生物测试实验步骤同上；抑草能力测试结果见表1。

表1hqm1菌株发酵液稀释后对受体植株的影响

从表1可知，hqm1菌株发酵液稀释50倍后对莴苣的根长和株高都有很强的抑制作用，分别为88.69%和63.19%。对于抗性较强的狼尾巴草，菌株发酵液稀释50倍后对其的根长和株高也有很强的抑制作用，抑制率分别达到66.12%和2.67%。对牧草紫花苜蓿的根长和株高的抑制率分别为87.6%和10.09%。

实施例2菌株鉴定

1、形态学鉴定

菌落的形态学观察：在pda固体培养基平板中间接入用直径0.8cm的打孔器打下的菌饼，28℃连续培养7d，每天观察菌落边缘和表面的质地、颜色纹饰等形态特征。

显微镜形态观察：将在pda固体培养基平板上培养3d的菌落用解剖针挑出一点菌落，放在中间滴有无菌水的载玻片上，然后用两只解剖针尽量的把菌落分散开，盖上盖玻片，用吸水纸把载玻片周围的水吸干，在光学显微镜下观察分生孢子梗和孢子等形态。

形态学鉴定结果：形态学鉴定依据菌落的特征，根据魏景超的《真菌鉴定手册》和c.j.alexpoulos的introductorymycology对菌株进行初步的鉴定。形态学实验表明该真菌菌株hqm1在28℃pda培养基培养生长速度快，培养2天后表面菌落呈白色，无同心圆，质地丝绒状，有放射状延伸的边缘，底部为黄色，无渗出物，无味。在显微镜下，分生孢子呈黑色、黑褐色，分生孢子梗透明，无隔，分生孢子头呈球形，放射状，顶囊近球形。其菌株分生孢子图及菌落图见图1。

2、真菌菌株的分子生物学鉴定

利用ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒提取纯化的真菌的基因组dna。选用下列真菌通用引物对菌株its区进行pcr扩增测序：

上游引物its1:5'-tccgtaggtgaacctgcgg-3'，

下游引物its4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'；

pcr扩增体系为25μl，其中2×takarataqtmhsperfectmix3.7μl，上下游引物(20μmol/ml)各0.5μl，dna0.5μl，补充灭菌去离子水至25μl。反应条件为94℃4min预变性后进入循环，循环参数为94℃45s、55℃45s、72℃1min，30个循环后，72℃延伸10min。取pcr产物5μl，在1%wt琼脂糖凝胶上电泳。pcr产物hqm1-itsi区经胶回收试剂盒纯化后委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，并将序列信息经ncbi数据库分析比对。利用mega5.05软件进行系统发育分析。采用邻接法(neighbor-joining，nj)构建系统发育树。

菌株itsi序列电泳结果见图2，结果显示，其序列大小为584bp，通过与ncbi（blast）中的数据进行同源性比较，该菌株与aspergillusniger的序列相似率达99%以上，推断该菌株是aspergillusniger（黑曲霉属）。其系统发育树见图3。

通过形态学和its鉴定结果表明该菌株是aspergillusniger（黑曲霉属）。

实施例3菌株抑草潜力验证-盆栽实验

实验室的培养箱中进行，温度28℃，12h光照。取稻田土自然晾干，碾碎后去除土中的碎石和杂物，过筛。称取过筛后的细土30g置于直径为9cm的花盆中。将已催芽的紫花苜蓿5粒播入土壤表层。对hqm1菌株在28℃，180rpm/min,培养7天的菌液发酵液进行5个梯度稀释。处理1：原液，处理2：稀释5倍，处理3：稀释10倍，处理4：稀释20倍，处理5：稀释50倍、处理6:稀释100倍。分别将各梯度的30ml稀释液浇于种子周围，对照为蒸馏水；每个处理重复3次。每天用喷雾器添加20ml蒸馏水以保持土壤湿润。种植5d后测定受体植株的根长和株高。

结果如图4所示，由图4可知，该菌株发酵液对莴苣的根长、株高均有抑制作用；其中，发酵原液对莴苣根长的抑制率达到90%，50倍稀释液对根长的抑制率仍高于40%，但稀释100倍时抑制作用急剧减弱至8.99%；而发酵原液对株高抑制率也达到了70%以上，但稀释后其抑制作用急剧减弱。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种强抑草作用真菌用作除草剂的方法

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