本发明属于生物技术领域，特别涉及一种脐血造血干细胞的冻存方法。
背景技术：
脐血也叫脐带血，是指胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近十几年的研究发现，脐血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗多种疾病。因此，脐血已成为造血干细胞的重要来源，特别是无血缘关系造血干细胞的来源。也是一种非常重要的人类生物资源。
脐血中含有大量的干细胞，干细胞是生命的种子，它会分化成人体的各种细胞，结出各种不同的果实——血液细胞，神经细胞，骨骼细胞等等。随着科技的发达，医学专家研究出利用脐带血中的干细胞来治疗疾病的方法。干细胞是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体。这些细胞可以通过分裂维持自身细胞的特性和数量，又可进一步分化为各种组织细胞，从而在组织修复等方面发挥积极作用。近三十年来的医学研究发现，脐血中含有非常丰富的造血干细胞(hsc)，可以重建人体造血和免疫系统，可用于造血干细胞移植，治疗血液系统、免疫系统，以及遗传代谢性及先天性疾病。因此，脐血已成为造血干细胞的重要来源，已经被广泛地应用于临床，是宝贵的人类生物资源。
世界范围内，目前脐血已经用于治疗各种类型白血病、再生障碍性贫血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、粘多糖病、地中海贫血、骨髓发育不良症候群、原发性免疫缺陷病、慢性肉芽肿等80多种疾病。
我国卫生部颁发的《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范(试行)》中规定，脐带血造血干细胞治疗技术适应症包括以下10余类：骨髓衰竭、血红蛋白病、重症免疫缺陷病、代谢性疾病、白血病、骨髓增生异常综合症、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、恶性肿瘤、重症再生障碍性贫血和重症放射病等。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，以提供脐血造血干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：
(1)取脐血造血干细胞，经过离心后，倒掉上层清液；
(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；
(3)对无菌细胞冻存管采用梯度降温冷冻法进行冻存。
所述步骤(3)具体为：将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。
所述步骤(2)的细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/ml。
所述步骤(2)中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基组成；
所述培养基由以下组分组成：
基础培养基、人血清白蛋白、杨梅素、三七总皂苷、大黄素、亚油酸、胰蛋白酶、抑肽酶、光蛋白聚糖、碱性成纤维细胞生长因子、丙酮酸、l-谷氨酰胺、叶酸、β-巯基乙醇、黄芪多糖、转铁蛋白、维生素、氨基酸。
优选的，所述培养基中，各组分的含量如下：
基础培养基10-50g/l，人血清白蛋白5-20g/l，杨梅素5-20mg/l，三七总皂苷5-20mg/l，大黄素5-20mg/l，亚油酸2-10mg/l，胰蛋白酶1-10mg/l，抑肽酶4-10mg/l，光蛋白聚糖5-20μg/l，碱性成纤维细胞生长因子1-10μg/l，丙酮酸5-15mg/l，l-谷氨酰胺5-20mg/l，叶酸1-15mg/l，β-巯基乙醇2-10mg/l，黄芪多糖50-80mg/l，转铁蛋白1-10mg/l，维生素80-500mg/l，氨基酸80-500mg/l。
所述人血清白蛋白为人脐血人血清白蛋白；基础培养基为imdm培养基；所述维生素为水溶性维生素；所述氨基酸为多种氨基酸复合物。
所述冻存保护剂为渗透性冷冻保护剂，由甘油、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇的一种或多种组成。
所述冻存保护剂、胎牛血清、培养基的体积比为1：1～3：2～4。
有益效果：采用本发明冻存方法对脐血造血干细胞进行冻存，大大减少了冻存液对脐血造血干细胞的损伤作用，有利于脐血造血干细胞在冻存及复苏过程中细胞活力的提高，能够更好的保持脐血造血干细胞的生物学特征。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：
(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；
(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；
(3)将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。
其中，细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/ml。
细胞复苏：无菌细胞冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入培养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37℃、5％co2培养箱中培养。其中，培养基可采用本发明的冻存液中的培养基配方制备，或者采用其它常用基础培养基。
其中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基按照体积比为1：1：4组成；
其中，培养基中，各组分的含量如下：基础培养基24g/l，人血清白蛋白12g/l，杨梅素12mg/l，三七总皂苷12mg/l，大黄素13mg/l，亚油酸6mg/l，胰蛋白酶5mg/l，抑肽酶8mg/l，光蛋白聚糖13μg/l，碱性成纤维细胞生长因子5μg/l，丙酮酸11mg/l，l-谷氨酰胺12mg/l，叶酸8mg/l，β-巯基乙醇6mg/l，黄芪多糖68mg/l，转铁蛋白5mg/l，维生素280mg/l，氨基酸260mg/l。
冻存保护剂为二甲基亚砜。
实施例2
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：
(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；
(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；
(3)将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。
其中，细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/ml。
细胞复苏：无菌细胞冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入培养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37℃、5％co2培养箱中培养。其中，培养基可采用本发明的冻存液中的培养基配方制备，或者采用其它常用基础培养基。
其中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基按照体积比为1：2：2组成；
其中，培养基中，各组分的含量如下：基础培养基10g/l，人血清白蛋白15g/l，杨梅素10mg/l，三七总皂苷15mg/l，大黄素10mg/l，亚油酸2mg/l，胰蛋白酶10mg/l，抑肽酶10mg/l，光蛋白聚糖10μg/l，碱性成纤维细胞生长因子1μg/l，丙酮酸5mg/l，l-谷氨酰胺15mg/l，叶酸15mg/l，β-巯基乙醇10mg/l，黄芪多糖80mg/l，转铁蛋白1mg/l，维生素360mg/l，氨基酸180mg/l。
冻存保护剂为二甲基亚砜、甘油、乙酰胺的混合物。
实施例3
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：
(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；
(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；
(3)将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。
其中，细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/ml。
细胞复苏：无菌细胞冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入培养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37℃、5％co2培养箱中培养。其中，培养基可采用本发明的冻存液中的培养基配方制备，或者采用其它常用基础培养基。
其中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基按照体积比为1：3：3组成；
其中，培养基中，各组分的含量如下：基础培养基50g/l，人血清白蛋白5g/l，杨梅素5mg/l，三七总皂苷20mg/l，大黄素5mg/l，亚油酸8mg/l，胰蛋白酶1mg/l，抑肽酶4mg/l，光蛋白聚糖20μg/l，碱性成纤维细胞生长因子8μg/l，丙酮酸8mg/l，l-谷氨酰胺5mg/l，叶酸5mg/l，β-巯基乙醇2mg/l，黄芪多糖50mg/l，转铁蛋白3mg/l，维生素500mg/l，氨基酸80mg/l。
冻存保护剂为二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇的混合物。
实施例4
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：
(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；
(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；
(3)将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。
其中，细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/ml。
细胞复苏：无菌细胞冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入培养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37℃、5％co2培养箱中培养。其中，培养基可采用本发明的冻存液中的培养基配方制备，或者采用其它常用基础培养基。
其中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基按照体积比为1：3：4组成；
其中，培养基中，各组分的含量如下：基础培养基30g/l，人血清白蛋白10g/l，杨梅素15mg/l，三七总皂苷10mg/l，大黄素15mg/l，亚油酸8mg/l，胰蛋白酶8mg/l，抑肽酶6mg/l，光蛋白聚糖15μg/l，碱性成纤维细胞生长因子2μg/l，丙酮酸12mg/l，l-谷氨酰胺20mg/l，叶酸5mg/l，β-巯基乙醇8mg/l，黄芪多糖60mg/l，转铁蛋白2mg/l，维生素180mg/l，氨基酸500mg/l。
冻存保护剂为甲醇、乙二醇、丙二醇的混合物。
实施例5
一种脐血造血干细胞的梯度降温冻存方法，包括以下步骤：
(1)取脐血造血干细胞，经过1000rpm离心后，倒掉上层清液；
(2)将步骤(1)得到的液体放入冻存液中，吹打均匀，形成细胞悬液，装入无菌细胞冻存管中；
(3)将无菌细胞冻存管置于冰块中1-3h，然后取出，置于干冰中放置12-24h，之后取出，放置于液氮中冻存。
其中，细胞悬液中，细胞浓度为5-20×106个/ml。
细胞复苏：无菌细胞冻存管从液氮取出后，在37～40℃水域中迅速搅动至溶解，加入培养基，1500rpm离心10min，弃上清，置37℃、5％co2培养箱中培养。其中，培养基可采用本发明的冻存液中的培养基配方制备，或者采用其它常用基础培养基。
其中，冻存液由冻存保护剂、胎牛血清、培养基按照体积比为1：2：4组成；
其中，培养基中，各组分的含量如下：基础培养基50g/l，人血清白蛋白5g/l，杨梅素20mg/l，三七总皂苷5mg/l，大黄素20mg/l，亚油酸4mg/l，胰蛋白酶1mg/l，抑肽酶4mg/l，光蛋白聚糖5μg/l，碱性成纤维细胞生长因子10μg/l，丙酮酸15mg/l，l-谷氨酰胺10mg/l，叶酸1mg/l，β-巯基乙醇2mg/l，黄芪多糖50mg/l，转铁蛋白10mg/l，维生素240mg/l，氨基酸240mg/l。
冻存保护剂为甘油。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。