胚胎玻璃化冷冻器的制作方法

本实用新型涉及一种生殖医学医疗卫生技术领域，特别是一种胚胎玻璃化冷冻器。

背景技术：

患者在进行IVF(ICSI)----体外受精(卵胞浆内单精子显微注射技术)治疗时，在一个超排治疗周期中一般会获得多个质量好的胚胎，但在本周期中往往不能一次全部移植或不宜移植，可以将剩余或全部的优质胚胎进行冷冻保存。胚胎冷冻保存可使病人在一个治疗周期中获得多次胚胎移植的机会，使胚胎的利用率达到了最大的限度，大大提高了IVF(ICSI)治疗的成功率。

胚胎冷冻保存技术是指采用慢速或快速的降温方法，将胚胎低温冷冻，然后超低温保存在-196℃的液氮中。目前胚胎冷冻保存技术有慢速程序化冷冻技术和玻璃化冷冻技术两种，玻璃化冷冻技术比慢速程序化冷冻技术具有简单、快速、临床妊娠率和胚胎着床率高的优点，因此目前各大生殖中心基本上采用玻璃化冷冻胚胎进行保存。在进行玻璃化冷冻的过程中，在最后一步胚胎放入冷冻液后要在60秒内置于载杆上并投入液氮，但胚胎会浮在冷冻液上层难以在60秒内吸取，尤其是对刚参加工作操作不熟练的实验室工作人员，如何简化胚胎玻璃化冷冻操作，避免操作失误，提高玻璃化冷冻胚胎复苏后的存活率(目前的存活率为94％)成为本行业急需解决的问题。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的问题是提供一种结构简单、使用方便的胚胎玻璃化冷冻器。

为了解决上述技术问题，本实用新型提供一种胚胎玻璃化冷冻器，包括壳体、拉杆、压杆、拉杆活塞、压杆活塞、弹簧、冷冻液吸管及胚胎针；所述壳体内腔的上半部被分隔形成了相互独立的压缩腔Ⅰ和压缩腔Ⅱ，壳体内腔的下半部为废液腔，所述压缩腔Ⅰ和压缩腔Ⅱ均与废液腔相连通；

所述壳体顶端设置有两个各自连通压缩腔Ⅰ、压缩腔Ⅱ的开口；

位于压缩腔Ⅰ内的拉杆活塞与压缩腔Ⅰ的内侧壁密封的滑动相连，拉杆的底部穿过连通压缩腔Ⅰ的开口后与拉杆活塞固定相连；在压缩腔Ⅰ的上下端分别设置用于限定拉杆活塞滑动位置的拉杆活塞上限限定环、拉杆活塞下限限定环；

位于压缩腔Ⅱ内的压杆活塞与压缩腔Ⅱ的内侧壁密封的滑动相连，压杆的底部穿过连通压缩腔Ⅱ的开口后与压杆活塞固定相连；在压缩腔Ⅱ的上下端分别设置用于限定压杆活塞滑动位置的压杆活塞上限限定环和弹簧固定环，在压杆活塞和弹簧固定环之间设置弹簧，所述弹簧的两端分别抵接压杆活塞和弹簧固定环；

所述壳体侧壁上设置有连通废液腔顶部的冷冻液吸管；所述冷冻液吸管下端设置有冷冻腔，胚胎针的端部位于冷冻腔内。

作为本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器的改进：所述胚胎针包括均中空且上下相连通的胚胎针上段和胚胎针下段，胚胎针上段的顶部伸入冷冻腔内；

所述胚胎针上段的顶部为网状半球形，网孔的孔径小于胚胎的直径；

胚胎针下段的下端为开口端。

备注说明：胚胎针上段的顶部为网状半球形；这样的结构既可以拦截住胚胎，使胚胎始终位于胚胎针上段的顶部，而不会进入冷冻腔和冷冻液吸管；又能确保液体的通过。

胚胎针上段和胚胎针下段的内腔横截面大于胚胎的直径，从而胚胎在胚胎针内的移动。

作为本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器的进一步改进：所述胚胎针上段与胚胎针下段的夹角为145～155°(较佳为150°)。

作为本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器的进一步改进：

拉杆顶端设置有拉板，拉板的尺寸大于连通压缩腔Ⅰ的开口的尺寸，拉板位于压缩腔Ⅰ的上方；

压杆顶端设置有压板，压板的尺寸大于连通压缩腔Ⅱ的开口的尺寸，压板位于压缩腔Ⅱ的上方。

作为本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器的进一步改进：压缩腔Ⅰ的容积大于压缩腔Ⅱ的容积。

作为本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器的进一步改进：压缩腔Ⅰ的横截面大于压缩腔Ⅱ的横截面。

作为本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器的进一步改进：所述壳体的外表面设置有平衡液刻度线。

作为本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器的进一步改进：冷冻腔(15)为球状空腔。

本实用新型还同时提供了上述胚胎玻璃化冷冻器的使用方法，包括以下步骤：

1)、先向下按动拉板，使拉杆在压缩腔Ⅰ中向下移动，直至拉杆活塞与拉杆活塞下限限定环相接触为止；然后向下按动压板，压杆在压缩腔Ⅱ中向下移动，压杆活塞压缩弹簧，直至弹簧被压缩至极限为止；壳体内的空气被压缩后通过冷冻液吸管、再经胚胎针排出壳体外；

先将胚胎针下段开口端置入含有胚胎的培养液中，之后松开压板，压杆在弹簧弹力的作用下复原，使壳体内的压力小于环境压力，产生的吸力吸取含有胚胎的培养液；含有胚胎的培养液依次经过胚胎针下段、胚胎针上段进入位于冷冻腔内的胚胎针上段的顶部；胚胎被截留在胚胎针上段的顶部；培养液先通过胚胎针上段顶部的网孔进入冷冻腔内，再沿着冷冻液吸管流入废液腔内；

2)、将胚胎针下段开口端置入平衡液中，向上拉动拉板，使拉杆在压缩腔Ⅰ中向上移动，在壳体内外空气压差的作用下胚胎针下段开口端吸取平衡液，平衡液依次经过胚胎针下段、胚胎针上段、胚胎针上段顶部的网孔进入冷冻腔从而实现培养液的被置换；当于拉杆的作用下拉杆活塞被拉升至底端与平衡液刻度线平行时，保持6～10分钟(例如为8分钟)然后进行下述步骤3)；

备注说明：该步骤2)的作用是将胚胎针、冷冻腔和冷冻液吸管中的培养液全部替换成平衡液；被替换的培养液以及多余的平衡液会从冷冻腔经过冷冻液吸管流入废液腔中；

3)、将胚胎针下段开口端置入冷冻液中，往上继续拉动拉板，直至拉杆活塞与拉杆活塞上限限定环相接触为止，在壳体内外空气压差的作用下胚胎针下段开口端吸取冷冻液；冷冻液依次经过胚胎针下段、胚胎针上段、胚胎针上段顶部的网孔进入冷冻腔从而实现平衡液的被置换；保持30±3秒然后进行下述的步骤4)

备注说明：该步骤3)的作用是将胚胎针、冷冻腔和冷冻液吸管中的平衡液迅速的全部替换冷冻液；被替换的平衡液以及多余的冷冻液会从冷冻腔经过冷冻液吸管流入废液腔中；

4)、向下按动压板，压杆在压缩腔Ⅱ中向下移动，在壳体内外空气压差的作用下，壳体内的气体将位于胚胎针上段顶部内的胚胎从胚胎针中排出至载杆的胚胎载片上，之后将载杆迅速投入液氮中(迅速投入液氮中，此为常规技术)。

作为上述胚胎玻璃化冷冻器的使用方法的改进：

当在拉杆的作用下拉杆活塞被拉升至底端与平衡液刻度线平行时，从胚胎针下段开口端吸入的平衡液为200μL；

当拉杆活塞被继续拉升至与拉杆活塞上限限定环相接触时，从胚胎针下段开口端吸入的冷冻液为200μL。

本实用新型具有如下技术优势：

1、本实用新型在冷冻胚胎过程中只需在显微镜下吸放胚胎各1次，无需像现有技术需要在显微镜下吸放胚胎3次，简化了操作；

2、分别设置了大容积的压缩腔Ⅰ和小容积的压缩腔Ⅱ，大容积的压缩腔Ⅰ用于较大体积的平衡液和冷冻液的吸取，是通过抽拉拉杆实现的；小容积的压缩腔Ⅱ可以提供较为灵敏的吸放力用于体积极小的胚胎(即，含有胚胎的培养液)吸放，是通过压缩弹簧实现的；

3、冷冻液吸管下端设置有球状的冷冻腔，该形状的冷冻腔中可以容纳足够多的平衡液或冷冻液，可以将胚胎细胞胞质中的水替换成平衡液中的低温保护剂；胚胎针伸入冷冻腔的一端为网状半球形，其允许液体通过又可以将胚胎拦截在胚胎针内的处于网状半球形一端，使胚胎一直在胚胎针中，不会流入冷冻液吸管内。

4、胚胎针分为胚胎针下段与胚胎针上段，胚胎针下段与胚胎针上段呈一定角度(即，夹角为145～155°，较佳为150°)，在将胚胎置于载杆上的胚胎载片时，胚胎针下段可与显微镜载物台平行，可以清楚观察到胚胎在其中的位置。

综上所述，本实用新型大大简化了胚胎玻璃化冷冻的过程，使用时将需要玻璃化冷冻保存的胚胎(即，含胚胎的培养液)吸入胚胎针，再依次吸取平衡液和冷冻液，最后将胚胎置于载杆上并迅速投入液氮中，这个优化后的冷冻过程无需像传统冷冻过程需要重复吸放胚胎，特别是解决了胚胎放入冷冻液后会上浮难以在60秒内吸取的难题。采用本实用新型后存活率能达到98％。

附图说明

下面结合附图对本实用新型的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为本实用新型中胚胎玻璃化冷冻器的整体结构示意图；

图2为图1的剖面示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本实用新型进行进一步描述，但本实用新型的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种胚胎玻璃化冷冻器，如图1～2所示，包括壳体1、拉杆2、压杆3、拉杆活塞4、压杆活塞5、弹簧6、拉杆活塞上限限定环7、拉杆活塞下限限定环11、压杆活塞上限限定环8、弹簧固定环12、冷冻液吸管14及胚胎针10。

壳体1为圆柱形空腔(带有顶和底)，壳体1内腔的上半部设置有两个直径一大一小的平行的圆柱形空腔，大的圆柱形空腔为压缩腔Ⅰ91，小的圆柱形空腔为压缩腔Ⅱ92，压缩腔Ⅰ91的容积大于压缩腔Ⅱ92的容积，且，压缩腔Ⅰ91的横截面大于压缩腔Ⅱ92的横截面。

压缩腔Ⅰ91和压缩腔Ⅱ92被相互隔离，互不相通。壳体1内腔的下半部为废液腔93，所述压缩腔Ⅰ91和压缩腔Ⅱ92均与废液腔93相连通；废液腔93用于吸收废弃/多余的胚胎培养液、平衡液或冷冻液。

壳体1顶端设置有两个各自连通压缩腔Ⅰ91和压缩腔Ⅱ92的开口。

位于压缩腔Ⅰ91内的拉杆活塞4与压缩腔Ⅰ91的内侧壁密封的滑动相连，拉杆2的底部穿过连通压缩腔Ⅰ91的开口后与拉杆活塞4固定相连；在压缩腔Ⅰ91的上下端分别设置用于限定拉杆活塞4滑动位置的拉杆活塞上限限定环7、拉杆活塞下限限定环11。拉杆活塞上限限定环7和拉杆活塞下限限定环11将拉杆活塞4的位置限定在两者之间，具有防止拉杆活塞4脱出压缩腔Ⅰ91的作用。拉杆2顶端设置有拉板21，拉板21的尺寸大于连通压缩腔Ⅰ91的开口的尺寸，拉板21位于压缩腔Ⅰ91的上方。

位于压缩腔Ⅱ92内的压杆活塞5与压缩腔Ⅱ92的内侧壁密封的滑动相连，压杆3的底部穿过连通压缩腔Ⅱ92的开口后与压杆活塞5固定相连；在压缩腔Ⅱ92的上下端分别设置用于限定压杆活塞5滑动位置的压杆活塞上限限定环8和弹簧固定环12，在压杆活塞5和弹簧固定环12之间设置弹簧6，所述弹簧6的两端分别抵接压杆活塞5和弹簧固定环12。当压杆活塞5与压杆活塞上限限定环8相接触时，压杆活塞5恰好与弹簧6接触，但是没有对弹簧6产生压力。弹簧6的同心圆直径比压杆活塞5略小，能防止弹簧6与压缩腔Ⅱ92内壁接触。压杆活塞上限限定环8和弹簧固定环12将压杆活塞5的位置限定在两者之间，具有防止压杆活塞5脱出压缩腔Ⅱ92的作用。压杆3顶端设置有压板31，压板31的尺寸大于连通压缩腔Ⅱ92的开口的尺寸，压板31位于压缩腔Ⅱ92的上方。

设置拉板21和压板31均能方便使用操作。

壳体1侧壁上设置有连通废液腔93顶部的冷冻液吸管14；所述冷冻液吸管14下端设置有冷冻腔15，所述冷冻腔15为球状空腔。

胚胎针10包括均中空且上下相连的胚胎针上段101和胚胎针下段102，胚胎针上段101和胚胎针下段102相连通；胚胎针上段101的顶部伸入冷冻腔15内，即，胚胎针上段101的顶部位于冷冻腔15内。胚胎针10的内径(即，胚胎针上段101的内径和胚胎针下段102的内径)比早期胚胎的直径略大，从而便于胚胎顺利在该胚胎针10中的移动。

所述胚胎针上段101的顶部为网状半球形，网孔的孔径小于胚胎的直径；这样既可以拦截住胚胎，使胚胎始终位于胚胎针上段101的顶部，而不会进入冷冻腔15和冷冻液吸管14；又能确保液体(包括培养液、平衡液、冷冻液)通过该网孔进入冷冻腔15内。胚胎针下段102的下端为开口端，该开口端为圆形开口，便于胚胎的吸取。

所述胚胎针上段101与胚胎针下段102的夹角为145～155°(较佳为150°)。此角度时，在立体显微镜下，手持胚胎玻璃化冷冻器，胚胎针下段102可与显微镜载物台平行，在将胚胎置于载杆时，可观察到胚胎在胚胎针下段102中的位置，可以在胚胎刚刚到达胚胎针下段102的开口端时，再将胚胎针下段102的开口端置于载杆的胚胎载片上，从而实现将胚胎置于胚胎载片上，这样可以让胚胎载片上冷冻液的量最少。

壳体1的外表面设置有平衡液刻度线16。

本实用新型的胚胎玻璃化冷冻器属于一次性使用器具。

本实用新型的实际使用过程：

1)、先向下按动拉板21，使拉杆2在压缩腔Ⅰ91中向下移动，直至拉杆活塞4与拉杆活塞下限限定环11相接触为止；然后向下按动压板31，压杆3在压缩腔Ⅱ92中向下移动，压杆活塞5压缩弹簧6，直至弹簧6被压缩至极限为止；壳体1内的空气被压缩后通过冷冻液吸管14、再经胚胎针10排出壳体1外；

先将胚胎针下段102的开口端置入含有胚胎的培养液中；之后松开压板31，压杆3在弹簧6弹力的作用下重新复原，从而使壳体1内的压力小于环境压力；产生的吸力吸取含有胚胎的培养液，含有胚胎的培养液依次经过胚胎针下段102、胚胎针上段101，进入位于冷冻腔15内的胚胎针上段101的顶部；胚胎被截留在胚胎针上段101的顶部；培养液先通过胚胎针上段101顶部的网孔进入冷冻腔15内，再沿着冷冻液吸管14流入废液腔93内。此过程需要使用显微镜载物台观察，因为胚胎肉眼几乎不可见。

2)、将胚胎针下段102开口端置入平衡液中，向上拉动拉板21，使拉杆2在压缩腔Ⅰ91中向上移动，在壳体1内外空气压差的作用下胚胎针下段102开口端吸取平衡液，平衡液依次经过胚胎针下段102、胚胎针上段101、胚胎针上段101顶部的网孔进入冷冻腔15从而实现培养液的被置换；当于拉杆2的作用下拉杆活塞4被拉升至底端与平衡液刻度线16平行时，保持8分钟然后进行下述步骤3)。

当拉杆活塞4被拉升至底端与平衡液刻度线16平行时，从胚胎针下段102开口端吸入的平衡液的体积为200μL。吸入的平衡液的体积过大会浪费平衡液，也会让后续需要吸取的冷冻液不足200μL；过低会使吸取的平衡液不足200μL，从而影响胚胎的预平衡。

备注说明：该步骤2)的作用是将胚胎针10、冷冻腔15和冷冻液吸管14中的培养液全部替换成平衡液；被替换的培养液以及多余的平衡液会从冷冻腔15经过冷冻液吸管14流入废液腔93中。

3)、将胚胎针下段102开口端置入冷冻液中，往上继续拉动拉板21，直至拉杆活塞4与拉杆活塞上限限定环7相接触为止，在壳体1内外空气压差的作用下胚胎针下段102开口端吸取冷冻液；冷冻液依次经过胚胎针下段102、胚胎针上段101、胚胎针上段101顶部的网孔进入冷冻腔15从而实现平衡液的被置换；保持30秒然后进行下述的步骤4)。

此步骤中，从胚胎针下段102开口端吸入的冷冻液的体积为200μL。

备注说明：该步骤3)的作用是将胚胎针10、冷冻腔15和冷冻液吸管14中的平衡液迅速替换冷冻液；被替换的平衡液以及多余的冷冻液会从冷冻腔15经过冷冻液吸管14流入废液腔93中；

4)、向下按动压板31，压杆3在压缩腔Ⅱ92中向下移动，在壳体1内外空气压差的作用下，壳体1内的气体将位于胚胎针上段101顶部(此胚胎针上段101顶部位于冷冻腔15中)内的胚胎从胚胎针10中排出至载杆的胚胎载片上，之后将载杆迅速投入液氮中。此过程需要使用显微镜载物台观察，因为胚胎肉眼几乎不可见。

载杆例如可选用KITAZATO Biopharma公司生产的玻璃化冷冻载杆。载杆作为冷冻胚胎的载体，可以在载杆上标记胚胎信息，置入液氮中保存，需要复苏胚胎时，可以根据标记的信息从液氮中取出需要的冷冻胚胎进行解冻。

实际使用时，先把胚胎放入较低浓度的玻璃化溶液(平衡液)中，平衡一定时间，使平衡液中的低温保护剂渗入胞质；然后将胚胎移入较高浓度的玻璃化溶液(冷冻液)中，既可缩短平衡时间又可防止低温保护剂的化学毒性并限制其过度渗透。

采用本实用新型，胚胎的存活率能达到98％。

对比例1、仅仅取消实施例1中的位于压缩腔Ⅱ92的弹簧6的使用，其余等同于实施例1。

使用该装置进行胚胎玻璃化冷冻实验时，会导致出现吸放胚胎时，推拉压杆3产生的吸放力难以控制，不能很好的吸取和释放胚胎；还会导致将含胚胎的冷冻液置于载杆的胚胎载片上时液滴过大的不利情况；因此，使用该装置最终的胚胎存活率仅为78％。

对比例2、取消实施例1中整个压缩腔Ⅱ92，包括相应的取消以下所有部件：连通压缩腔Ⅱ92的开口、压杆3、压杆活塞5、弹簧6、压杆活塞上限限定环8和弹簧固定环12。其余等同于实施例1。

使用该装置进行胚胎玻璃化冷冻实验时，会导致出现推拉拉杆2产生的吸放力太大，可能导致胚胎损伤或丢失不利情况；因此，使用该装置最终的胚胎存活率仅为61％。

对比例3-1、将平衡液刻度线16在壳体1上的位置相对于实施例1而言向上移动，即，当拉杆活塞4被拉升至底端与平衡液刻度线16平行时，从胚胎针下段102开口端吸入的平衡液的体积由200μL改为300μL。其余等同于实施例1。

使用该装置进行胚胎玻璃化冷冻实验时，会导致出现在步骤3)中不能很好排尽平衡液，从而稀释冷冻液的不利情况；因此，使用该装置最终的胚胎存活率仅为85％。

对比例3-2、将平衡液刻度线16在壳体1上的位置相对于实施例1而言向下移动，即，当拉杆活塞4被拉升至底端与平衡液刻度线16平行时，从胚胎针下段102开口端吸入的平衡液的体积由200μL改为100μL。其余等同于实施例1。

使用该装置进行胚胎玻璃化冷冻实验时，会导致出现平衡液未填满冷冻腔15，低温保护剂不能完全渗入胚胎细胞胞质，后续放入液氮中细胞内会形成冰晶，从而造成细胞损伤的不利情况；因此，使用该装置最终的胚胎存活率仅为80％。

对比例4、将压缩腔Ⅰ91、压缩腔Ⅱ92的横截面改成大小一致，当然，压缩腔Ⅰ91的高度仍然大于压缩腔Ⅱ92，即，压缩腔Ⅰ91的容积仍然大于压缩腔Ⅱ92的容积。其余等同于实施例1。

使用该装置进行胚胎玻璃化冷冻实验时，会导致出现吸放含胚胎的培养液时敏感度下降，将胚胎置于载杆的胚胎载片上时会出现液滴的大小难以掌握的不利情况；因此，使用该装置最终的胚胎存活率仅为76％。

对比例5、将实施例1中的“冷冻液吸管14连通废液腔93的顶部”改成“冷冻液吸管14连通废液腔93的中间部位”；其余等同于实施例1。

使用该装置进行胚胎玻璃化冷冻实验时，会导致出现当废液的液面超过冷冻液吸管14连通废液腔93的位置时，废液会稀释冷冻液吸管14中甚至冷冻腔15的冷冻液的不利情况；因此，使用该装置最终的胚胎存活率仅为82％。

对比例6、仅仅取消实施例1中与冷冻液吸管14连接的冷冻腔15，其余等同于实施例1。

使用该装置进行胚胎玻璃化冷冻实验时，会导致出现低温保护剂不能很好的置换胚胎中的水分，后续放入液氮中细胞内会形成冰晶，从而造成细胞损伤的不利情况；因此，使用该装置最终的胚胎存活率仅为66％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用于说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照签署各实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前处各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离实用新型各实施例方案的范围。