本发明涉及生物技术领域，特别涉及关中黑猪深部输精的精液常温保存稀释液配方。
背景技术：
关中黑猪是农业部首批地理标志产品品种，因出产并广泛分布于陕西关中平原而得名。关中黑猪是用巴克夏猪、甘肃泾川八眉猪、四川内江猪杂交选育而成的肉脂兼用型品种，于80年代初完成鉴定，具有繁殖力高、肉质好、耐粗饲、抗逆性强等优良种质特征。
在推进关中黑猪的规模化养殖的过程中，使用深部输精技术能够提高优良种公猪精液的使用效率，同时减少公猪的饲养量，降低生产成本，提高猪场经济效益。但是在这一人工授精技术的使用过程中，仍然存在一些较为突出的问题。比如，猪精液在采集、稀释分装以及后期保存过程中不可避免的会被微生物污染，由于微生物对精液的保存具有极大的危害，目前主要通过在稀释液中添加抗生素抑制精液中细菌的生长，以减少其对精子的危害。然而近年来由于抗生素的不科学使用致使细菌耐药性的产生，若继续在稀释液中添加抗生素可能致使耐药性细菌通过精液定向的感染母猪，一方面当使用受这些细菌污染的精液输精后可能致使母猪的繁殖成绩降低，另一方面当这些细菌再次引发疾病时可能会增加母猪的治疗成本。在目前猪精液的商业化运作中，猪精子在保存和运输过程中由于膜中含有大量的不饱和脂肪酸而极易受到氧化应激，这对精子的结构完整和功能正常发挥有极其不利的影响，降低输精后母猪的繁殖成绩。因此为了适应猪人工授精技术的发展，促进关中黑猪深部输精技术的推广使用，提高猪精液常温保存的精液质量和母猪繁殖成绩，降低猪场生产成本、提高生产效益，在当前形势下迫切需要研制出一种适用于关中黑猪精液常温保存的稀释液。
商品稀释粉品牌较多、鱼龙混杂，在实际应用中存在以下问题：
1)目前市场上广泛使用的猪精液常温保存稀释粉主要是国外品牌，国内自主研发的产品较少，且这些稀释粉不一定适用于关中黑猪精液的稀释保存。
2)商品稀释粉中主要添加抗生素杀菌抑菌，然而近年来抗生素的残留和细菌的耐药性问题日益突出，丞待解决。
3)精子在常温保存过程中容易产生氧化应激现象，影响精液品质，从而降低母猪的繁殖成绩。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种关中黑猪的精液常温保存稀释液。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
该常温保存稀释液的成分包括双蒸水、35～40g/l的葡萄糖、5.5～6.5g/l的柠檬酸钠、5.5～6.5g/l的乙二胺四乙酸、1.0～1.25g/l的碳酸氢钠、0.5～1.0g/l的氯化钾、0.02～0.06g/l的曲酸、0.04～0.16g/l的ε-聚赖氨酸。
优选的，所述常温保存稀释液调节渗透压在240mosm～380mosm，ph为6.4～7.2。
优选的，所述常温保存稀释液的成分包括双蒸水、37.15g/l的葡萄糖、6.0g/l的柠檬酸钠、6.0g/l的乙二胺四乙酸、1.25g/l的碳酸氢钠、0.75g/l的氯化钾、0.02～0.06g/l的曲酸以及0.04～0.16g/l的ε-聚赖氨酸。曲酸、ε-聚赖氨酸用量与保存精子的活率、顶体完整性、质膜完整性相关。
进一步优选的，所述常温保存稀释液的成分包括双蒸水、37.15g/l的葡萄糖、6.0g/l的柠檬酸钠、6.0g/l的乙二胺四乙酸、1.25g/l的碳酸氢钠、0.75g/l的氯化钾、0.04g/l的曲酸以及0.08g/l的ε-聚赖氨酸。
优选的，所述常温保存稀释液与精液混合后，精子的密度稀释至2×107～3×107个/ml，保存时间至少为120小时。
优选的，所述常温保存稀释液与精液混合后于15～20℃下进行保存(最优保存温度为17℃)。
本发明的有益效果体现在：
本发明所述关中黑猪的精液常温保存稀释液以关中黑猪的精液保存问题为出发点，以葡萄糖-柠檬酸钠-碳酸氢钠-氯化钾为基础成分研制出能高效常温保存精液的稀释液配方。本发明所述稀释液对关中黑猪精液具有良好的常温液态保存效果，解决了关中黑猪规模化养殖过程中人工授精技术的猪精液保存问题，减少了公猪的饲养，提高了优良公猪精液的利用率；同时该稀释液制作方法简单，生产成本低，容易使用，便于大规模推广应用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明。
(一)关中黑猪深部输精中的精液常温保存稀释液配方
本发明以关中黑猪深部输精中的精液保存问题为出发点，以葡萄糖-柠檬酸钠-碳酸氢钠-氯化钾为基础成分，添加阳离子抗菌肽ε-聚赖氨酸和抗氧化剂曲酸研制出能高效常温(15～20℃)保存精液的稀释液配方，该稀释液中添加曲酸对精子具有良好的抗氧化保护效果和一定的抗菌能力，进一步结合使用阳离子抗菌肽ε-聚赖氨酸替代抗生素，既有效缓解了猪精液常温保存过程中精子容易氧化应激问题，又减少了抗生素在养猪生产中的使用量，可有效缓解细菌耐药性问题，极大的减少了抗生素的使用和耐药细菌产生。本发明有利于扩大优良种公猪的精液利用率，保障母猪健康并提高深部输精的受胎率，实现高效低廉的深部输精。
本发明公开的关中黑猪深部输精的精液常温保存稀释液，其配方是在葡萄糖、柠檬酸钠、乙二胺四乙酸、碳酸氢钠、氯化钾的基础上添加0.02～0.06g/l的曲酸以及0.04～0.16g/l的ε-聚赖氨酸，与双蒸水混合，调节渗透压在240mosm～380mosm，ph为6.4～7.2，即形成常温保存稀释液。
葡萄糖具有提供营养以补充精子生存和运动所消耗的能量，维持精液渗透压的作用。柠檬酸钠和碳酸氢钠具有无毒性、ph调节性及良好的缓冲稳定性，本发明稀释液中按比例添加的柠檬酸钠和碳酸氢钠达到了很理想的提供缓冲及平衡渗透压作用效果。乙二胺四乙酸是一种无毒的有机螯合剂，能够与金属离子螯合，减少金属离子对精子的损伤作用。氯化钾的添加对于维持精子细胞钠钾泵的正常运转具有重要作用。本发明特点在于：①不添加抗生素，不仅可以有效抑制精液中细菌的增殖，保障了精子的体外储存，还减少了畜牧生产中抗生素的使用和残留，降低了耐药性细菌产生的几率。②具有极强的抗氧化性、抑制细菌生长、螯合金属离子等特性，能有效降低有害物质活性氧自由基(ros)的脂质过氧化反应，提高精子总抗氧化能力(t-aoc)。因此，具有提高精子活率和运动性能、质膜完整性、顶体完整性和线粒体完整性等功效。
上述关中黑猪深部输精的精液常温保存稀释液配方的另一特征在于操作简单及经济实用，将各成分按比例充分混匀后与鲜精等温稀释、密封保存，将精液与空气隔绝有利于精子免受外界环境的损伤。在常温下存放120小时后活率仍可达到60％以上，完全满足种养猪场对深部授精的需求。
关中黑猪深部输精的精液常温保存稀释液，其成分最佳含量为：37.15g的葡萄糖、6.0g的柠檬酸钠、6.0g的乙二胺四乙酸、1.25g的碳酸氢钠、0.75g的氯化钾、0.04g的曲酸、0.08g的ε-聚赖氨酸。将上述成分与1l双蒸水充分混匀后即得到关中黑猪深部输精的精液常温保存稀释液。稀释液ph值为6.4～6.8。
(二)关中黑猪鲜精保存方法
鲜精采集及质量评定：采用双层手套手握法采集成年健康种公猪精液，在37℃下对精子的活率及密度进行质量评定，在计算机辅助分析系统(casa)下检测精子的活率和运动性能，活率高于80％的样品可以进行稀释和保存，精液密度在计算机辅助分析系统(casa)检测精子活率时可同时检测并显示出。
常温保存方法：根据所采鲜精(温度为37℃)体积及密度，加入等温的所述关中黑猪深部输精的精液常温保存稀释液(最佳配方含量下)，使精子密度为2.5×107个/ml，轻轻摇晃混匀后分装在80ml精液瓶中，根据气温待精液缓慢降温1～2h至室温后转移至17℃恒温冰箱保存可长达120h，期间可根据生产需要用于猪的深部输精。
(三)关中黑猪精液保存后质量评定
精子活率测定：输精前取10μl样品在计算机辅助分析系统(casa)下检测精子活率和运动性能。精子运动性能参数主要包括精子直线运动速率、曲线运动速率及精子侧摆幅度。
精子质膜完整性检测：采用低渗肿胀试验(host)法检测。用果糖-柠檬酸钠低渗液调整精子密度至2×106个精子/ml，37℃孵育30min，取10μl精液即刻在400倍相差显微镜下计算精子肿胀情况，统计精子质膜完整率。
精子顶体完整率的检测：取10μl样品制作抹片，使用荧光染料异硫氰酸荧光素-花生凝集素(fitc-pna)联合染色后，在荧光显微镜下随机计算每200个精子顶体完整率，计算3次以上。
精子线粒体膜完整性的检测：取10μl样品制作抹片，使用荧光染料罗丹明-碘化丙啶(rh123-pi)联合染色后，在荧光显微镜下随机计算每200个精子线粒体膜完整率，计算3次以上。
(四)具体实验例
采用手握法采集3只成年健康关中黑猪种公猪(1.2～2周岁)精液，使用计算机辅助分析系统(casa)对精液的活率及密度进行检测。利用上述稀释液及操作方法将精液保存至说明时间，以传统bts液作为实验对照。对每只公猪精液进行质量评定。结果表明所采集种公猪鲜精样品密度在6.2～12.5×109个/ml范围内变化，平均密度为0.89，活率在82.69％～91.78％范围内变化，平均值为86.75％。常温保存120h后活率在65.58％～67.26％范围内变化，平均值为66.42％，顶体完整率平均值为79.59％，质膜完整率平均值为56.77％。数据结果见表1。
本发明稀释液的作用主要可以为精子补充营养物质，维持精液的渗透压，减少精液中细菌对精子的危害，降低精子代谢产物对精子的危害，降低精液中活性氧对精子膜结构的危害。由实验证明本发明公开的稀释液配方对关中黑猪精液的常温保存具有良好的效果(例如，0.08g/lε-聚赖氨酸与0.04g/l的曲酸不会影响精液的渗透压，能有效控制精液中的细菌数量；常温保存120h后精精子活率达60％以上满足生产需要)能有效地抑制精液中细菌的生长、保持精子活率、顶体完整率、降低精子畸形率、能有效提高猪人工授精受胎率及体外授精效率，提高人工授精生产效率。同时稀释液中曲酸与ε-聚赖氨酸均是安全无害的，无药物残留的安全物质。
表1.本发明稀释液对关中黑猪精液液态保存的影响
另外，本发明同时具有抗氧化和抗菌两种作用，曲酸、ε-聚赖氨酸两种物质都在食品添加中有所应用，无公害并且成本较低，且可以减少生产中抗生素的使用。