一种玉米单倍体种子快速催芽及去杂方法与流程

本发明属于农作物栽培技术领域，具体涉及一种玉米单倍体种子快速催芽及去杂的方法。

背景技术：

玉米利用单倍体诱导系作父本杂交产生的种子中，大约有10％的母本单倍体种子，这些单倍体种子经加倍就是我们所需要的双单倍体自交系。由于单倍体诱导系胚部和胚乳糊粉层都携带紫色标记，而被诱导母本材料一般不携带这些色素标记，因此杂交一代种子中母本单倍体表现为胚部无紫色标记、胚乳糊粉层携带紫色标记(简称pw种子)，杂合种子中胚部和胚乳糊粉层都携带紫色标记(简称pp种子)，利用上述原理能够简便的区分单倍体种子和杂合种子。但实际应用中存在以下两个问题：

①不同母本背景显色程度不尽相同，导致部分籽粒显色不明显，在籽粒阶段很难辨别紫色素标记，最终会导致所选取的pw种子中混有10-25％的pp种子，给下一步加倍及去杂过程增添大量额外工作。

②被诱导母本材料一般为分离群体，被诱导后代中pw种子发芽势不尽相同，因此并不能保证所有pw种子出芽时间一致，即某一时间点不同pw种子幼苗长短不一，这就给后一步幼苗的加倍处理造成较大麻烦，因为幼苗加倍时需要幼苗长度基本保持在一致。

针对以上问题，本发明提供了一种玉米单倍体种子快速的浸种催芽及去杂方法，该方法主要包括种子消毒处理、适温浸种、种子去杂、恒温催芽、幼苗去杂五个步骤。通过本发明可以达到以下目的和效果：a)在浸种和催芽阶段通过两次简便的区分混杂种子和幼苗杂株，使最终幼苗中杂株率降低至5％以下；b)利用一种简便的消毒灭菌方法，解决单倍体种子在浸种催芽阶段易感病的问题，使催芽48小时后幼苗染病率低于5％；c)单倍体种子从浸种至幼苗伸长至2-4厘米只需72-90小时，大量缩短发芽时间；d)催芽过程中将种子置于滤纸上，上下覆盖麻布，利用麻布进行保湿透气，并利用滤纸隔离防止胚根插入麻布中不易提取幼苗，同时滤纸能够快速均匀的吸收储存于麻布中的水分保证种子吸水充足和一致；e)依据不同幼苗的伸长情况选取特定长度待加倍幼苗而不影响其它未达标幼苗的继续生长，并保持最终pw种子发芽率在92％以上；。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玉米单倍体种子快速催芽及去杂方法，该方法主要包括种子消毒处理、适温浸种、种子去杂、恒温催芽、幼苗去杂五个步骤，可降低浸种催芽过程中感病率，有效缩短发芽时间，提高发芽率和pw种子的纯度。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种玉米单倍体种子快速催芽及去杂方法，其步骤是：

1、初筛及种子消毒：选取胚部无紫色标记、糊粉层有紫色标记的玉米拟单倍体种子，浸于清水中，室温(20-30℃，以下相同)浸泡4-6小时，然后置于稀释75-100倍的福尔马林中，室温消毒30-60分钟；

2、适温浸种：取消毒后的种子置于浸种液中28-30℃浸种20-28小时，所述的浸种液含有体积比为4000-6000：1：50-75的蒸馏水：复硝酚钠：30％过氧化氢溶液；

3、混杂种子剔除：步骤2中经浸种过的单倍体种子胚部色素显色明显，剔除胚部有紫色标记的混杂种子；

4、恒温催芽：将步骤3留取的种子置于滤纸上，滤纸的上、下层分别覆盖麻布，蒸馏水浸湿滤纸及上下层麻布，光照3000-6000lx、恒温28℃条件下催芽；

5、杂株剔除：幼苗长度大于1厘米时，剔除芽鞘尖为紫色的杂株幼苗。

6、选取特定长度幼苗：步骤5后，依据不同幼苗的伸长情况选取特定长度幼苗用于下一步加倍处理，同时不影响其它未达标准长度幼苗的继续生长。

优选的，步骤1中福尔马林的稀释倍数为75倍，消毒时间为30分钟。

优选的，步骤2)中浸种液由体积比为4000：1：53的蒸馏水：复硝酚钠：30％过氧化氢溶液组成。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、第一次种子去杂仍是基于胚部显色原理，但通过浸种后，显色更加明显，降低了肉眼辨别难度；第二次去杂是基于芽鞘尖显色原理，即杂株芽鞘尖表现出紫色标记，单倍体芽鞘尖无标记来区分，分辨标准简便，操作易行。两次去杂过程能够简便的将杂株率降至5％以下，无需借助仪器。

2、该种子消毒方法，操作简便效果显著，使催芽48小时后种子感病率降至5％以下，基本不会由于种子感病而影响发芽率。

3、该浸种催芽方法仅用时72-90小时幼苗即可伸长至2-4厘米，显著减少发芽时间；同时在操作中，可选取特定长度幼苗用于下一步加倍处理，并不影响其它未达标准长度幼苗的继续生长。

4、该区分杂合子的方法在加倍处理前进行，避免待移栽田间后操作，大量减少了后续加倍和移栽工作；同时该方法仅依据色素变化肉眼即可观察，操作简便易行。

附图说明

图1为浸泡后混杂种子辨别，箭头标识处为浸种后紫色标记显现。

图2为幼苗杂株的辨别，箭头处为杂株芽鞘尖有紫色标记。

图3为选取特定长度幼苗用于下一步加倍处理，发芽先后幼苗之间不相互影响。

具体实施方式

实施例1：不同灭菌条件下玉米单倍体种子催芽效果的比较

选取正常拟单倍体种子700粒，分成7份各100粒；于室温浸泡4-6小时后，分别用如表1所示7种消毒处理方法，然后将种子置于滤纸上，滤纸的上、下层分别覆盖麻布，蒸馏水以浸湿滤纸及上下层麻布，光照3000-6000lx、恒温28℃条件下催芽。结果显示，48小时后，稀释50倍、75倍及100倍福尔马林溶液(40％甲醛溶液)消毒效果较好，基本能够将带菌种子率控制在5％以内，但稀释50倍福尔马林溶液对种子发芽率有明显的影响。因此，推荐消毒组合稀释75-100倍福尔马林溶液消毒30-60分钟，最优组合为稀释75倍福尔马林溶液消毒30分钟。

表1不同灭菌条件下催芽结果

实施例2：浸种液对玉米单倍体种子发芽势的影响

选取正常拟单倍体种子400粒，利用实例1中最优消毒方法(稀释75倍福尔马林溶液消毒30分钟)消毒后，分成4份，各100粒，用如表2所示4种浸种液进行浸种20-28小时。结果显示，72小时(包括浸种时间)发芽势，组合①、②、③明显优于对照组④，同时组合①优于组合②、③；最终发芽率也是组合①、②、③明显优于对照组④，同时组合①优于组合②、③。因此，浸种液最佳组合为组合①，即蒸馏水：复硝酚钠：30％过氧化氢溶液(v:v:v)＝4000:1:53，复硝酚钠的产品信息为：为一种总有效成分含量1.8％的植物生长调节剂，含邻硝基苯酚钠0.6％，对硝基苯酚钠0.9％，5-硝基邻甲氧基苯酚钠0.3％，水剂，由旭化学工业(漳州)有限公司制造。

表2浸种液对玉米单倍体种子发芽的影响

实施例3：玉米单倍体种子快速催芽及去杂方法

1、种子消毒：选取经过初筛选的玉米拟单倍体种子，即胚部无紫色标记、糊粉层有紫色标记的种子，置于清水中，室温下浸泡4-6小时，然后置于稀释75-100倍的福尔马林(40％甲醛溶液)中，室温消毒30-60分钟；利用该方法消毒后，约95％的种子在后续浸种催芽过程中能够保持不发病状态，同时基本不影响发芽率。

2、适温浸种：取消毒后的种子置于浸种液中28-30℃浸种20-28小时，所述的浸种液含有体积比为4000-6000：1：50-75的蒸馏水：1.8％有效成分含量的复硝酚钠：30％过氧化氢溶液。

3、混杂种子剔除：步骤2中经浸种过的单倍体种子胚部色素显色更加明显，能够清晰准确区分约80-90％混杂种子，剔除胚部出现紫色标记的混杂种子(见图1)。

4、恒温催芽：将步骤3留取的种子置于滤纸上，滤纸的上、下层分别覆盖麻布(麻布保水透气的同时，利用滤纸隔离胚根与麻布，防止胚根插入麻布空隙中，不便于拔取幼苗)，喷施蒸馏水以浸湿滤纸及上下层麻布，光照3000-6000lx、恒温28℃条件下催芽；24-32小时后种子将露白，48-60小时后幼苗将伸长至1-4厘米。

5、杂株剔除：步骤4中，长度大于1厘米的幼苗可以清晰辨别芽鞘尖部色素累计情况(见图2)，芽鞘尖成紫色为杂株予以剔除，此步骤能够区分剩余大多数杂株，最终杂株率降至5％以下；剩余幼苗可以进行下一步加倍处理。

6选取特定长度幼苗：步骤5后，依据不同幼苗的伸长情况选取特定长度幼苗用于下一步加倍处理，同时不影响其它未达标准长度幼苗的继续生长。

实施例4：玉米单倍体种子快速催芽方法中消毒及浸种对催芽效果的影响

本实施例比较了消毒及浸种处理对玉米单倍体种子催芽效果的影响，方法如下：

对照组(ck)：利用传统的砂：水＝100：18基质发芽，种子埋藏于基质中；

处理一(消毒+浸种液)：用稀释75倍的福尔马林消毒30分钟；浸种液为蒸馏水：1.8％有效成分含量复硝酚钠：30％过氧化氢溶液(v：v：v)＝4000：1：53，浸种20小时；

处理二(消毒+无浸种液)：用稀释75倍的福尔马林消毒30分钟；浸种液为蒸馏水；

处理三(不消毒+浸种液)：用蒸馏水消毒30分钟；浸种液为蒸馏水：1.8％复硝酚钠：30％过氧化氢溶液＝4000：1：53，浸种20小时；

处理四(不消毒+无浸种液)：用蒸馏水消毒30分钟；浸种液为蒸馏水，浸种20小时；

结果显示(如表3)，对照组主要缺点在于不便于及时区分和提出杂株，及不便于分批分离幼苗；不消毒组种子带菌率明显高于消毒组，同时对最终发芽率有一定的影响；无浸种液组主要缺点是72小时发芽势明显低于有浸种液组，同时对发芽率有一定的影响。因此，利用新的浸种催芽方法降低了种子感病率、提高了种子发芽势及发芽率、简化了去杂过程、实现了无损分批处理幼苗。

表3不同催芽处理结果